PCDH15突變導(dǎo)致遺傳性耳聾的研究進(jìn)展

施韜關(guān)靜王秋菊*

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）

2中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

人體許多細(xì)胞可感受機(jī)械性刺激并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。這種功能的實(shí)現(xiàn)取決于機(jī)械門(mén)控通道，它對(duì)人的聽(tīng)覺(jué)、保持平衡，感知環(huán)境危機(jī)等極其重要。比如耳蝸毛細(xì)胞的靜纖毛受到剪切力的刺激時(shí)會(huì)發(fā)生彎曲，進(jìn)而打開(kāi)相關(guān)離子通道，產(chǎn)生短暫的感受器電位，并隨著聽(tīng)神經(jīng)向中樞傳遞[1,2]。在耳蝸毛細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)機(jī)制中，靜纖毛間的頂連接張力的改變可以改變機(jī)械門(mén)控通道打開(kāi)的概率和程度[3]。

PCDH15編碼的原鈣粘蛋白15（protocadherin 15,PCDH15）是頂連接的組成部分，PCDH15是鈣依賴性細(xì)胞間粘附分子，在高級(jí)脊椎動(dòng)物中，原鈣粘蛋白與神經(jīng)回路形成和突觸形成等多種功能有關(guān)[4]。PCDH15變異將會(huì)導(dǎo)致Usher綜合征1F型（USH1F）和常染色體隱性遺傳性耳聾23型（DF‐NB23）。USH1是一種以進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）和先天性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失為特征的常染色體隱性疾病[5,6]，伴有先天性前庭功能障礙，運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、難以保持平衡[7,8]。DFNB23患者僅表現(xiàn)為先天性雙耳重-極重度耳聾[4,9]。本文旨在將PCDH15突變導(dǎo)致的DFNB23和USH1F研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，分析臨床表現(xiàn)與基因型的關(guān)聯(lián)以及它的致聾機(jī)制。

1 PCDH15的克隆、定位與表達(dá)

1997年，Wayne等發(fā)現(xiàn)Usher綜合征新的基因座——USH1F，并將其定位于染色體10q21-22，標(biāo)記D10S199-D10S596之間[10]。2001年，Alagramam等在Ames waltzer小鼠中發(fā)現(xiàn)Pcdh15突變，該基因突變導(dǎo)致小鼠靜纖毛在出生后第10天出現(xiàn)異常以及內(nèi)耳神經(jīng)上皮細(xì)胞變性，最終出現(xiàn)耳聾及前庭功能障礙的表型[11]。Alagramam等使用小鼠Pcdh15 cDNA探針篩選人類基因組P1人工染色體文庫(kù)，鑒定出三個(gè)人類同源基因PCDH15的克隆，并定位于染色體10q11.2-q21[5,11]。人和小鼠在10號(hào)染色體之間有高度的保守一致性，Pcdh15和PCDH15在胞外重復(fù)（extracellular cadherin,EC）結(jié)構(gòu)域中的核苷酸水平上同源性近似85%，氨基酸序列的同源性近似94%[12]。2001年，Ahmed將導(dǎo)致USH1F的PCDH15定位于染色體10q21.1[13]。

Ahmed等通過(guò)Western blot揭示了Pcdh15蛋白在小鼠視網(wǎng)膜、耳蝸毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞的表達(dá)，并且在不同的耳蝸毛細(xì)胞之間，以及同一毛細(xì)胞上不同長(zhǎng)度的靜纖毛中，Pcdh15蛋白的免疫反應(yīng)的表達(dá)量是不同的[4]。對(duì)貓頭鷹、小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)pcdh15在感光細(xì)胞中起重要作用[14,15]。Ahmed等發(fā)現(xiàn)在人眼的感光細(xì)胞中存在PCDH15蛋白，這表明USH1F患者可能在色覺(jué)方面存在重大缺陷，并且可能出現(xiàn)中心視力不適，夜盲癥和進(jìn)行性周圍性視覺(jué)喪失等視覺(jué)障礙[4]。

