基于拉曼光譜技術(shù)的冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白及其酶活性檢測(cè)

張同剛，韓斌，李靜

（泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東 泰安 271000）

肉色是影響消費(fèi)者對(duì)肉及其制品購(gòu)買欲望的首要因素之一[1-2]。動(dòng)物宰后的胴體顏色主要是由3種不同氧化形態(tài)的肌紅蛋白相對(duì)含量來決定的[3-6]。阮振甜等[7]研究秦川牛宰后肉色與其肉質(zhì)品質(zhì)的相關(guān)性，得出在胴體排酸過程中，亮度值與紅度值先上升后下降。趙莉君等[8]研究保鮮膜包裹對(duì)貯藏中冷鮮肉肉色的影響，得出保鮮膜有助于肉色的穩(wěn)定性。黃輝鳳[9]研究肉色與血紅蛋白濃度的相關(guān)性研究，探討血紅蛋白作為豬肉品質(zhì)關(guān)鍵性狀肉色穩(wěn)定性的間接性、標(biāo)志性指標(biāo)，為今后活體動(dòng)物肉色無損預(yù)測(cè)提供科學(xué)數(shù)據(jù)與技術(shù)支撐。拉曼光譜技術(shù)能體現(xiàn)分子的振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)信息，通過峰的位置、強(qiáng)度、形狀等信息[10-14]，反映被測(cè)樣品分子的官能團(tuán)或化學(xué)鍵的特征振動(dòng)頻率，提供散射分子的結(jié)構(gòu)信息，用于檢測(cè)不同狀態(tài)食品分子結(jié)構(gòu)的變化[15-22]。

本文旨在通過以冷鮮牛肉為研究對(duì)象，基于拉曼光譜技術(shù)，建立一種適用于冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量與其還原酶活性的無損、快速檢測(cè)方法，為冷鮮牛肉貯藏過程中肉色褐變速率及控制方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛背最長(zhǎng)?。簩幭柠}池縣大夏農(nóng)林牧開發(fā)有限公司；乳酸、蔗糖、高鐵氰化鉀、鹽酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic，EDTA）、還原型輔酶Ⅰ（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[Tri（hydroxymethyl）amino methane hydrochloride，Tris-HCl]緩沖液（均為分析純）：寧夏西夏生物試劑公司；馬心肌紅蛋白溶液：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器

Inspector 300拉曼光譜儀：美國(guó)賽普斯公司；HH.SY21-Ni6-C高速組織搗碎機(jī)：江蘇金壇市億通電子有限公司；UV-1200紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選取寧夏本地2歲～3歲齡的魯西黃牛作為研究對(duì)象。宰后，立刻將背最長(zhǎng)肌從修整好的胴體取下，在0℃～4℃的環(huán)境中真空包裝儲(chǔ)存；取5 mL馬心肌紅蛋白溶液，加入 50 mg K3[Fe（CN）6]反應(yīng) 15 min，然后離心10 min（3 500 g、4 ℃），上清液通過 Tris-HCl緩沖液（4℃、50 mmol/L、pH 7.0）透析除去溶液中多余的K3[Fe（CN）6]，即得到高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）溶液。

1.3.2 高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量的測(cè)定

參照Krzywicki[23]的方法，取待測(cè)樣品表面肉樣1 cm×1 cm×0.5 cm，加入25 mL濃度為0.04 mol/L，pH值為6.8的磷酸緩沖液，在（20±5）℃下均質(zhì)30 s。避光保存1 h后，離心靜置，取其上清液過濾，用分光光度計(jì)在525、545、565、572 nm處測(cè)量其吸光度。計(jì)算公式如下。

式中：P 為高鐵肌紅蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；R1、R2、R3分別為吸光度比值 A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.3 高鐵肌紅蛋白還原酶活性的測(cè)定

