濕寒證大鼠模型的構(gòu)建及其評(píng)價(jià)

穆妮熱·排爾哈提，古麗娜孜·肉孜，買買提明·努爾買買提，海力里·麥麥提，阿衣努爾·買提斯迪克

（新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011）

證候是中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病的主要模式，是中醫(yī)四診信息的高度概括和歸納[1]，證候模型是研究疾病發(fā)生發(fā)展的有效工具[2].，病因造模法是證候模型的經(jīng)典制備思路[3].。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，環(huán)境、膳食及精神因素是導(dǎo)致證候的潛在病因。本研究選取臨床濕寒證致病因素（濕寒環(huán)境及膳食）施加于實(shí)驗(yàn)大鼠，觀察大鼠外在生物表征，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)的變化，并“以方測(cè)證”來證實(shí)模型成立，為濕寒證本質(zhì)研究提供模型支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)雌性SD 大鼠30只，體重(240±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):IACUC20190916-01，動(dòng)物生產(chǎn)許可證[ SCXK（新）2018-0002]。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3 組，正常對(duì)照組、濕寒證模型組、藥物反證組，各組10 只。

1.2 主要試劑與儀器ACTH 試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)202009) ; CORT 試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)202009)；濕寒證對(duì)應(yīng)方（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院提供，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)MZJW-0113-2013）；寒涼性飼料（委托江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司加工）；RQH-350 型人工氣候箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；S-3400N型掃描電鏡（日本日立公司）。

1.3 模型建立與給藥方法濕寒證模型組給予寒涼性飼料（基礎(chǔ)飼料70%+芫荽實(shí)、菠菜實(shí)30%），控制人工氣候箱條件，模擬濕寒飼養(yǎng)環(huán)境[室溫（6±1）℃，相對(duì)濕度85%～95%]，外加冷水游泳[（水溫:（6±1）℃，1 d/次、持續(xù)5 min]等因素持續(xù)刺激24 d，觀察不同時(shí)間段相關(guān)指標(biāo)的變化，并與正常對(duì)照組進(jìn)行比較；藥物反證組，造模的第1天開始，受濕寒應(yīng)激前1 h灌胃濕寒證對(duì)應(yīng)方藥，給藥濃度為0.35 g/100 g，灌胃容量為1mL/100 g，相當(dāng)于臨床用量等效劑量的6 倍，每日1次，連用24 d，觀察相關(guān)指標(biāo)，并與正常對(duì)照組、濕寒證模型組進(jìn)行比較。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠外觀表征 觀察并記錄各組大鼠的外觀表征并評(píng)分，見表1。

表1 大鼠外觀表征評(píng)分表

1.4.2 定量指標(biāo) 體重：每日固定時(shí)間稱量；攝食量=（每籠中加入飼料量－24 h 后剩余量）/大鼠只數(shù)；攝水量=（每籠中加入飲用水量－24 h 后剩余量）/大鼠只數(shù)。

1.4.3 大鼠血清ACTH、CORT 的測(cè)定 Elisa 法檢測(cè)大鼠血清ACTH、CORT 水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 舌體表面組織形態(tài)學(xué)觀察 取材后，將舌體樣本置于掃描電鏡下，觀察舌體顯微結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；體征評(píng)分值，體重、攝食水量用一般線性模型(general lin?er model)重復(fù)測(cè)量法進(jìn)行方差分析；大鼠血清應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠外觀表征觀察結(jié)果造模結(jié)束時(shí)，正常對(duì)照組體毛稠密光滑，行動(dòng)活潑，精神佳，食欲可，眼睛明亮，反應(yīng)尚可，大小便正常；濕寒證模型組大鼠一般狀態(tài)有不同程度的改變，鼻部、爪部色澤變淡，舌質(zhì)暗，舌苔白膩明顯，蜷臥少動(dòng)，大便濕軟，尿色清；藥物反證組大鼠精神狀態(tài)一般，反應(yīng)尚靈活，體毛稍有散亂，鼻部、爪部色澤紅潤(rùn)或稍淡，大便偶有干濕不調(diào)。

2.2 3 組大鼠外觀表征評(píng)分的比較造模前各組間外觀表征評(píng)分值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模第6、9、12、15、18、21、24 天，濕寒證模型組體征評(píng)分值均高于正常對(duì)照組與藥物反證組，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模第21、24天時(shí)藥物反證組與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)外觀表征評(píng)分的比較(分，±s)