2 PCDH15蛋白的結(jié)構(gòu)與功能域

PCDH15基因位于10q21.1，含39個(gè)外顯子，其編碼的PCDH15蛋白屬于鈣粘蛋白的一個(gè)亞家族，包含11個(gè)EC結(jié)構(gòu)域，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[2,7,16]。與經(jīng)典鈣粘蛋白不同的是，原鈣粘蛋白的每一個(gè)EC結(jié)構(gòu)域均由一個(gè)或多個(gè)外顯子編碼而成[9]。鈣粘蛋白 23（cadherin-like 23,CDH23）和PCDH15分別形成同源二聚體，組成頂連接的上和下部，并通過(guò)N末端發(fā)生反式相互作用，該作用是Ca2+依賴性的。近期有研究提出了PCDH15與CDH23反式和順式同源二聚體模型，并預(yù)測(cè)PCDH15具有剛性或柔性機(jī)械門(mén)控的特征[17]。

PCDH15最初鑒定出最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本有33個(gè)外顯子，編碼包含1955個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，隨后，Ahmed等鑒定出6個(gè)額外的外顯子[7,13,18]。根據(jù)轉(zhuǎn)錄剪接的不同，PCDH15蛋白具有3種細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的同工型蛋白[3,7]。這些同工型在毛細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的時(shí)間和位置均不同，說(shuō)明它們?cè)谄渲械淖饔檬遣煌腫9]。在小鼠不成熟的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞中，3種Pcdh15同工型可以互相轉(zhuǎn)換，以形成頂連接，但在小鼠成熟的聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞中，Pcdh15-CD2是必不可少的[3]。

3 PCDH15突變與遺傳性耳聾

PCDH15保守序列發(fā)生錯(cuò)義突變時(shí)，可能改變蛋白EC結(jié)構(gòu)域的空間形態(tài)，擾亂PCDH15和CDH23之間的相互作用，從而破壞頂連接的完整性，靜纖毛之間的相互作用減弱，機(jī)械門(mén)控通道出現(xiàn)異常，導(dǎo)致耳聾的發(fā)生[4,19]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)DFNB23報(bào)道僅局限于少量家族報(bào)道（表1）。PCDH15基因的錯(cuò)義編碼，影響耳蝸靜纖毛間頂連接的正常功能，但PCDH15蛋白在前庭、眼部等處并未喪失全部功能，最終導(dǎo)致患者僅出現(xiàn)耳聾表型。2003年，Ahmed等首次報(bào)道在兩個(gè)DFNB23家系中發(fā)現(xiàn)PCDH15的兩種致病突變[4]。

表1 DFNB23家系中PCDH15突變Table 1 PCDH15 mutation in DFNB23 families

Usher綜合征根據(jù)聽(tīng)力損失的發(fā)病年齡和嚴(yán)重程度，以及前庭功能是否異常，在臨床上分為三個(gè)亞型，Usher綜合征I型（USH1）是最嚴(yán)重的一種亞型，USH1型患者多是雙耳先天性平坦型極重度聽(tīng)力損失、先天性前庭障礙以及進(jìn)行性RP。USH1是一種基因異質(zhì)性遺傳疾病，至少11個(gè)基因位點(diǎn)與USH1有關(guān)，目前已經(jīng)確定9個(gè)基因在染色體上的位置，其中PCDH15基因突變導(dǎo)致的USH1F是Usher綜合征I型中第三常見(jiàn)的原因，在白種人當(dāng)中約為9%-11%[4,21]。

自2001年P(guān)CDH15基因被克隆以來(lái)，已有許多研究在USH1F家系中，鑒定出PCDH15的突變位點(diǎn)（表2）。不同家系的臨床表型具有相似性，包括先天性雙耳對(duì)稱性感音神經(jīng)性聾，先天性前庭功能障礙，運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、難以保持平衡。Ahmed等研究發(fā)現(xiàn)，USH1F患者獨(dú)立行走的年紀(jì)大多在12-15個(gè)月，甚至更晚[7,16]。也有研究報(bào)道，患兒36個(gè)月時(shí)才能獨(dú)立行走[8]。

