丁苯酞聯(lián)合TLR4抗體鼓室給藥小鼠梅尼埃病模型的實(shí)驗(yàn)研究

張靜婧李姝睿王瓊劉乃嘉文新

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（蘭州 730000）

梅尼埃病（Meniere’s Disease,MD），由法國(guó)醫(yī)生Prosper Meniere于1861年首次提出并命名。是一種特發(fā)性內(nèi)耳疾病。臨床表現(xiàn)為發(fā)作性眩暈、波動(dòng)性聽(tīng)力下降、耳鳴和/或耳脹滿感[1]。2020年AAO-HNS學(xué)會(huì)報(bào)道MD患病率為（50-200）/10萬(wàn)，常見(jiàn)于40-60歲[2-4]。病理特征為內(nèi)淋巴積水（en‐dolymphatic hydrops,ELH）。病因迄今不明，目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制主要有內(nèi)淋巴管機(jī)械阻塞與內(nèi)淋巴吸收障礙學(xué)說(shuō)、免疫反應(yīng)學(xué)說(shuō)、內(nèi)耳缺血學(xué)說(shuō)等[5]。1938年，Hallpike和Cairns[6]首次描述MD患者迷路的典型組織病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)ELH與MD有關(guān)，通過(guò)兩例病理切片資料證實(shí)球囊和蝸管擴(kuò)大，前庭和前庭階的外淋巴間隙消失。此后關(guān)于ELH在MD中的重要性逐漸被眾多研究者所證實(shí)。有學(xué)者認(rèn)為MD是免疫相關(guān)性內(nèi)耳疾?。╝utoimmune inner ear disease,AIED），這其中涉及多個(gè)基因，如群體凝血因子C同源物、水通道蛋白、離子通道蛋白、人類(lèi)白細(xì)胞抗原等。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳并非免疫“豁免"器官，它具有免疫防御系統(tǒng)的解剖學(xué)組成和細(xì)胞免疫與體液免疫的特性[7-9]。國(guó)內(nèi)外先后報(bào)道，在AIED中檢測(cè)出不同的非內(nèi)耳組織特異性抗原[10-17]，主要有：熱休克蛋白，Raf-I蛋白，Po蛋白，D肌動(dòng)蛋白等，而對(duì)熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)的研究尤其成為焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)表明，Toll樣受體4（TLR4）可能介導(dǎo) Hsp70的信號(hào)傳導(dǎo)，Hsp70是TLR4的內(nèi)源性配體[18]。本研究擬建立一種內(nèi)淋巴積水小鼠模型，經(jīng)鼓室注射TLR4受體阻斷劑（TLR4抗體）低、中、高劑量，并聯(lián)合丁苯酞不同濃度灌胃給藥，探討TLR4抗體、Hsp70與梅尼埃病的關(guān)系，闡明TLR4/Hsp70在MD病因?qū)W的地位和重要性，進(jìn)一步探討其可能的發(fā)病機(jī)制，為MD的臨床治療和預(yù)防提供新的治療策略。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取耳廓反應(yīng)正常的SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠50只，體質(zhì)量16-20g。購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。根據(jù)Konishi創(chuàng)立的后顱窩硬膜外入路內(nèi)淋巴囊阻塞術(shù)[19]，制備內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型。隨機(jī)分為對(duì)照組10只、模型組10只和實(shí)驗(yàn)組（A組10只，B組10只，C組10只）。分籠后作適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑

TLR4抗體(PE anti-human Toll-like receptor 4)購(gòu)自美國(guó)eB ioscience公司,Hsp70蛋白購(gòu)自晶美公司,鼠抗Hsp70 mAb氟氏完全佐劑（CFA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。TNF-αELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色系列購(gòu)自北京中山公司。丁苯酞（tylphthalide，NBP),由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20100041，丁苯酞含量98.6%（HPLC法），使用前以0.5%聚山梨酯80為乳化劑配置成乳劑。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)耳膜迷路積水模型制備