表2 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)外觀表征評(píng)分的比較(分，±s)

注：與同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時(shí)間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對(duì)照組23.10±0.29 30.00±1.63 32.90±2.37 38.00±2.66 43.20±3.22 48.00±4.42 51.00±4.18 52.50±4.85 53.30±3.94濕寒證模型組23.00±0.29 32.50±4.22 39.90±2.99*45.20±4.07*53.40±7.82*60.50±7.97*67.70±5.07*75.30±4.52*80.10±3.72*藥物反證組22.60±0.29 32.30±6.48 36.00±6.99 41.40±6.99 52.50±6.24*54.10±5.17*#56.50±6.04*#55.90±5.85#55.20±4.44#

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠體重的變化造模前和造模第3、6 天，各組間體重比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模第9、12、15、18 天，濕寒證模型組、藥物反證組與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模第21、24 天，藥物反證組的體重升高，與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上的體重比較(g,±s）

表3 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上的體重比較(g,±s）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時(shí)間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對(duì)照組248.98±11.92 257.86±9.75 272.62±9.31 293.20±5.19 301.13±3.08 306.13±6.14 310.44±6.33 314.06±5.91 317.26±7.23濕寒證模型組250.66±17.39 257.86±18.03 268.36±17.50 274.38±14.32*280.88±14.23*285.74±13.44*290.35±14.23*296.35±12.62*301.17±13.70*藥物反證組239.60±6.29 249.20±7.29 260.82±11.18 271.62±12.12*282.26±9.50*289.81±8.09*298.60±5.89*308.79±4.02#310.05±3.95#

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠攝食量的變化造模前和造模第3 天，各組間攝食量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后第9、12、15、18 天，濕寒證模型組攝食量增加，與正常對(duì)照組、藥物反證組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模第21、24 天，藥物反證組攝食量與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上的攝食量比較(g,±s）

表4 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上的攝食量比較(g,±s）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時(shí)間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對(duì)照組10.66±0.14 13.75±0.47 15.58±0.40 15.04±0.37 16.00±0.35 16.51±0.28 17.32±0.18 17.63±0.26 18.27±0.20濕寒證模型組10.57±0.51 13.68±0.53 16.54±0.20*18.58±0.32*19.54±0.10*19.69±0.09*20.19±0.10*20.43±0.18*20.71±0.17*藥物反證組10.41±0.38 13.98±0.61 16.56±0.32*16.97±0.50*#17.44±0.20*#17.55±0.15*#17.64±0.14*#17.72±0.17#18.15±0.12#

2.5 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠攝水量的變化造模前和造模第3 天，各組間攝水量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模后第9、12、15、18 天，濕寒證模型組、藥物反證組攝水量減少，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。造模第21、24 天，藥物反證組攝水量與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與濕寒證模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

表5 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上的攝水量比較(mL,±s）

表5 3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)上的攝水量比較(mL,±s）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與同一時(shí)間點(diǎn)的濕寒證模型組比較，#P<0.05。

時(shí)間造模前造模第3天造模第6天造模第9天造模第12天造模第15天造模第18天造模第21天造模第24天n 10 10 10 10 10 10 10 10 10正常對(duì)照組17.39±0.15 18.27±0.27 20.40±0.28 22.04±0.40 23.51±0.59 24.61±0.58 25.43±0.55 25.79±0.47 26.26±0.33濕寒證模型組17.49±0.26 18.22±0.15 19.50±0.30*20.12±0.14*20.58±0.07*21.54±0.10*22.44±0.06*22.80±0.25*23.11±0.05*藥物反證組17.37±0.26 18.19±0.73 19.59±0.09*21.56±0.23*#22.46±0.04*#23.95±0.49*#24.83±0.04*#25.66±0.16#26.11±0.27#

2.6 血清ACTH、CORT 的變化結(jié)果慢性應(yīng)激后，濕寒證模型組大鼠血清ACTH、CORT 水平均增高，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；藥物反證組血清ACTH 水平與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），血清CORT 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表6。

表6 3組大鼠血清ACTH、CORT的變化(ng/mL,±s)

表6 3組大鼠血清ACTH、CORT的變化(ng/mL,±s)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05。