表2 USH1F中的PCDH15突變Table 2 PCDH15 mutation in USH1F families

RP將會(huì)在患者青春期前發(fā)病，RP典型的檢查結(jié)果是，眼底血管減弱，視神經(jīng)頂端呈現(xiàn)蠟狀蒼白，存在骨針狀沉淀物，黃斑部也可能受累[25]，確診RP的主要方法是眼底鏡檢查與視網(wǎng)膜電圖。RP是進(jìn)行性的，在視覺(jué)系統(tǒng)上，視桿細(xì)胞最先受到損傷，患者10歲左右將會(huì)出現(xiàn)夜盲和隧道視覺(jué)等RP早期癥狀，可能逐漸出現(xiàn)視椎細(xì)胞損傷，視野進(jìn)行性向心性縮小，視覺(jué)的對(duì)比敏感度、色覺(jué)、移動(dòng)性等功能都將會(huì)受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致完全失明[26]。在多項(xiàng)研究中，USH1F患者RP確診年齡大多在10歲之前，也有患者在22歲時(shí)才出現(xiàn)RP的報(bào)道，目前報(bào)道的最小的確診年齡為2歲[8,25]。除視網(wǎng)膜變性之外，白內(nèi)障也是常見(jiàn)的特征[27]。所以在USH1F患者眼部表型存在比較大的個(gè)體差異。

由于RP多數(shù)表現(xiàn)為遲發(fā)性，所以僅根據(jù)臨床表型判斷，極有可能將USH1患者診斷為非綜合征性耳聾。隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷革新，通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)疾病早期診斷，可為患者提供了許多即時(shí)和長(zhǎng)期的幫助[28]。2014年，Yoshimura等在日本，首次運(yùn)用大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing,MPS）對(duì)17例USH1進(jìn)行檢測(cè)，在16例（94.1%）患者中檢測(cè)到至少攜帶一個(gè)致病性突變[23]。2016年，Yoshimura對(duì)227例極重度患兒進(jìn)行MPS，發(fā)現(xiàn)USH1在被診斷為非綜合征性耳聾的兒童中的頻率為1.3-2.2%[28]。與Sanger測(cè)序相比，MPS能夠以相對(duì)低的成本和較快的速度對(duì)整個(gè)基因組或目標(biāo)外顯子組的數(shù)百萬(wàn)個(gè)小片段進(jìn)行測(cè)序[29,30]，因此可以快速識(shí)別許多致病基因的突變，同時(shí)保持成本效益的最大化。此外，對(duì)大量基因的同時(shí)測(cè)序分析有助于發(fā)現(xiàn)具有遺傳修飾作用或雙基因遺傳的變異。

Usher綜合征在不同種族中常見(jiàn)的致病基因并不相同，在美國(guó)和英國(guó)白種人群中，MYO7A為最常見(jiàn)的致病基因[31,32]，在德系猶太人中PCDH15是最常見(jiàn)的致病基因，PCDH15基因的突變位點(diǎn)c.733C>T（p.R245X，NM_033056.4）在該人群中存在始祖效應(yīng)，該突變位點(diǎn)占據(jù)的比例為50%-60%，p.R245X在德系猶太人中的攜帶率為0.79%-2.48%[6,22]。也有研究稱該突變位點(diǎn)并不局限于德系猶太人，在其他人群中也十分常見(jiàn)[33]。

盡早得到分子診斷對(duì)于Usher綜合征來(lái)說(shuō)十分重要，通過(guò)適當(dāng)?shù)母深A(yù)可以延緩視力的減退，例如堅(jiān)持良好的飲食和生活方式，使用遮陽(yáng)鏡保護(hù)眼睛，減少紫外線的傷害[34]。在Vonam等的研究中，運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)，Usher綜合征患者的早期診斷年齡通常會(huì)早于患者出現(xiàn)視力損失的發(fā)病年齡[34]。早期發(fā)現(xiàn)進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性，在植入人工耳蝸后，兒童可以通過(guò)視力閱讀唇語(yǔ)，配合聽(tīng)覺(jué)康復(fù)來(lái)獲得更好地言語(yǔ)發(fā)展。因此早期發(fā)現(xiàn)，并在嚴(yán)重失明之前進(jìn)行眼部手術(shù)，對(duì)于患兒溝通能力發(fā)展至關(guān)重要[6,7]。

4 PCHD15基因的特殊突變類型

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，許多特殊的遺傳變異類型也能夠被人們發(fā)現(xiàn)。技術(shù)的不斷發(fā)展，可以幫助人們豐富對(duì)疾病基因型和表型關(guān)聯(lián)的認(rèn)識(shí)。PCDH15基因突變大多是截短突變，該突變破壞基因和蛋白質(zhì)功能[33]。由于PCDH15存在許多的同工型，不同的同工型在功能上可以互補(bǔ)，第33號(hào)外顯子主要編碼胞體結(jié)構(gòu)域部分，所以有部分發(fā)生在第33外顯子的截短突變大多沒(méi)有致病性[33]。

