葡萄糖修飾苦杏仁粕谷蛋白糖基化反應條件的優(yōu)化

張玥，李芳，李菊梅，徐昕，孔令明*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆輕工職業(yè)技術學院，新疆 烏魯木齊 830021）

苦杏仁是一種優(yōu)良的藥食兩用資源，營養(yǎng)價值和經(jīng)濟利用價值豐富。我國苦杏仁產(chǎn)量豐富，年產(chǎn)量約為2萬噸～3萬噸，但是未充分發(fā)揮苦杏仁加工增值率優(yōu)勢。當前，我國杏仁產(chǎn)業(yè)大都以原料形式賣出，部分產(chǎn)品處于初加工，苦杏仁制油過程中產(chǎn)生的約50%的副產(chǎn)物杏仁粕未得到充分利用，造成了一定程度的浪費[1]?？嘈尤势芍泻?5%左右的蛋白質(zhì)，氨基酸種類齊全、易于人體消化吸收，可作為一種食用價值較高的植物蛋白資源[2]。目前，杏仁蛋白的研究主要集中在分離蛋白提取方法及功能特性的研究和杏仁蛋白酶解制備多肽工藝及酶解產(chǎn)物分離、純化、藥理藥效方面。李大文[2]考察了超聲波輔助鹽溶法、微波輔助鹽溶法和堿溶法對苦杏仁分離蛋白提取和功能特性的影響，結果表明，3種提取工藝各有優(yōu)劣，就提取率的大小而言，堿溶法＞超聲波輔助法＞微波輔助法，但物理輔助法提取時間短，提取效率高，且中性介質(zhì)對蛋白質(zhì)破壞小。解春艷等[3]對苦杏仁蛋白組成及蛋白的加工特性進行了研究，并對可溶性蛋白的提取條件進行了優(yōu)化，得到杏仁蛋白的最佳提取工藝條件下，蛋白提取量最高可達43.79 mg/g。薛蕾[4]釆用風味蛋白酶與堿性蛋白酶對苦杏仁蛋白進行雙酶組合水解，確定了最佳酶解工藝條件，并對酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性進行了測定。勞斐[5]利用杏仁粕中的蛋白質(zhì)資源，采用酶解法制備出高活性的降血壓肽。

杏仁蛋白具有優(yōu)良的品質(zhì)和風味，可廣泛應用于食品工業(yè)中。天然的苦杏仁蛋白由于自身結構的局限，在某些功能性方面無法達到工業(yè)生產(chǎn)要求，開發(fā)利用程度較低，采用蛋白質(zhì)修飾性改性技術對其功能特性的各個影響因素進行調(diào)節(jié)，使其具有良好的加工特性，獲得功能性加強的產(chǎn)品，對擴大苦杏仁蛋白的應用領域、增強利用效果具有重要的現(xiàn)實意義。研究表明，苦杏仁蛋白在pH 4.0附近溶解度最小為12.79%；溫度達到55℃時溶解度最大為65.2%[4]。蛋白質(zhì)溶解性的大小在實際應用中非常重要，蛋白質(zhì)的一些功能性質(zhì)，如乳化、起泡、增稠等特性均與之相關。糖基化反應是將糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)以共價鍵連接，使得改性后的蛋白具備蛋白分子及糖分子的特性。經(jīng)研究，對大豆蛋白[6-7]、花生蛋白[8]、肌原纖維蛋白[9]、玉米醇溶蛋白[10]、酪蛋白[11]等進行糖基化改性可有效改善蛋白質(zhì)功能特性和營養(yǎng)性。

本試驗將榨油后的餅粕進一步加以利用，以苦杏仁粕谷蛋白為原料，采用糖基化改性的方法對苦杏仁粕谷蛋白進行一定的改性處理，針對蛋白在食品加工中溶解性的功能特性需要，考察反應溫度、反應時間、pH值、蛋白與糖質(zhì)量比等不同因素對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響，確定高溶解性葡萄糖改性蛋白最優(yōu)制備條件，為后續(xù)苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價復合物的理化性質(zhì)提供基礎，以期提高苦杏仁蛋白的綜合開發(fā)利用率，為苦杏仁精深加工、資源的循環(huán)利用提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁粕谷蛋白（bitter apricot kernel meal gluten，AKG）：新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院農(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用研究室自制；大豆油：新疆友好集團股份有限公司。