指標(biāo)ACTH CORT正常對(duì)照組0.018±0.001 13.351±0.968濕寒證模型組0.021±0.002*16.173±2.427*藥物反證組0.020±0.002 15.095±1.964*

2.7 大鼠舌體表面組織形態(tài)學(xué)變化

2.7.1 3組大鼠舌體絲狀乳頭角質(zhì)化程度的比較 正常對(duì)照組大鼠絲狀乳頭表面光滑，乳頭基部呈現(xiàn)一定的角質(zhì)化；與正常對(duì)照組相比，濕寒證模型組大鼠的舌體絲狀乳頭較長(zhǎng)，乳頭間的空隙較小，乳頭表面凹凸不平，裂紋較多,角質(zhì)層較厚且角化程度較嚴(yán)重，出現(xiàn)剝脫現(xiàn)象；藥物反證組大鼠角質(zhì)層較模型組薄，乳頭間的空隙較大，乳頭表面較光滑，剝落現(xiàn)象不明顯。結(jié)果見圖1。

圖1 3組大鼠舌體絲狀乳頭形態(tài)

2.7.2 3組大鼠舌體菌狀乳頭角質(zhì)化程度的比較 正常對(duì)照組大鼠舌體菌狀乳頭中央可見味孔,中央平滑，裂紋少，周圍呈現(xiàn)一定的角質(zhì)化；與正常對(duì)照組相比，濕寒證模型組大鼠舌體菌狀乳頭中央未見味孔，裂紋較多，周圍被角質(zhì)層包裹,且角化組織較厚；藥物反證組大鼠舌體的菌狀乳頭中央可見味孔，裂紋較模型組少，角質(zhì)層較少而薄。見圖2。

圖2 3組大鼠舌體菌狀乳頭形態(tài)

3 討論

濕寒證是多因長(zhǎng)期食用濕寒屬性食物、藥品，長(zhǎng)期居住在濕寒環(huán)境、缺乏運(yùn)動(dòng)等原因?qū)е碌恼w性反應(yīng)。證候研究中，動(dòng)物模型信息的采集與分析評(píng)價(jià)方法日趨成熟。有學(xué)者提出，在證候模型的基礎(chǔ)上，依據(jù)辨證論治的原則，以經(jīng)典方藥干預(yù)，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)情況，“以藥反證””的方法驗(yàn)證動(dòng)物模型復(fù)制是否成功[4-5]。本研究所采用多病因造模法通過對(duì)大鼠進(jìn)行多樣的，隨機(jī)的刺激，復(fù)制出證候動(dòng)物模型。觀察動(dòng)物外在表征，并進(jìn)行評(píng)分賦值，舌體組織形態(tài)學(xué)變化和應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并使用濕寒證對(duì)應(yīng)方，從“方證相應(yīng)”角度進(jìn)行逆向辨證，判定動(dòng)物模型證型屬性。

慢性應(yīng)激可導(dǎo)致行為活動(dòng)減少，動(dòng)物隨應(yīng)激時(shí)程延長(zhǎng)，其行為表現(xiàn)為由興奮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种茽顟B(tài)[6]。本研究顯示，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠在應(yīng)激源的刺激下活動(dòng)量明顯減少，喜扎堆，對(duì)刺激的反應(yīng)度降低。濕寒證模型組大鼠皮毛蓬亂不潔，鼻、爪部色澤淡白，舌部白色厚苔明顯，精神倦怠，喜扎堆，嗜睡，小便顏色清，量明顯增多，大便細(xì)長(zhǎng)，出現(xiàn)黏液便。各組外觀表征評(píng)分排序?yàn)闈窈C模型組>藥物反證組>正常對(duì)照組，其中濕寒證模型組評(píng)分值最高，造模第24天時(shí)達(dá)到80.10分。

冷暴露對(duì)大鼠的能量代謝有重要影響[7]。冷暴露4 周的雄性大鼠體重增長(zhǎng)與對(duì)照組相比顯著性降低[8]。本研究顯示，隨著造模的進(jìn)行，濕寒證模型組大鼠體重增長(zhǎng)速度緩慢，與上述研究結(jié)果一致。環(huán)境溫度的改變能夠影響正常機(jī)體的生理功能，牛亭惠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低溫暴露能夠引起大鼠的攝食量與攝水量的增加。Zhang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雄性布氏田鼠通過增加食物的攝入量以補(bǔ)償寒冷中的高能量需求。本研究顯示，濕寒證模型組大鼠攝食量與攝水量顯著性增加，可能是因?yàn)槁詰?yīng)激導(dǎo)致動(dòng)物的排泄量增加，許多內(nèi)源性物質(zhì)丟失，因此需要食物和水分來補(bǔ)充丟失的能源物質(zhì)，以維持正常的代謝活動(dòng)。