2007年，Le Guedard等首次報(bào)道了31例USH1F患者中發(fā)現(xiàn)3例患者的PCDH15基因突變存在大片段缺失[8]。PCDH15基因存在大片段重復(fù)或者缺失突變的可能性，由于PCDH15基因跨度將近1Mb，開(kāi)放閱讀框?yàn)?021bp，前三個(gè)外顯子覆蓋0.42Mb，5’端編碼的外顯子比例較低，因此極有可能形成許多不同斷點(diǎn)的大片段缺失[8]。Vache等在一名法國(guó)病人上發(fā)現(xiàn)了PCDH15中外顯子18-26的雜合缺失，并通過(guò)RNA-assay和DNA長(zhǎng)閱讀測(cè)序，在PCDH15內(nèi)含子序列里發(fā)現(xiàn)一段4.6Mb的臂內(nèi)倒位，最終導(dǎo)致USH1[35]。

CDH23和PCDH15基因編碼的蛋白均屬于鈣粘蛋白超家族，它們是耳蝸靜纖毛頂連接的重要組成部分，兩者在基因致病突變導(dǎo)致的功能損失和組織學(xué)變化具有相似性。2005年，Zheng等發(fā)現(xiàn)CDH23和PCDH15基因的突變可以相互作用，出現(xiàn)雙基因雜合突變，導(dǎo)致聽(tīng)力損失。他們構(gòu)建了Cdh23和Pcdh15雜合突變的C57BL/6J小鼠，發(fā)現(xiàn)雙基因突變小鼠存在更明顯的聽(tīng)力損失。另外在三個(gè)無(wú)關(guān)家族中發(fā)現(xiàn)CDH23和PCDH15雙基因突變導(dǎo)致USH1綜合征的遺傳證據(jù)[36]。除此之外還有許多USH1候選基因中雙基因突變的報(bào)道，雙基因突變患者RP起病年齡更早，表明Usher綜合征相關(guān)基因之間可能存在修飾作用[23]。

5 小結(jié)與展望

PCDH15突變引起DFNB23型和USH1F型遺傳性耳聾，均會(huì)導(dǎo)致先天性雙耳重-極重度耳聾，除此之外，USH1F患者將出現(xiàn)前庭功能障礙以及視網(wǎng)膜色素變性。PCDH15突變?cè)诘孪氮q太人群中存在始祖效應(yīng)，在中國(guó)人群中的發(fā)病率尚待進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)研究。對(duì)于伴有運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩或/和夜盲的遺傳性耳聾中，要考慮到PCDH15致病的可能性。PCDH15蛋白存在特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并且含有眾多同工型，導(dǎo)致PCHD15基因可能存在許多截短突變和拷貝數(shù)變異。PCDH15存在雙基因遺傳以及修飾基因的遺傳模式，在檢測(cè)時(shí)還需額外關(guān)注其他USH1候選基因，這些基因編碼的蛋白與PCDH15蛋白有著密切的聯(lián)系。早期分子診斷有助于疾病的干預(yù)和預(yù)防，對(duì)于患兒未來(lái)的言語(yǔ)發(fā)展來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。在未來(lái)，運(yùn)用NGS對(duì)遺傳性耳聾患者進(jìn)行突變篩選，不僅可以快速識(shí)別致病基因，達(dá)到早期診斷、精準(zhǔn)治療的目的，同時(shí)還能保持較好的成本效益，有助于遺傳咨詢、臨床指導(dǎo)。并且有助于發(fā)現(xiàn)修飾基因或雙基因遺傳。

除遺傳性耳聾之外，噪聲性耳聾的病因十分復(fù)雜，由遺傳因素和環(huán)境因素混雜共同作用導(dǎo)致的，有研究表明，在波蘭、瑞士、中國(guó)人群中，PCDH15基因rs11004085位點(diǎn)的多態(tài)性可能是噪聲性聾易感的原因之一[37-39]，并且PCDH15基因多態(tài)位點(diǎn)之間的相互作用可能對(duì)噪聲性聾易感性有重要影響[40]。因此，提示人們需要考慮到PCDH15基因?qū)儆谠肼曇赘谢颉?/p>