1.3.3.1 高鐵肌紅蛋白還原酶粗酶液提取

參照Mikkelsen等[24]的方法，取樣品表面肉樣1cm×1 cm×0.5 cm，加入20 mL 2.0 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH7.0、4℃下均質(zhì)處理1 min，在12 000 r/min下離心15 min，過濾后，加入 K3[Fe（CN）6]使其溶液濃度過飽和，發(fā)生氧化反應(yīng)，隨后用2.0 mmol/L的磷酸鹽緩沖液透析 24 h（4℃，pH 7.0）。

1.3.3.2 還原酶活性測(cè)定

參照Mikkelsen等[24]的方法，在室溫（20± 5）℃，配制pH6.4標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物，成分如表1所示，空白對(duì)照以去離子蒸餾水代替NADH，其它組分不變。

表1 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物Table 1 Standard reaction mixture

反應(yīng)自加入NADH而開始，用分光光度計(jì)在580nm波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描記錄吸光值。在580 nm波長(zhǎng)下氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，MbO2）與 MetMb的吸光值相差最大，二者的摩爾消光系數(shù)：12×103L/（mol·cm），通過比較反應(yīng)前后（在反應(yīng)線性階段）吸光值的變化，便可計(jì)算出MetMb的還原酶活性，計(jì)算公式如下。

式中：A0為提取液加入NADH時(shí)580 nm下的吸光值；A1為提取液加入NADH 1 min后580 nm下的吸光值；V1為反應(yīng)體系體積，mL；ε為摩爾消光系數(shù)，L/（cm·mol）；V2為樣品體積，mL；l為比色杯光徑，cm；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 拉曼光譜測(cè)定

取冷鮮牛肉樣品表面肉樣2 cm×2 cm×0.5 cm置于Inspector 300拉曼光譜儀鏡頭下進(jìn)行測(cè)定，激光波長(zhǎng)為785 nm，功率為10 mW，掃描范圍為400 cm-1～1 700 cm-1，聚焦深度為 200 μm。試驗(yàn)用 Savitzky-Golay平滑濾波方法進(jìn)行拉曼光譜數(shù)據(jù)曲線平滑處理，采用8點(diǎn)平滑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

光譜數(shù)據(jù)通過Unscrambler X 10.3（CAMO Software AS，OSLO，Norway）軟件處理。選取偏最小二乘回歸方法建立模型，采用校正集、交互驗(yàn)證、預(yù)測(cè)集決定系數(shù)、剩余預(yù)測(cè)偏差、均方根校正、交互驗(yàn)證、預(yù)測(cè)誤差進(jìn)行評(píng)估。模型最后采用交互驗(yàn)證進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量及其還原酶活性的測(cè)定

選取120個(gè)樣本作為試驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)選取其中的100個(gè)樣本作為試驗(yàn)的校正集，其余的20個(gè)樣本作為試驗(yàn)的預(yù)測(cè)集，并將樣本中的最大值和最小值放入試驗(yàn)校正集中，確保校正集的容括性，不同高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量及其高鐵肌紅蛋白還原酶活性見表2。

表2 高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量及其還原酶活性Table 2 The relative content of MetMb and MRA of beef meat samples

2.2 光譜數(shù)據(jù)分析

冷鮮牛肉樣品表面原始拉曼光譜掃描結(jié)果如圖1所示。

圖1 冷鮮牛肉樣本表面的原始拉曼光譜圖Fig.1 Raw Raman spectroscopy of fresh beef samples

由圖1可知，拉曼位移570 cm-1的峰歸屬于高鐵肌紅蛋白中鐵離子和氧氣間化學(xué)鍵的（Fe-O2）伸縮振動(dòng)，當(dāng)570 cm-1附近的拉曼光譜峰強(qiáng)度開始減弱時(shí)，表明高鐵肌紅蛋白中鐵離子和氧氣間化學(xué)鍵開始發(fā)生斷裂，此時(shí)高鐵肌紅蛋白的相對(duì)含量開始逐漸增加；樣品原始光譜數(shù)據(jù)中還包含了一些無關(guān)的干擾因素（暗電流、背景光等），使得拉曼光譜的曲線出現(xiàn)一定的基線漂移，本試驗(yàn)利用常見光譜數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，改善建模效果，減少干擾信息，結(jié)合偏最小二乘回歸法（partial least squares regression，PLSR）建立模型，比較分析特征波段與全波段建立模型的效果。