機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)主要由下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸來調(diào)控。下丘腦、垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH )[11]，此外ACTH 還可激活腎上腺皮質(zhì)，最終刺激皮質(zhì)酮(cor?ticosterone，CORT)的合成和釋放[12]，脊椎動(dòng)物發(fā)生冷應(yīng)激時(shí)，血清中CORT 水平會(huì)升高[13]。CORT是HPA軸的終末產(chǎn)物,可反饋于HPA 軸的各個(gè)水平。ACTH和CORT 常被認(rèn)為是應(yīng)激相關(guān)研究最經(jīng)典最重要指標(biāo)之一，本研究中由于濕寒環(huán)境及寒涼性飼料，外加冷水游泳等多因素的復(fù)合作用下，濕寒證模型組的ACTH 與CORT 水平明顯上升，血清ACTH 濃度：濕寒證模型組>藥物反證組>正常對(duì)照組，濕寒證模型組與正常對(duì)照組差異顯著。血清CORT 濃度：濕寒證模型組>藥物反證組>正常對(duì)照組。提示，濕寒證大鼠HPA 軸可能處于應(yīng)激狀態(tài)，從而引起ACTH 及CORT血清水平的改變。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，掃描電鏡技術(shù)逐漸被運(yùn)用到舌象的診斷上。本研究采用掃描電鏡技術(shù)從舌體微觀結(jié)構(gòu)觀察舌體在應(yīng)激狀態(tài)下的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，濕寒證模型組大鼠舌體表面的絲狀乳頭間的空隙較小。在臨床上濕寒證病人的舌質(zhì)呈淡紫或蒼白，這可能就與絲狀乳頭間的空隙小，且覆蓋了舌體以及舌體皮下的毛細(xì)血管有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，濕寒證模型組大鼠舌體表面絲狀乳頭和菌狀乳頭角質(zhì)化程度較高。舌苔是成片的絲狀乳頭以及菌狀乳頭根部的角質(zhì)層構(gòu)成，這與臨床上濕寒證病人舌苔較厚的現(xiàn)象相符。本研究顯示，藥物反證組舌體的角質(zhì)化程度比濕寒證模型組低，角質(zhì)層較少而薄。表明濕寒證對(duì)應(yīng)方能有效防止對(duì)應(yīng)“證候”的出現(xiàn)，但是不能完全消除其影響。方證對(duì)應(yīng)是指每一具體方劑都有其適應(yīng)的病證，臨床特定病癥要求有特定的方劑進(jìn)行治療，當(dāng)方劑的功效與其所治病證相對(duì)應(yīng)時(shí)，方劑才能顯效[14]。本研究觀察了濕寒證對(duì)應(yīng)方對(duì)濕寒證大鼠模型的治療作用，結(jié)果顯示濕寒證對(duì)應(yīng)方在大鼠外觀生物表征、體重、攝食水量、舌體組織形態(tài)和血清ACTH 和CORT 含量方面均顯示出較好的改善作用。根據(jù)方證對(duì)應(yīng)的原理，可判定此動(dòng)物模型呈現(xiàn)出的證候?yàn)闈窈C。由此本研究進(jìn)一步確定模型組大鼠表現(xiàn)出的特征與臨床“濕寒證”證候特征高度一致，這種造模方法可復(fù)制臨床“濕寒證”模型。

綜上所述，本研究以濕寒證的病因因素作為應(yīng)激源，采用濕寒膳食及環(huán)境復(fù)合作用并模擬出大鼠濕寒證動(dòng)物模型，該方法盡可能模擬濕寒證的發(fā)病條件及機(jī)制，但確切的機(jī)制尚不可知，仍需進(jìn)一步的開展后續(xù)研究，為證候?qū)傩匝芯刻峁└钊搿⒏茖W(xué)的評(píng)價(jià)體系。