小鼠40只，以鹽酸氯胺酮10mg/kg大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射，1%戊巴比妥鈉30mg/kg背部皮下注射，全麻后，術(shù)野脫毛，1%普魯卡因2ml切口處注射，安爾碘消毒，動(dòng)物仰臥位，術(shù)耳選右側(cè)，枕頸部旁正中切口，經(jīng)后顱窩硬膜外徑路暴露枕骨橫嵴、枕骨上嵴和枕骨髁三個(gè)標(biāo)志，將三者圍成區(qū)域的枕骨骨質(zhì)磨薄，可見(jiàn)暗紅色乙狀竇，繼續(xù)磨薄顳骨外側(cè)緣，推乙狀竇至中線，暴露其后下方內(nèi)淋巴囊和前庭導(dǎo)水管所在的龕，用金光鉆磨除內(nèi)淋巴囊所在位置，用骨蠟填塞，縫合傷口。術(shù)后第3周起予腹腔注射醛固酮（0.1mg/0.1kg.d），連續(xù) 5d，3周后誘導(dǎo)出膜迷路積水（MD）小鼠模型。

1.3.2 造模結(jié)果

對(duì)照組耳蝸前庭膜與基底膜約呈45°角(圖1A)；模型組耳蝸病理改變主要為耳蝸各回產(chǎn)生不同程度內(nèi)淋巴積水(圖1B)；造模3周后前庭膜向前庭階輕微膨隆(圖1C)；造模6周后前庭膜明顯膨隆(圖1D)。造模成功。

圖1 A：造模前，正常小鼠耳蝸（4×10）；B：造模后，內(nèi)淋巴積水小鼠耳蝸（4×10）；C：造模后3周，耳蝸前庭膜輕度腫脹；D：造模后6周，前庭膜明顯腫脹。Fig.1 A:Before modeling,normal mouse cochlea(4×10);B:After modeling,cochlea of mice with endolymphatic hydro‐cephalus(4×10);C:Vestibular membrane was slightly swollen 3w after modeling;D:Vestibular membrane was significantly expanded 6w after modeling.

1.3.3 內(nèi)耳石蠟切片制作

將小鼠麻醉后快速斷頭，取出聽(tīng)泡，充分暴露鼓室內(nèi)壁，經(jīng)40mg/L多聚甲醛固定在4℃冰箱中24小時(shí)以上，5%三氯醋酸脫鈣，梯度脫水，浸蠟，包埋，切片，常規(guī)HE染色。

1.3.4 動(dòng)物分組

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、模型組10只和實(shí)驗(yàn)組（A組10只，B組10只，C組10只）。對(duì)照組：不予任何處理；模型組：予內(nèi)耳膜迷路積水造模；實(shí)驗(yàn)組在模型組基礎(chǔ)上2天后：A組予以鼓室注射TLR4抗體50μg+丁苯酞25mg/kg灌胃干預(yù)；B組予以鼓室注射TLR4抗體100μg+丁苯酞100mg/kg灌胃干預(yù)；C組予以鼓室注射TLR4抗體200μg+丁苯酞100mg/kg灌胃干預(yù)。1次/周，連續(xù)4周。

1.3.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.5.1 行為學(xué)觀察

觀察模型組及實(shí)驗(yàn)組小鼠在藥物干預(yù)前后有無(wú)逃跑反應(yīng)，及活動(dòng)過(guò)程中有無(wú)步態(tài)不穩(wěn)、頭左右晃動(dòng)等行為。

1.3.5.2 耳蝸電圖測(cè)試

檢測(cè)設(shè)備為美國(guó)Bio-logic公司聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀，對(duì)模型組、實(shí)驗(yàn)組藥物干預(yù)前、4周后、對(duì)照組小鼠均行耳蝸電圖測(cè)試。全麻狀態(tài)后耳鏡檢查并清潔雙側(cè)外耳道，在安靜屏蔽室（噪聲小于20dB‐SPL)，記錄電極置于給聲側(cè)鼓膜表面，接地電極置于顱頂，參考電極置于對(duì)側(cè)耳后乳突。電極電阻10kΩ，click刺激聲，持續(xù)時(shí)間0.1ms，刺激強(qiáng)度為90dB nHL,每條曲線疊加1000次。記錄動(dòng)作電位（AP）、和電位（SP）及耳蝸微音電位（CM）的振幅，計(jì)算SP/AP比值。SP、AP振幅測(cè)量方法：從起始基線開(kāi)始，出現(xiàn)的第一個(gè)正波振幅最大值為SP，第二個(gè)正波振幅最大值為AP，以μv為單位分別進(jìn)行測(cè)量，-SP/AP≥0.4判為ECoG陽(yáng)性。

