HPLC法測定核桃仁不同品種、不同部位中的鞣花酸含量

楊婷婷，顧豐穎，劉昊，邵之曉，張巧真，王鋒

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

近年來，越來越多的研究證明核桃可以改善多種慢性疾病[1]，如動(dòng)脈硬化、糖尿病、心血管疾病等[2-4]，并對(duì)炎癥、癌癥、記憶力等產(chǎn)生有益的影響[5]，這些功能活性主要與其不飽和脂肪酸和生物活性物質(zhì)，如酚類、生育酚、甾醇等有關(guān)[6-7]。在堅(jiān)果中，核桃酚酸組成最多樣[8]，總酚含量顯著高于我們飲食中常見的其它堅(jiān)果（杏仁、夏威夷果、花生等）[9-10]。核桃的總酚含量在1 558mg/100 g～1 625 mg/100 g[11]，其中主要是鞣花單寧（ellagic tannins，ETs）[12]，屬于可水解單寧[13-15]，在酸性條件下水解釋放鞣花酸，部分鞣花酸以游離態(tài)的形式存在。ETs和鞣花酸由于具有較高的抗氧化活性[16]，攝入ETs含量較高的食物，對(duì)預(yù)防心血管疾病和癌癥等有益[17-18]，因此準(zhǔn)確定量鞣花酸對(duì)評(píng)價(jià)核桃營養(yǎng)品質(zhì)具有重要意義。目前常使用的方法有紫外分光光度法[19]、高效毛細(xì)管電泳法[20]等，由于核桃多酚成分復(fù)雜且同分異構(gòu)體較多，常規(guī)方法對(duì)鞣花酸定量不準(zhǔn)確[12]。本試驗(yàn)使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)比分析核桃仁不同品種、不同部位的鞣花酸含量，期望為核桃種植、加工、消費(fèi)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

溫185、新2核桃：新疆阿克蘇木本糧油林場；古縣綿核桃、遼河1號(hào)核桃：古縣古樹有限公司；所有樣品均帶殼真空包裝于4℃冷藏保存6個(gè)月測定。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

1260 II HPLC系統(tǒng)、紫外檢測器：美國安捷倫公司；Synergi Hydro-RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；CK2000球磨儀：北京托摩根生物科技有限公司；HT 16MM臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；2X-2真空泵：南京真空泵廠；ME104E電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；KQ-600DE型高頻率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；WT-12A型氮吹儀：杭州米歐儀器有限公司；MS-70型水分快速測定儀：廣州艾安得儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；DHG-9203A型烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE100型鋼磨：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2.2 主要試劑

鞣花酸（≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純）：北京阿拉丁生物科技有限公司；丙酮（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；本試驗(yàn)所有用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液制備

種皮及脫皮仁制備：參考周曄[21]的方法加以改進(jìn)，將手工脫殼后的核桃仁使用雙層紗布扎口后吊入液氮中，30 s后取出，在空氣中放置至核桃仁表面白霜消失，溫度恢復(fù)至室溫（25℃左右）人工剝掉種皮，收集種皮和脫皮仁。

脫脂樣品制備：將所有樣品使用鋼磨打碎，每次10 s，重復(fù)2次，中間翻拌一次。稱取一定量粉碎后樣品參考毛曉英[22]的方法得到脫脂粉，為了樣品更加均勻使用球磨儀研磨30 s后取出，備用。

樣品溶液制備：準(zhǔn)確稱取0.100 g脫脂核桃粉于15 mL離心管中，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的丙酮溶液，輕輕振蕩使其混合均勻，240 W超聲5 min后，4 000 r/min離心5 min，緩慢倒出上清液，該提取步驟重復(fù)2次，合并上清液并氮吹至溶液體積小于1 mL，超純水定容至10 mL棕色容量瓶中，即為鞣花酸提取液，每種樣品設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精確稱取5.0 mg鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕色容量瓶中，鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液使用色譜級(jí)甲醇定容，得到100 μg/mL鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.3 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成 5、10、20、30、40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使用HPLC測定。以鞣花酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Synergi Hydro-RP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；1260 II HPLC 系統(tǒng)配備四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器；紫外檢測波長254 nm；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈；進(jìn)樣量 10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：35℃。流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 The elution gradient of the mobile phase of HPLC

1.3.5 鞣花酸含量測定

所有樣品提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜分析。各樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鞣花酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行顯著差異分析（Duncan），顯著差異水平取p＜0.05，Excel繪圖。數(shù)據(jù)為3次測定的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

綜合考慮分離度、峰型，確定最佳色譜條件為進(jìn)樣量 10 μL，流速1 mL/min，柱溫 35℃，檢測波長 254 nm，該色譜條件下，鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of ellagic acid standard

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將鞣花酸的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.4的方法測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（C），以峰面積為縱坐標(biāo)（S），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為S=41.006C-207.83，R2=0.995 7，線性范圍 5 μg/mL～40 μg/mL。

2.3 精密度

使用20 μg/mL鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到鞣花酸的含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表2。

表2 鞣花酸精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of ellagic precision detection（n=6）

由表2可知，鞣花酸含量的RSD為1.14%，小于5%，可見此方法精密度良好，滿足分析要求。

2.4 重復(fù)性

分別準(zhǔn)確稱量核桃仁脫脂粉5份，按照多酚提取方法制得鞣花酸提取液，分別進(jìn)樣計(jì)算鞣花酸含量，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of repeatability test（n=6）

從表3可以看出，核桃整仁鞣花酸含量RSD小于5%，表明該測定方法重復(fù)性良好。

2.5 加標(biāo)回收率

鞣花酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 4 Results of recovery tests（n=3）