2.3 光譜預(yù)處理

選擇最佳的光譜預(yù)處理方法，對(duì)開始采集的原始光譜數(shù)據(jù)使用多元散射校正（multiplicative scattering correction，MSC）、歸一化（normalization，Nor）、移動(dòng)平均平滑（moving average，MA）、S-G 卷積平滑（savitzkygolay，SGS）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化（standard normalized variate，SNV）、中值濾波（median filter，MF）、一階導(dǎo)數(shù)（first derivation，1st Der）方法進(jìn)行預(yù)處理分析，選取PLSR建立冷鮮牛肉表面的MetMb相對(duì)含量與高鐵肌紅蛋白還原能力（metmyoglobin reducing activity，MRA）的預(yù)測(cè)模型，并與原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，見表3。

表3 冷鮮牛肉樣品表面MetMb相對(duì)含量與MRA的原始光譜和預(yù)處理光譜的偏最小二乘回歸模型Table 3 PLSR models for predicting the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of beef samples with raw and pre-treated spectral data

續(xù)表3 冷鮮牛肉樣品表面MetMb相對(duì)含量與MRA的原始光譜和預(yù)處理光譜的偏最小二乘回歸模型Continue table 3 PLSR models for predicting the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of beef samples with raw and pre-treated spectral data

由表3可知，MetMb經(jīng)Nor預(yù)處理后的拉曼光譜數(shù)據(jù)建立的預(yù)測(cè)模型，其R2c和R2p分別為0.825和0.914，均高于其它光譜預(yù)處理方法建立的預(yù)測(cè)模型，且RMSEc和RMSEp分別為0.805與0.723均低于其它光譜預(yù)處理模型。通常一個(gè)好的模型應(yīng)該是具有較高的R2值、較低的RMSEc和RMSEp值，且RMSEc和RMSEp差異也是越小越好。因此，選取Nor法作為MetMb的光譜預(yù)處理方法。

MRA經(jīng)SGS預(yù)處理后的拉曼光譜建立的預(yù)測(cè)模型，其R2c和R2p分別為0.782和0.917，均高于其他光譜預(yù)處理方法建立的預(yù)測(cè)模型，且RMSEc和RMSEp分別為0.799與0.827均低于其他光譜預(yù)處理模型，因此，選SGS作為MRA的光譜預(yù)處理方法。MetMb經(jīng)Nor預(yù)處理和MRA經(jīng)SGS預(yù)處理后的相對(duì)分析誤差值（relative percent deviation，RPD） 分別為 4.835與4.183，均大于2.5，表示了良好的預(yù)測(cè)能力。

2.4 特征波長(zhǎng)的提取

原始光譜數(shù)中存在216個(gè)波段，信息量大，處理時(shí)間冗長(zhǎng)，其中400 cm-1～900 cm-1光譜曲線存在較大的噪音干擾，因此選擇900 cm-1～1 700 cm-1光譜中提取特征波長(zhǎng)，使光譜信息集中在幾個(gè)特征波段內(nèi)。MetMb選擇 8 個(gè)特征波長(zhǎng)：928、989、1 040、1 107、1 230、1 412、1 473、1 556 cm-1；MRA 選擇 9 個(gè)特征波長(zhǎng)：989、1 040、1 182、1 240、1 360、1 442、1 535、1 650、1 667cm-1。冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量與高鐵肌紅蛋白還原酶活性的權(quán)重系數(shù)圖見圖2。