葡萄糖、NaOH、HCl（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）（分析純）：上海高鳴化工有限公司；考馬斯亮藍G-250（分析純）、20%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sul fate，SDS）溶劑（生化試劑）：北京索來寶科技有限公司；2-巰基乙醇（生化試劑）：北京津同樂泰化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 儀器與設備

Testo205便攜式數(shù)顯pH計：德圖儀表（深圳）有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；TDL-5-A低速離心機：上海安亭科學儀器廠；TU-1810PC紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；ALPHA 1-2型真空冷凍干燥機：德國Marin Christ公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價復合物的制備

準確稱取一定量AKG置于去離子水中，配制蛋白質(zhì)量分數(shù)為1%，室溫25℃下攪拌1 h，用1 mol/L HCl或NaOH調(diào)節(jié)至不同pH值，加入一定量的葡萄糖，于不同反應溫度下恒溫反應一段時間，反應過程中不斷攪拌，反應結束后冰浴冷卻至室溫25℃，4 500 r/min離心15 min除去不溶物，上清液透析24 h，冷凍干燥后制得苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價復合物，即葡萄糖改性蛋白（glucose modified protein，GMP）[12]。

1.3.2 溶解度的測定

根據(jù)HORAX法[13]稍作改動。配制1%的AKG、GMP，室溫 25℃下磁力攪拌 20 min～30 min，4500 r/min離心15 min，留取上清液；取空試管，加入上清液和考馬斯G-250，混勻；放置10 min，在波長595 nm處測量。對照組加入去離子水和考馬斯G-250。溶解度為上清液中蛋白質(zhì)含量（m1）與樣品中蛋白質(zhì)含量（m0）的比值，其計算公式如下。

式中：m0為樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/g；m1為上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 不同反應溫度對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分數(shù)1%，在反應時間2 h、pH 9.0、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2的條件下，選擇反應溫度30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，進行單因素試驗，考察不同反應溫度對GMP溶解度的影響。

1.3.3.2 不同反應時間對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分數(shù)1%，在反應溫度90℃、pH 9.0、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2的條件下，選擇反應時間0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，進行單因素試驗，考察不同反應時間對GMP溶解度的影響。

1.3.3.3 不同pH值對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分數(shù)1%，在反應溫度90℃、反應時間2 h、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2的條件下，選擇pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，進行單因素試驗，考察 pH值對GMP溶解度的影響。

1.3.3.4 不同蛋白與糖質(zhì)量比對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

固定蛋白質(zhì)量分數(shù)1%，在反應溫度90℃、反應時間2 h、pH 9.0的條件下，選擇蛋白與糖質(zhì)量比為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，進行單因素試驗，考察不同蛋白與糖質(zhì)量比對GMP溶解度的影響。

1.3.4 接枝度測定

參考管軍軍[14]OPA試劑改進法測定接枝度（degree of grafting，DG）。接枝度計算公式如下。

式中：A0為接枝反應前溶液吸光度；A1為接枝反應后溶液吸光度。

1.3.5 褐變程度的測定

用0.1%SDS溶液作為溶劑，稀釋樣液，磁力攪拌20 min，在波長420 nm下測定吸光度A420[15]；以0.1%SDS溶液做空白對照組。

1.4 響應面分析試驗的建立

響應面試驗因素與水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro軟件進行制圖及Design Expert軟件和Box-Behnken試驗方法設計響應面優(yōu)化分析。利用SPSS 21.0軟件進行顯著性分析。每個樣品處理均作3個平行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 不同反應溫度對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同反應溫度對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響見圖1。

圖1 反應溫度對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the solubility of GMP

如圖1所示，隨著溫度的升高，產(chǎn)物的溶解度呈先升高后降低的趨勢，GMP的溶解度在60℃時達到最大值為88.77%。這表明溶液中蛋白質(zhì)在熱處理作用下，蛋白分子發(fā)生伸展，構象發(fā)生輕微改變，引入糖鏈，糖基化反應速度加快，產(chǎn)物溶解性增大。有研究表明，適度的熱處理可提高蛋白的溶解度，有利于蛋白質(zhì)和水分子的相互作用，對苦杏仁粕谷蛋白的溶解性起到促進作用[16]。溫度過高部分蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水基團暴露，粒子重新聚集，使得蛋白結合水的能力降低，導致溶解度下降[17]。因此，選擇溫度50、60、70℃進行響應面優(yōu)化分析。

