大蒜素對肺腺癌細胞侵襲生物學行為影響的初步研究

宋圓紅，黃 玲，顧俊菁

大蒜素對肺腺癌細胞侵襲生物學行為影響的初步研究

宋圓紅，*黃 玲，顧俊菁

（井岡山大學附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000）

通過MTT法、細胞粘附試驗、Transwell細胞遷移和侵襲試驗檢測不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞的活性、粘附、遷移與侵襲能力的變化；(RT-qPCR) 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應檢測不同濃度的大蒜素對TIMP/MMP平衡的影響。本研究中發(fā)現(xiàn)大蒜素可呈劑量依賴性抑制肺腺癌細胞的活性、粘附、遷移和侵襲能力。大蒜素主要降低基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA水平，同時對于組織金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)和組織金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）的mRNA水平則相反地呈劑量依賴性增加。因此我們得出結論，大蒜素可能通過抑制TIMP/MMP平衡，從而抑制肺腺癌細胞的侵襲。大蒜素可作為肺腺癌治療的潛在抗侵襲劑。

大蒜素； MMP-2；MMP-9；TIMP-1；TIMP-2；肺腺癌；侵襲

肺癌是發(fā)達國家和發(fā)展中國家癌癥相關死亡的主要原因，而肺腺癌是肺癌最常見的組織學類型，約50%的肺癌為腺癌[1]。雖然手術、放療、化療等方面的管理和治療有所改善，但其療效不佳，其中最主要原因之一是缺乏對肺腺癌侵襲浸潤的治療策略[2-3]。因此，開發(fā)新的專門針對侵襲性進展的輔助治療策略的研究至關重要。

侵襲發(fā)生是一個復雜的病理生理過程，涉及多個基因的改變[4-5]，基質金屬蛋白酶(MMPs)，特別是MMP-2和MMP-9在癌變過程中起著非常重要的作用。在許多惡性腫瘤的侵襲過程是通過降解基底膜和細胞外基質實現(xiàn)的[6-8]。以往的研究表明MMP-2和MMP-9與肺癌的侵襲轉移密切相關[4-5]。許多研究表明金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)可以調節(jié)MMPs的表達[6-9]。MMPs和TIMPs的平衡變化影響基質蛋白的重塑、形成和降解，誘導癌細胞的侵襲。

大蒜素，別名蒜素、蒜辣素，為三硫代烯丙醚類化合物，存在于百合科植物大蒜的鱗莖中[10]，有刺激性氣味，并容易分解。大蒜素是大蒜的主要活性成分，具有多種抗腫瘤活性，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種治療作用。已有研究表明，大蒜素能誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞周期、調節(jié)血管生成[11-14]。大蒜素的生物活性與多種機制有關，包括未折疊蛋白反應、p53介導的自噬、p38絲裂原活化蛋白激酶/caspase-3信號轉導等[11-15]。而大蒜素在抑制肺腺癌侵襲中的作用報道較少。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

脂質體2000試劑和胎牛血清(FBS)是從Invitrogen Thermo Fisher科學公司購買。大蒜素是從圣克魯斯生物技術公司購買。MTT從碧瑤生物技術研究所購買?？?MMP-2、抗-MMP-9、抗-TIMP-1、抗-TIMP-2和抗β-actin是從圣克魯斯生物技術公司購買。辣根過氧化物酶(HRP)-結合山羊抗兔(目錄號ZDR-5307，1：2000稀釋)和抗小鼠免疫球蛋白（目錄號ZDR-5307，1：2000稀釋)，從北京中山金橋生物技術有限公司獲得。Transwell小室孔徑8um。Matrigel(重建基底膜；BD生物科學)。

1.2 細胞株與細胞培養(yǎng)

兩株肺腺癌細胞系A 549和H 1299是從中國科學院(上海)典型培養(yǎng)集細胞庫購買的。在37?C環(huán)境的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中加入10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，及含5%CO2的加濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 MTT法

接種細胞到96孔板上，每孔104個細胞，在37?C下孵育過夜，然后在不同濃度的大蒜素(0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μM）中孵育24 h。細胞培養(yǎng)中加入0.5 mg/mL MTT溶液，在37?C孵育4 h后，加入二甲亞砜（0.5 mg/mL）終止反應，最后分光度法測量吸光度570 nm。