1.3.5.3 耳蝸Hsp70表達(dá)

分別隨機(jī)選取各組小鼠10耳，耳蝸切片作免疫組化染色,經(jīng)0.3ml/L Methanol-H2O2（甲醇-過(guò)氧化氫）液處理，山羊血清封閉；加一抗（鼠抗HSP70 mAb 1:100）37°孵育1h，用普通小鼠IgG(1：100)取代一抗作陰性對(duì)照；滴加二抗（生物素化羊抗小鼠IgG即用型）在37℃反應(yīng)，待30min，加二氨基聯(lián)苯胺（DAB)顯色，常規(guī)脫水、中性樹(shù)膠封片，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)染色為棕黃色為陽(yáng)性。在上述各組的切片中,每耳分別隨機(jī)抽出1張近中軸的切片,做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.每張切片計(jì)數(shù)300個(gè)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和血管紋細(xì)胞,依照陽(yáng)性細(xì)胞百分比判斷,陽(yáng)性<10%(-)、陽(yáng)性率 10%～25%(+)、陽(yáng)性率 26%～50%(++)、陽(yáng)性率>50%(+++)。

1.3.5.4 采用免疫印跡方法檢測(cè)

MD小鼠模型組及實(shí)驗(yàn)組藥物干預(yù)前后血清中Hsp70水平；用ELISA試劑盒及酶標(biāo)儀，檢測(cè)內(nèi)耳TNF-α和IL-6炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

1.3.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)輸入SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,所有分組均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性分析,多個(gè)樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析,均數(shù)兩兩比較用Student-New-Keuls-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為改變結(jié)果（表1）

表1 三組小鼠行為改變對(duì)比Table 1 Comparison of behavioral changes of Mice in three Groups（n=30）

模型組小鼠誘發(fā)了外周前庭癥狀，表現(xiàn)為明顯逃跑反應(yīng)，步態(tài)不穩(wěn)及頭部頻繁失衡晃動(dòng)，符合MD動(dòng)物造模改變；對(duì)照組無(wú)明顯行為學(xué)變化；實(shí)驗(yàn)組3個(gè)亞組比較可見(jiàn)，經(jīng)給予TLR4鼓室注射及丁苯酞灌胃干預(yù)后，3組小鼠的外周前庭反應(yīng)都較前減輕，且隨鼓室給藥劑量及丁苯酞藥物濃度提升，前庭反應(yīng)緩解程度增強(qiáng)。

2.2 耳蝸電圖(ECochG)結(jié)果

2.2.1 AP反應(yīng)閾

對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組全部小鼠的非手術(shù)耳，其AP反應(yīng)閾均為20dB SPL。模型組中，10只小鼠聽(tīng)閾值升高，其中7只為50dB,2只為60dB，1只達(dá)65dB；實(shí)驗(yàn)組中，8只小鼠聽(tīng)閾值較模型組降低，其中6只為30dB，2只40dB，1只25dB。

2.2.2 SP及AP振幅

模型組SP振幅明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組4周后SP振幅較模型組下降，SP/AP比值也較模型組下降。模型組、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,而模型組與實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。3組 SP/AP比值分別為0.0665±0.04，0.4169±0.13,0.3271±0.12,耳蝸電圖波形(圖2A、B、C)?？梢?jiàn)內(nèi)淋巴積水小鼠模型，SP/AP>0.4；隨TLR4抗體聯(lián)合丁苯酞干預(yù)4周后，內(nèi)淋巴水腫及耳蝸毛細(xì)胞變性減輕，SP/AP比值回落。

圖2 A：對(duì)照組；B：模型組；C：實(shí)驗(yàn)組(4周后)。Fig.2 A:Control Group;B:Model Group;C:Test Group(after 4w).