由表4可知，回收率在94.15%～105.97%，RSD＜5%，表示該方法準(zhǔn)確可靠，可以用于鞣花酸的檢測。

2.6 樣品測定

2.6.1 核桃仁鞣花酸含量

使用1.3.4的色譜條件測定4種核桃品種核桃仁中鞣花酸含量，色譜圖及鞣花酸含量見圖2、圖3。

圖2 溫185核桃仁鞣花酸樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of ellagic acid samples from walnuts at Wen 185

圖3 不同品種核桃仁中鞣花酸含量Fig.3 Content of ellagic acid in different varieties of walnut kernel

由圖2可以看出，在本試驗(yàn)的HPLC洗脫梯度條件下，鞣花酸對(duì)照品色譜峰出峰完全且峰形規(guī)范，樣品鞣花酸色譜峰分離度良好，基線平穩(wěn)，無其他雜峰干擾，滿足了定性和定量的要求。

由圖3可知，山西古縣遼河1號(hào)、古縣綿核桃仁鞣花酸含量是（99.26±1.06）、（90.53±4.31）mg/100 g，新疆地區(qū)溫185、新2核桃整仁鞣花酸含量分別是（51.39±1.72）、（76.46±7.55）mg/100 g。遼河 1號(hào)核桃仁鞣花酸含量分別是新2和溫185核桃仁鞣花酸含量的1.30、1.93倍，與新疆主栽品種相比，遼河1號(hào)核桃仁在鞣花酸含量上具有明顯優(yōu)勢。

2.6.2 核桃仁、種皮、脫皮仁中鞣花酸含量

使用1.3.4的方法測定我國主栽品種之一新疆溫185核桃仁、種皮和脫皮仁中鞣花酸含量，結(jié)果如表5所示。

表5 新疆溫185核桃仁、種皮、脫皮仁中鞣花酸含量Table 5 The contents of ellagic acid in kernel，pellicle and kernel without pellicle

從表5可以看出，核桃種皮中鞣花酸含量最高，其含量高達(dá)到（585.93±31.50）mg/100 g，是核桃仁中鞣花酸的11.4倍，脫皮仁中鞣花酸的28.6倍。從質(zhì)量上來看，種皮質(zhì)量約占核桃仁的5%～6%，核桃仁中約60%鞣花酸來源于種皮，40%來源于脫皮仁。

3 討論

3.1 鞣花酸HPLC定量方法

目前關(guān)于核桃鞣花酸的定量相關(guān)研究中，使用HPLC法較多[23]，但由于核桃多酚成分復(fù)雜，色譜峰分離程度不高，定量不準(zhǔn)確等情況，本試驗(yàn)依次考察色譜柱、流動(dòng)相、洗脫梯度對(duì)色譜峰的影響，最終使得在本試驗(yàn)HPLC條件下，核桃多酚中的鞣花酸單體得到良好的分離效果，色譜峰基線平穩(wěn)（圖2），實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確的定量。

3.2 不同品種、不同部位對(duì)核桃鞣花酸含量的影響

本試驗(yàn)測定樣品結(jié)果與Li等[24]的核桃仁游離型鞣花酸含量為25 mg/100 g～32 mg/100 g結(jié)果存在一定差異，可能與使用的核桃品種、提取溶劑和測定條件有關(guān)。與新疆主栽品種相比，古縣核桃外殼硬度大，縫合線緊密，核桃仁中多酚類物質(zhì)在采收后得到較好的保留，而新疆主栽品種溫185和新2核桃殼薄、縫合線不緊密，核桃仁多酚類物質(zhì)容易被水分、溫度、光照等因素影響，造成多酚氧化、降解[25]，也有研究表明這主要與核桃品種、核桃栽培區(qū)域、采收及貯藏條件有直接關(guān)系[26]。與新疆主栽品種相比，山西古縣地區(qū)地方性品種在鞣花酸含量上具有明顯優(yōu)勢，可在核桃營養(yǎng)產(chǎn)品開發(fā)上引起更多關(guān)注，核桃不同部位之間鞣花酸的含量差異表明，核桃仁整仁食用營養(yǎng)價(jià)值更高。

鞣花酸作為核桃多酚中最重要的一種多酚類物質(zhì)，其在核桃中的多種存在形態(tài)隨著核桃的生長、加工以及貯藏發(fā)生著變化，核桃中鞣花酸含量的準(zhǔn)確定量，對(duì)其形態(tài)轉(zhuǎn)化及自身穩(wěn)定性的研究有著重大的意義。

4 結(jié)論

本研究建立了HPLC法測定核桃仁中鞣花酸含量，并對(duì)山西古縣產(chǎn)區(qū)核桃及新疆兩個(gè)主栽核桃品種的核桃仁中鞣花酸含量以及鞣花酸在核桃仁不同部位的分布進(jìn)行了測定，其中遼河1號(hào)核桃仁鞣花酸含量達(dá)到（99.26±1.06）mg/100g，分別是新2和新疆溫185品種鞣花酸含量的1.30、1.93倍，與新疆主栽品種相比，古縣核桃在鞣花酸含量上具有明顯優(yōu)勢；核桃種皮中鞣花酸含量最高，達(dá)（585.93±31.50）mg/100 g，脫皮仁中鞣花酸含量較少，僅為（20.52±0.38）mg/100 g，遠(yuǎn)低于種皮中鞣花酸含量。本研究通過對(duì)色譜條件的考察，建立HPLC法測定核桃仁中鞣花酸的含量，靈敏度高，適用范圍廣泛，將為核桃仁中鞣花酸后續(xù)研究提供參考。