1.3.2 細胞粘附試驗

A549和H1299細胞，用不同濃度的大蒜素（0、5.0、7.5、10.0 μM）在37?C孵育48 h。在涂有5 mg/mL纖維連接蛋白，并用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉4 h制備96孔板。在37?C下，1 h后將未附著的細胞用PBS洗掉，留下可附著在纖維連接蛋白涂層中的細胞，MTT法對附著的細胞測定貼壁細胞數(shù)。

1.3.3 Transwell細胞侵襲檢測

采用6.5 mm Transwell小室（8 μm孔徑）進行，過濾器是預先涂覆有1-2 mg/mL的Matrigel重建基底膜。細胞分別用0、5.0、7.5、10.0 μM不同濃度的大蒜素預處理。在100 μL無血清培養(yǎng)基上接種活細胞，將含有10%FBS的培養(yǎng)基添加到下腔作為趨化劑，在37 ?C孵化24 h后，用棉簽擦去上部的細胞，遷移到下室的細胞用甲醇固定，采用蘇木精和伊紅染色，并在光學顯微鏡下(放大倍數(shù)，x 200)隨機對5個視野進行計數(shù)。

1.3.4 Transwell細胞遷移檢測

細胞遷移試驗如同細胞侵襲試驗進行，但孵育時間較短，為12 h，并且沒有包被Matrigel的基質膠涂層，并隨機在5個視野中計數(shù)。

1.3.5 (RT-qPCR) 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應

從H 1299細胞中提取總RNA，用TRIzol在不同濃度的大蒜素（0、5.0、7.5、10.0 μM），cDNA合成RT-qPCR。人MMP-2的引物(前向，5‘-GGT TGT CTG AAG TCA CTG CAC AGT-3’和反向，5‘-CTC GGT agg GAC GATG CTA) GT AGA G-3‘，MMP-9(前向，5’-GCT GGG CTT AGA TCA TTC CTC A-3‘和反向，5’-CTG GCG CAA AAG A-3‘)，TIMP-1(前向，5’-gag AAC TGG CCC-3‘和反向，5’-TAT CAG CCA CAG CAA-3‘) CAG-3‘，TIMP-2(前向，5’-CCA CCC AGA GCC TG-3‘和反向，5’-CAG CGC GTG ATC TTG CAC-3‘)和GAPDH(前向，5’-CCT CCC GCT TCG CTC TCT-3‘和反向，5’-CTG GCG ACG CAAG A-3‘) 采用RT-qPCR方法。

1.4 統(tǒng)計學分析

每個實驗至少重復3次，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件和t檢驗進行統(tǒng)計分析。< 0.05則表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果與分析

2.1 MTT法檢測不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞A 549和H 1299細胞活性的影響研究

首先用細胞活力法檢測大蒜素對A549和H1299肺腺癌細胞的細胞活性，大蒜素濃度有0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 μM，如圖1所示，A 549和H 1299細胞經15 μM和20.0 μM大蒜素處理后，細胞活性明顯降低（＜0.05）。但是，當大蒜素濃度低于15 μM時，肺腺癌細胞的活性沒有明顯下降。因此，我們選擇大蒜素<15.0 μM的濃度范圍進行后續(xù)實驗，以排除細胞毒性對細胞侵襲的影響。

圖1 MTT法測定不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞活性的影響

*與對照組比較，差異有顯著性（< 0.05）

2.2 細胞粘附試驗、Transwell細胞遷移和侵襲試驗檢測不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞的粘附、遷移和侵襲能力的影響研究

首先，測試了A 549和H 1299肺腺癌細胞與不同濃度的大蒜素孵育后細胞粘附能力的變化。試驗結果表明，A549在大蒜素7.5、10 μm時，而H1299在大蒜素5.0、7.5、10 μm 時以濃度依賴性方式，降低腫瘤細胞對纖維連接蛋白的粘附作用（如圖2 A及B)。其次，觀察了不同濃度的大蒜素對A 549和H 1299細胞遷移和侵襲能力的影響，細胞在大蒜素5.0、7.5、10 μm作用下遷移或侵襲的肺腺癌細胞數(shù)量呈劑量依賴性減少(如圖2C及D)。上述數(shù)據(jù)表明，大蒜素抑制了肺腺癌細胞的粘附、遷移和侵襲能力。