2.3 小鼠耳蝸Hsp70表達(dá)（表2）

模型組耳蝸螺旋韌帶和血管紋呈棕黃色強(qiáng)陽(yáng)性染色,對(duì)照組呈弱陽(yáng)性染色,兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)，實(shí)驗(yàn)組呈較強(qiáng)陽(yáng)性染色,與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)（圖3 A、B）。通過(guò)三組切片染色對(duì)比，可見(jiàn)Hsp70樣蛋白主要分布在耳蝸細(xì)胞核及胞漿，模型組呈免疫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組呈免疫弱陽(yáng)性表達(dá)，表明TLR4/Hsp70信號(hào)傳導(dǎo)通路在小鼠內(nèi)淋巴積水模型中發(fā)揮調(diào)控作用；經(jīng)鼓室注射TLR4抗體后的實(shí)驗(yàn)組，Hsp70的表達(dá)減弱，呈較強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，提示Toll樣受體4（TLR4）抗體參與下調(diào)Hsp70在梅尼埃小鼠模型中的表達(dá)。

圖3 A：模型組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，染色較強(qiáng)；B：實(shí)驗(yàn)組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量隨脫髓鞘改變而減少，呈強(qiáng)染色（HE染色×200）。Fig.3 A:The number of spiral ganglion cells in the model group increased significantly,showing stronger staining;B:The number of helical ganglion cells in the cochlea of the ex‐perimental group decreased with demyelination changes,showing strong staining（HE staining×200）.

表2 各組耳蝸hsp70樣蛋白表達(dá)情況Table 2 Expression of Hsp70-like protein in cochlea of each group(n=30)

2.4 血清中Hsp70水平

用酶聯(lián)免疫印跡法檢測(cè)小鼠血清Hsp70水平，ELISA試劑盒及酶標(biāo)儀檢測(cè)小鼠內(nèi)耳TNF-α和IL-6炎性因子水平(表3)。模型組小鼠血清中Hsp70、TNF-α及IL-6濃度增加,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組中三者表達(dá)水平較模型組降低,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。且隨鼓室給藥劑量及丁苯酞藥物濃度提升，小鼠血清Hsp70、TNF-α及IL-6表達(dá)水平逐漸下降。與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明TLR4抗體阻斷Hsp70在小鼠內(nèi)耳的傳導(dǎo)通路，當(dāng)TLR4抗體鼓室注射濃度為200μg，聯(lián)合丁苯酞100mg/kg灌胃給藥時(shí)，對(duì)血清Hsp70表達(dá)及減輕炎性因子表達(dá)的干預(yù)作用最大。

表3 小鼠血清中Hsp70、TNF-α和IL-6的表達(dá)Table 3 Expressions of Hsp70,TNF-α and IL-6 in serum of mice(n=30,±s)

表3 小鼠血清中Hsp70、TNF-α和IL-6的表達(dá)Table 3 Expressions of Hsp70,TNF-α and IL-6 in serum of mice(n=30,±s)

Group Case images/BZ_24_1226_2673_1278_2745.pngimages/BZ_24_1703_2673_1755_2745.pngTest After(4w)14.28±2.61 8.11±1.72 6.28±1.43 Model Control GroupA10 GroupB10 GroupC10 10 10 Hsp70(ng/ml)Before 16.98±0.78 17.31±0.60 17.01±0.52 17.39±0.66 4.21±0.22 TNF-α(pg/ml)Before 812±12 822±13 830+17 828±20 112±11 After(4w)312±17 201±18 178±17 IL-6(pg/ml)Before 411.4±19.0 392.3±18.1 400.2±15.6 410.4±20.1 106.2±17.3 After(4w)335.4±26.4 236.5±21.4 153.6±21.3