圖2 冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量與高鐵肌紅蛋白還原酶活性的權(quán)重系數(shù)圖Fig.2 Weight coefficient of the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of fresh beef

由圖 2（a）可知，928、989、1 040、1 107、1 230 cm-15個(gè)特征波長(zhǎng)的光譜反射值與MetMb相對(duì)含量呈負(fù)相關(guān)，而 1 412、1 473、1 556 cm-1處的光譜反射值與MetMb相對(duì)含量呈正相關(guān)；圖2（b）為冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白還原酶活性權(quán)重系數(shù)圖，其中989、1 182、1 360、1 535、1 650、1 667cm-1的光譜反射值與 MRA 呈負(fù)相關(guān)，而1 040、1 240、1 442cm-1處的光譜反射值與MRA呈正相關(guān)。由分子振動(dòng)量子理論可知，分子基團(tuán)振動(dòng)方式不同，其吸收波長(zhǎng)特征頻率不同，每種物質(zhì)分子所含基團(tuán)種類多且差異性強(qiáng)，因此具有特定的波段吸收組合。

2.5 全波段和特征波段下的PLSR模型比較

為對(duì)比全波段與特征波段下冷鮮牛肉表面MetMb相對(duì)含量與MRA模型的差異性，驗(yàn)證提取的特征波長(zhǎng)的有效性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 全波段和特征波段下的PLSR模型結(jié)果Table 4 The PLSR model results under full-wave bands and optimal wavelengths

由表4可知，MetMb相對(duì)含量特征波段下的PLSR模型的R2C為 0.827，R2P為 0.916，RPD為 4.893，特征波段校正集與驗(yàn)證集均高于全波段，且由交互驗(yàn)證的R2CV與RMSEcv值顯示模型穩(wěn)健性好；MRA特征波段下 PLSR 模型的 R2C為 0.802，R2P為 0.832，RPD 為4.115，與全波段的模型得到的決定系數(shù)差異不大，交互驗(yàn)證結(jié)果顯示預(yù)測(cè)結(jié)果與參比值的偏離值在允許范圍內(nèi)，模型預(yù)測(cè)性較好，特征波段下的PLSR模型建立僅需8個(gè)～9個(gè)波段光譜反射值，與全波段216個(gè)波段相比，極大降低了數(shù)據(jù)冗余量與處理時(shí)間，為實(shí)現(xiàn)在線快速檢測(cè)提供技術(shù)條件。通過上述分析，特征波段可以替代全波段光譜數(shù)據(jù)來建立預(yù)測(cè)模型。

3 結(jié)論

本文利用拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立了冷鮮牛肉表面MetMb相對(duì)含量與MRA的PLSR預(yù)測(cè)模型。選擇900 cm-1～1 700 cm-1波段，進(jìn)行原始光譜與不同光譜預(yù)處理方法比較，得出MetMb經(jīng)Nor預(yù)處理與MRA經(jīng)SGS處理后能取得較好的校正模型與預(yù)測(cè)模型。利用PLSR結(jié)合加權(quán)β系數(shù)選擇特征波段，MetMb 相對(duì)含量的特征波段為 928、989、1 040、1 107、1 230、1 412、1 473、1 556 cm-1；MRA 的特征波段為989、1 040、1 182、1 240、1 360、1 442、1 535、1 650、1 667 cm-1，特征波段提取與分子基團(tuán)光譜吸收峰值具有一定相關(guān)性。利用特征波段建立的PLSR模型，R2MetMb=0.916，RMSEpMetMb=0.827，RPDMetMb=4.893；R2MRA=0.832，RMSEpMRA=0.905，RPDMRA=4.115，可以替代全波段建立的PLSR模型，表明拉曼光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，預(yù)測(cè)冷鮮牛肉表面高鐵肌紅蛋白含量與高鐵肌紅蛋白還原酶活性是可行的。