圖2 細胞粘附試驗、Transwell遷移和侵襲試驗檢測不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞粘附、遷移和侵襲能力的影響

*與對照組比較，差異有顯著性（< 0.05）

2.3 RT-qPCR從分子水平檢測不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞TIMP/MMP平衡的影響研究

以往的研究表明，MMPs的表達受內源性組織抑制劑(TIMPs)的調控[7-9]。采用RT-qPCR方法檢測了0，5.0、7.5、10.0 μM大蒜素對H 1299作用48 h后，檢測肺腺癌細胞MMP-2和MMP-9的mRNA水平（圖3A），以及肺腺癌細胞TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平（圖3B）。發(fā)現(xiàn)大蒜素以濃度依賴性的方式上調了H 1299細胞中TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平（圖3B），而大蒜素劑量依賴性地抑制了H 1299細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA水平（圖3A）。這些結果表明，大蒜素通過對TIMP/MMP的平衡的調節(jié)，從而影響了肺腺癌細胞的粘附、遷移與侵襲能力。

圖3 RT-PCR檢測不同濃度的大蒜素對肺腺癌細胞的TIMP/MMP平衡的調節(jié)影響

*與對照組比較，差異有顯著性（< 0.05）

3 討論

癌細胞的異常侵襲被認為是癌癥的重要生物學特征。浸潤的存在是肺癌患者復發(fā)和死亡的主要原因[1,16]。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能抑制肺腺癌細胞的粘附、遷移和侵襲。它還提供了證據(jù)表明，上述影響背后的機制與改變TIMP/MMP平衡有關[17]。本研究為探討大蒜素在肺腺癌侵襲中的作用提供了理論依據(jù)。

越來越多的研究表明，大蒜素對膠質瘤U87、肝癌G2和胃癌MGC 803細胞[12-14]具有細胞毒作用。這些大蒜素的特性使其成為一種很有前途的抗肺腺癌抑制劑。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大蒜素可以抑制細胞活力，提示大蒜素對肺腺癌具有細胞毒性作用。據(jù)我們所知，關于這種關注大蒜素和癌細胞的侵襲的研究很少。為此，我們還分析了大蒜素在肺腺癌細胞侵襲中的作用，研究顯示大蒜素抑制肺腺癌的侵襲性與肺腺癌細胞粘附、遷移和侵襲浸潤減少有關。有研究顯示MMP-1與TIMP-1之間平衡失調可促進肝臟纖維化病變[18]，顯示基質金屬蛋白酶，特別是MMP-2和MMP-9，控制細胞-細胞和細胞-基質的相互作用，而通常情況下，TIMPs與MMPs結合，使它們的活動處于動態(tài)狀態(tài)。然而，一旦這種平衡被打破，癌細胞的侵襲和轉移就可被誘導[6-9]。TIMPs和MMPs之間的不平衡被認為是促進肺癌的侵襲過程主要機制。

Hu等人報道，缺氧可能是通過調節(jié)MMP-9和TIMP-2的表達[19]而影響肺癌細胞的侵襲性。Ylisirnio等人證明血清MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 與肺癌患者的臨床結果，可作為預后指標[20]。已經證實MMP，特別是MMP-2和MMP-9參與了肺癌的侵襲。探討觀察大蒜素對MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2表達的影響。結果表明，大蒜素劑量依賴性地下調了MMP-2和MMP-9的mRNA水平，而TIMP-1和TIMP-2 mRNA水平呈劑量依賴性增加[21]。大蒜素抑制肺腺癌細胞的活性、粘附、遷移和侵襲。這些數(shù)據(jù)表明，大蒜素可能通過誘導基質金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9)與TIMPs(TIMP-1和TIMP-2)之間的相互作用，使兩者表達失衡從而抑制肺腺癌的侵襲。

有研究表明大蒜素能調控 VEGF/PI3K/AKt抑制卵巢癌 SKOV3 細胞的增殖和生長，促進細胞凋亡，且具有時間—劑量反應關系[22]。也有研究證實PI3K/AKT通路在乳腺癌、垂體腺瘤和前列腺癌[23-25]等多種腫瘤中被激活。有研究顯示C-met及COX-2兩者可成為肺癌的早期診斷、早期預后評估的標志物[26]，PI3K/AKT信號通路可能通過調節(jié)MMP和TIMPs的表達來促進ECM蛋白的降解，這一機制對腫瘤的侵襲是必不可少的，包括肺癌。據(jù)我們研究所知，大蒜素已被證實可抑制HepG 2細胞中的PI3K/AKT信號通路。而大蒜素抑制肺腺癌細胞侵襲是否也是通過PI3K/AKT信號通路起作用，我們擬通過后續(xù)實驗來證實。