3 討論

Toll樣受體（TLR）是識(shí)別病原微生物的關(guān)鍵跨膜蛋白[20]，與相應(yīng)配體結(jié)合后通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)引起細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)[21]。TLR4是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)Toll相關(guān)蛋白，能識(shí)別受損傷細(xì)胞或壞死細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)源性信號(hào)，Hsp70就是其中一類(lèi)重要的危險(xiǎn)信號(hào)[22]。有研究表明，TLR4識(shí)別、介導(dǎo)Hsp70的信號(hào)傳導(dǎo)，參與炎癥，腫瘤，自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制，使轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活化，啟動(dòng)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，表達(dá)炎性細(xì)胞因子TNF-α等，介導(dǎo)炎性反應(yīng)[23]。

熱休克蛋白(Hsp)是生物進(jìn)化最保守的伴隨細(xì)胞蛋白,具有多種生物學(xué)活性,參與抗原提呈加工,協(xié)同免疫及自身免疫,與許多自身免疫病發(fā)病有關(guān)。作為其成員之一的Hsp70,在生物細(xì)胞中含量最高,誘導(dǎo)性最強(qiáng),作為“分子伴侶”參與其他蛋白質(zhì)的合成與成熟。正常耳蝸組織中，Hsp70主要位于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、血管紋、螺旋緣、Corti器的支持細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、外毛細(xì)胞中[24]。

鼓室注藥理論基礎(chǔ)是藥物經(jīng)滲透、擴(kuò)散作用穿過(guò)圓窗膜進(jìn)入外淋巴，并保持較高藥物濃度。從1956年Schuknecht首次介紹鼓室內(nèi)注入鏈霉素控制梅尼埃病眩暈癥狀以來(lái)，鼓室灌注治療以糖皮質(zhì)激素藥物為主。并已證明其為治療內(nèi)耳疾病安全有效的方法。但鼓室注射抗體卻鮮有報(bào)道。

本研究建立一種內(nèi)淋巴積水小鼠模型，針對(duì)TLR4的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特點(diǎn)，采用鼓室注射低、中、高三種劑量TLR4抗體，觀察其在胞內(nèi)區(qū)與TLR4結(jié)合后，小鼠前庭反應(yīng)明顯減輕，在造模成功4周后，SP/AP值>0.4,同時(shí)AP閾值升高，提示可作為早期MD內(nèi)淋巴積水的一個(gè)敏感指標(biāo)。耳蝸切片HE免疫組化染色中，對(duì)照組Hsp70在內(nèi)耳呈低水平表達(dá)，模型組表達(dá)呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì)，可能因?yàn)樵炷?nèi)淋巴積水小鼠后，使其產(chǎn)生針對(duì)膜迷路的體液和（或）細(xì)胞免疫反應(yīng)，當(dāng)該反應(yīng)發(fā)展到一定強(qiáng)度，聽(tīng)功能下降，同時(shí)選擇性激活細(xì)胞內(nèi)的熱休克基因，啟動(dòng)Hsp70大量合成。實(shí)驗(yàn)組中，施加干擾因素TLR4抗體后，內(nèi)耳Hsp70蛋白表達(dá)降低，TNF-α及IL-6的濃度下降，可能是TLR4抗體與TLR4結(jié)合后，抑制了HSP70的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制此傳導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄因子活化，導(dǎo)致相關(guān)炎性因子濃度下降。丁苯酞是當(dāng)歸苯酞類(lèi)成分之一，目前主要用于治療缺血性腦卒中[25]。從藥理作用分析，它可改善微循環(huán)障礙，對(duì)內(nèi)耳的前庭康復(fù)起到協(xié)同治療，增強(qiáng)療效作用。故本實(shí)驗(yàn)予小鼠聯(lián)合丁苯酞灌胃干預(yù)，可觀察到隨TLR4抗體及丁苯酞濃度劑量增加，血清Hsp70及炎性因子水平下降。且增加TLR4鼓室注射濃度至200μg時(shí)，干預(yù)作用最大。實(shí)驗(yàn)證明TLR4／Hsp70通路在MD中發(fā)揮重要作用，可能與其發(fā)病機(jī)制相關(guān)。從而為研發(fā)新的受體阻斷劑，從病因控制梅尼埃病提供新的思考。