2.1.2 不同反應時間對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同反應時間對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響結果見圖2。

圖2 反應時間對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of reaction time on the solubility of GMP

由圖2可知，GMP的溶解度在糖基化反應0.5 h時有最高值為91.15%。此后溶解度隨著反應時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。反應時間過長，使原本斷裂的肽鍵重新聚合，蛋白的疏水基團增多，美拉德反應逐漸進入高級階段，形成了不溶于水的大分子聚合物，導致產(chǎn)物溶解度下降，這與王魯慧等[18]研究結果一致。另外，延長時間并不能提高葡萄糖改性蛋白的溶解度，也表明糖基化中的化學反應均處于變化初期。因此，選擇反應時間為0、0.5、1.0 h進行響應面優(yōu)化分析。

2.1.3 不同pH值對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同pH值對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響結果見圖3。

圖3 pH值對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.3 Effect of pH on the solubility of GMP

由圖3可知，隨著pH值的增大，葡萄糖改性蛋白的溶解度呈現(xiàn)先上升趨勢，pH值為6.0～10.0時，溶解度顯著上升（P＜0.05），pH 值在 10.0～11.0 趨于平緩，差異不顯著（P＞0.05）。一方面與蛋白質(zhì)自身性相關[19]，蛋白質(zhì)偏離等電點的酸性或堿性條件下，體系中電荷的增加，有利于蛋白分子與水分子間作用，溶解性呈現(xiàn)逐漸增大趨勢[20]；另一方面這是由于pH值的增大，引入了更多的糖鏈，可溶性蛋白隨著反應進程更易與葡萄糖共價結合，從而使得親水性基團不斷增加[6]。因此選擇pH值9.0、10.0、11.0進行響應面優(yōu)化分析。

2.1.4 不同蛋白與糖質(zhì)量比對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響

不同蛋白與糖質(zhì)量比對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響結果見圖4。

圖4 蛋白與糖質(zhì)量比對葡萄糖改性蛋白溶解度的影響Fig.4 Effect of protein-sugar mass ratio on solubility of GMP

由圖4可知，蛋白與糖質(zhì)量比為1∶2時，GMP的溶解度最高為89.79%，此后溶解度隨著糖添加比例的改變呈現(xiàn)出小幅度下降，這可能是因為蛋白添加量變小，而糖化劑添加量較多，使得溶液有一定黏度，具有稠厚感，不利于糖基化反應的發(fā)生，從而導致溶解度的下降[21]。這與王祺[22]的研究結果一致。TANG等[23]對豌豆球蛋白改性研究也表明不同蛋白與糖質(zhì)量比及反應時間會不同程度地影響改性后蛋白溶解性。因此選擇蛋白與糖質(zhì)量比為 1∶1、1∶2、1∶3 進行響應面優(yōu)化分析。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗模型建立

響應面結果見表2，回歸方程方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Design of response surface test scheme and results

表3 響應面回歸方程方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of response surface regression equation

回歸方程為Y=94.33+8.22A+3.16B+9.41C+3.32D+2.76AB+3.47AC+5.11AD+2.49BC+3.19BD+0.2875CD-12.29A2-5.37B2-13.37C2-9.50D2。

由表 3 可知，該模型 P＜0.000 1，R2=0.971 5，說明該模型具有高度的顯著性，方程的可行性較好，失擬項不顯著（P=0.1523），說明了回歸模型和實際試驗擬合充分，具備可行性且精確度高，可以用該模型對葡萄糖改性蛋白的制備進行分析預測。反應溫度、反應時間、pH值、蛋白與糖質(zhì)量比4個因素對響應值的影響顯著性可用F值來評價，由表3可知，各因素對葡萄糖改性蛋白的溶解度影響順序為pH值＞反應溫度＞蛋白與糖質(zhì)量比＞反應時間，pH值、反應溫度、反應時間、蛋白與糖質(zhì)量比對葡萄糖改性蛋白的溶解度影響為極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化