總之，我們的研究數(shù)據(jù)表明，大蒜素通過改變TIMP/MMP平衡來抑制肺腺癌細胞的侵襲，大蒜素可作為潛在的肺腺癌治療的抗侵襲劑。

[1] Zhang XD, Li W, Zhang N, Hou YL, et al. Identification of adipophilin as a potential diagnostic tumor marker for lung adenocarcinoma[J]. Int J Clin Exp Med,2014, 7(4): 1190-1196.

[2] Pannu BS and Iyer VN. Lung adenocarcinoma presenting with isolated ‘chronic cough’ of 3 years duration-a cautionary tale[J].Respir Med Case Rep,2015, 16(c): 157-159.

[3] Sasada S, Miyata Y, Mimae T, et al. Application of PET/CT to adjuvant chemotherapy for early lung adenocarcinoma[J]. J Cardiothorac Surg ,2015,10 (Suppl 1): A198.

[4] Wang L, Zhan W, Xie S,et al. Over-expression of Rap2a inhibits glioma migration and invasion by down-regulating p-AKT[J]. Cell Biol Int 2014,38(3): 326-334.

[5] Huang LC and Hueng DY. CD97 and glioma invasion[J]. J Neurosurg ,2014,120(2): 579-580.

[6] Dung TD, Feng CC, Kuo WW, et al. Suppression of plas-minogen activators and the MMP-2/-9 pathway by a Zanthoxylum avicennae extract to inhibit the HA22T human hepatocellular carcinoma cell migration and invasion effects in vitro and in vivo via phosphatase 2A activation[J].Biosci Biotechnol Biochem,2013, 77(9): 1814-1821.

[7] Gutschalk CM, Yanamandra AK, Linde N, et al. GM-CSF enhances tumor invasion by elevated MMP-2, -9, and -26 expression[J]. Cancer Med ,2013,2(2): 117-129.

[8] Zhang C, Li Y, Qian ZJ, et al. Dieckol from Ecklonia cava Regulates Invasion of Human Fibrosarcoma Cells and Modulates MMP-2 and MMP-9 Expression via NF-κB Pathway[J]. Evid Based Complement Alternat Med ,2011(2011),140462.

[9] Krengel S, Alexander M, Brinckmann J, et al MMP-2, TIMP-2 and MT1-MMP are differentially expressed in lesional skin of melanocytic nevi and their expression is modulated by UVB-light[J]. J Cutan Pathol,2002, 29(7): 390-396.

[10] 陳傳軍,于志堅,呂亞莉,等.大蒜素抗人肝癌 HepG-2 細胞的實驗研究[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2014，32(7): 1763-1767.

[11] Luo R, Fang D, Hang H ,et al. Recent progress of allicin on cell growth inhibition and Apoptosis in gastric cancer cells[J]. Anticancer Agents Med Chem ,2016,16: 802-809.

[12] Zhang X, Zhu Y, Duan W, et al. Allicin induces apoptosis of the MGC-803 human gastric carcinoma cell line through the p38 mitogen-activated protein kinase/caspase-3 signaling pathway[J]. Mol Med Rep,2015, 11(4): 2755-2760.

[13] Chu YL, Ho CT, Chung JG, Rajasekaran R and Sheen LY. Allicin induces p53-mediated autophagy in Hep G2 human liver cancer cells[J]. J Agric Food Chem,2012, 60(34): 8363-8371.

[14] Cha JH, Choi YJ, Cha SH, et al. Allicin inhibits cell growth and induces apoptosis in U87MG human glioblastoma cells through an ERK-dependent pathway[J]. Oncol Rep ,2012,28(1): 41-48.

[15] Bat-Chen W, Golan T, Peri I,et al. Allicin purified from fresh garlic cloves induces apoptosis in colon cancer cells via Nrf2[J]. Nutr Cancer,2010, 62(7): 947-957.