影響葡萄糖改性蛋白溶解度的各個因素之間的交互作用圖見圖5～圖8。

圖5 反應溫度和反應時間對溶解度影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the effect of reaction temperature and reaction time on solubility

圖6 反應溫度和pH值對溶解度影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots of the effect of reaction temperature and pH on solubility

圖7 反應時間和pH值對溶解度影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots of the effect of reaction time and pH on solubility

圖8 反應時間和蛋白與糖質(zhì)量比對溶解度影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots of the effect of reaction time and protein-sugar mass ratio on solubility

結合表3和圖5可知，在響應組合試驗中，一次項A（反應溫度）、B（反應時間）和二次項 A2、B2差異為極顯著（P＜0.01），對GMP的溶解度的影響大。A（反應溫度）的曲面的彎曲程度較B（反應時間）高。二維等高線的橢圓狀不明顯，交互項AB（反應溫度-反應時間）不顯著（P＞0.05）。

結合表3和圖6可知，一次項A（反應溫度）和C（pH值）的響應面坡度較陡，差異極顯著（P＜0.01）。AC（反應溫度-pH值）影響因素差異顯著（P＜0.05），因素之間交互作用顯著，交互作用對溶解度影響較大。

結合表3和圖7分析可知，一次項C（pH值）和二次項C2曲面效應極顯著（P＜0.01），交互項BC（反應時間-pH值）不顯著（P＞0.05），且等高線的形狀趨近圓形，對糖基化改性蛋白溶解度影響不大。

結合表3和圖8分析可知，一次項D（蛋白與糖質(zhì)量比）和二次項D2因素差異為極顯著（P＜0.01），交互項BD（反應時間-蛋白與糖質(zhì)量比）不顯著（P＞0.05）。各因素對GMP溶解度的影響不是一個簡單的線性關系。響應面坡度越陡，響應值對各因素變化越強。反之坡度越平緩，影響越小。

2.2.3 最佳條件的確定及驗證試驗

該模型得到最優(yōu)工藝為反應溫度63.21℃、反應時間0.61 h、pH 9.39、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2。在此條件下葡萄糖修飾苦杏仁粕谷蛋白制備葡萄糖改性蛋白的溶解度為98.69%?？紤]到實際操作，將實際試驗條件調(diào)整為反應溫度63℃、反應時間0.6 h、pH 9.40，蛋白與糖質(zhì)量比1∶2、進行3次重復試驗，取平均值得到溶解度為96.24%，與模型相符，則模型可以較好地預測葡萄糖改性蛋白的制備。

2.3 接枝度與褐變度的測定

接枝度與褐變度的測定結果見表4。

表4 葡萄糖改性蛋白的接枝度與褐變度Table 4 Grafting degree and browning degree of GMP

糖基化反應是碳水化合物以共價鍵與蛋白質(zhì)分子上的游離氨基連接而形成糖蛋白的化學反應，又稱美拉德反應。接枝度是通過自由氨基的含量來表現(xiàn)美拉德反應程度。由表4可知，在最優(yōu)工藝下GMP的接枝度為33.03%。美拉德反應會有褐色產(chǎn)物產(chǎn)生，褐變度是通過呈色物質(zhì)吸光度的變化來表現(xiàn)美拉德反應的高級產(chǎn)物的形成程度。GMP的褐變度為0.235。反應結果與張玥等[24]研究結果相似，說明糖基化反應較為充分。

3 結論

本研究以苦杏仁粕谷蛋白為原料，采用糖基化方法對影響蛋白質(zhì)溶解特性的各個因素進行調(diào)節(jié)，以期提高其在溶液中的分散性，增強蛋白質(zhì)與水的相互作用，使其具有良好的加工特性，從而能夠廣泛應用于食品體系。試驗分析了不同因素對苦杏仁粕谷蛋白-葡萄糖共價復合物溶解度的影響。優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為反應溫度63℃、反應時間0.6 h、pH 9.4、蛋白與糖質(zhì)量比1∶2。在此條件下，GMP溶解度為96.24%。最優(yōu)糖基化改性產(chǎn)物的制備條件為后續(xù)苦杏仁粕谷蛋白理化特性和功能活性的研究提供了基礎。