[16] Zhang P, Yu S, Li H, Liu C, et al. ILT4 drives B7-H3 expression via PI3K/AKT/mTOR signalling and ILT4/B7-H3 co-expression correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer[J]. FEBS Lett,2015, 589(17): 2248-2256.

[17] HUANG, LING, SONG, et al. Allicin inhibits the invasion of lung adenocarcinoma cells by altering tissue inhibitor of metalloproteinase/matrix metalloproteinase balance via reducing the activity of phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling[J]. Oncology letters,2017,14(1):468-474.

[18] 袁建,楊宇.基質金屬蛋白酶-1、基質金屬蛋白酶抑制劑-1與肝纖維化的中醫(yī)治療[J].井岡山大學學報:自然科學版,2010,31(5):106-108,117.

[19] 胡振紅,黃緘,李清泉,等.缺氧對人肺腺癌細胞浸潤遷移能力及MMP-2、TIMP-2表達的影響[J].中國肺癌雜志,2005(4):270-273.

[20] Ylisirnio S, H?yhty? M , Turpeenniemi-Hujanen T. Serum matrix metalloproteinases -2, -9 and tissue inhibitors of metallo-proteinases -1, -2 in lung cancer-TIMP-1 as a prognostic marker[J]. Anticancer Res,2000, 20(2B): 1311-1316.

[21] Lokaewmanee K, Yamauchi K, Okuda N. Effects of dietary red pepper on egg yolk colour and histological intestinal morphology in laying hens[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2013,97(5):986-995.

[22] 黃漢陵,李陽.大蒜素調控 VEGF/PI3K/AKt 促進 SKOV3 細胞的凋亡[J]. 解剖學研究，2019，41(2): 115-118.

[23] Lee Y R,Park J, Yu H N,et al. Up-regulation of PI3K/Akt signaling by 17beta-estradiol through activation of estrogen receptor-alpha, but not estrogen receptor-beta, and stimulates cell growth in breast cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2005,336(4): 1221-1226.

[24] Thamilselvan V,Craig D H,Basson M D. FAK association with multiple signal proteins mediates pressure-induced colon cancer cell adhesion via a Src-dependent PI3K/Akt pathway[J]. FASEB J ,2007,21(8): 1730-1741.

[25] Meng Q, Xia C, Fang J,et al. Role of PI3K and AKT specific isoforms in ovarian cancer cell migration, invasion and proliferation through the p70S6K1 pathway[J]. Cell Signal ,2006,18(12): 2262-2271.

[26] 王風婷.C-met和COX-2在非小細胞肺癌中的表達與臨床意義[J].井岡山大學學報:自然科學版,2013,34(1):95-100.

A preliminary study of the effect of allicin on the invasive biological behavior of lung adenocarcinoma cells

SONG Yuan-hong,*HUANG Ling, GU Jun-jing

（Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China）

MTT method, cell adhesion test, Transwell cell migration and invasion test were used to detect the changes in the activation, adhesion, migration and invasion of lung adenocarcinoma cells at different concentrations of allicin; (RT-qPCR) reverse transcription-quantitative polymerization enzyme chain reaction was used to detect the influence of different concentrations of allicin on the balance of TIMP/MMP. It was found that allicin could inhibit the activation, adhesion, migration and invasion of lung adenocarcinoma cells in a dose-dependent manner. Allicin mainly reduced the mRNA levels of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), and at the same time for tissue metalloproteinase inhibitor-1 (TIMP-1) and tissue metalloproteinase inhibitor- 2 (TIMP-2) mRNA levels increased in a dose-dependent manner on the contrary. It could be concluded that allicin may inhibit the invasion of lung adenocarcinoma cells by inhibiting the balance of TIMP/MMP. Allicin could be used as a potential anti-invasive agent in the treatment of lung adenocarcinoma.

allicin; MMP-2; MMP-9; TIMP-1; TIMP-2; lung adenocarcinoma; invasion

1674-8085（2022）01-0052-05

R734.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2022.01.009

2021-09-09；

2021-10-16

國家自然科學基金項目（81860282）；江西省中醫(yī)藥管理局科技計劃項目(2020A0383)

宋圓紅(1985-)，女，江西吉安人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事病理診斷學研究(E-mail: 1491697599@qq.com)；

*黃 玲(1984-)，男，江西吉安人，副主任醫(yī)師，博士，主要從事胸心血管外科和腫瘤研究(E-mail: hzh_0796@163.com）.