TWEAK誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性外泌體miRNA抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移的研究

鄭祖萍,夏先如,周發(fā)友,唐曉磊

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，居我國泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第一位。其發(fā)病率隨年齡增長而增加，且男性膀胱癌發(fā)病率為女性的3～4倍[1]。而研究膀胱癌腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能有助于確定膀胱癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。

腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的主要因素。巨噬細(xì)胞是免疫相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞中重要的細(xì)胞之一，且系溝通天然免疫和適應(yīng)性免疫的樞紐，在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)證實(shí)巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。因此，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞可以作為治療干預(yù)的潛在靶標(biāo)。

外泌體是腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間相互作用的重要介導(dǎo)者[4]。外泌體是由多種類型細(xì)胞產(chǎn)生的微泡，其源自吞多泡體與質(zhì)膜的融合。當(dāng)它們釋放到細(xì)胞外環(huán)境中時(shí)，外泌體可以與受體細(xì)胞結(jié)合并轉(zhuǎn)移細(xì)胞細(xì)胞表面的分子。研究已經(jīng)報(bào)道了多種生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸(包括mRNA、microRNA和DNA等)都存在于外泌體中，并且能夠調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物活性[5]。

腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是TNF超家族成員之一[6]。它是一種多功能細(xì)胞因子，能夠與其同源受體成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14(fibroblast growth factor induces early reactive protein 14,Fn-14)結(jié)合，并影響許多類型癌細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)[6]。這表明TWEAK在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著重要作用，并且可能調(diào)控腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[6-7]。

為探討TWEAK在膀胱癌中的生物學(xué)功能，在本研究中，我們利用ATCC 5637膀胱癌細(xì)胞系檢測源自腫瘤相關(guān)組織巨噬細(xì)胞(TMs)的外泌體對其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)作報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞系A(chǔ)TCC 5637和單核細(xì)胞系THP-1購自于武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心(武漢，中國)。細(xì)胞在含有10% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Gibco公司，澳大利亞)和青霉素/鏈霉素(1∶100，Sigma公司，美國)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Cyclone，GE Healthcare，美國)中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃潮濕溫箱中。為了誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞，用100 ng/mL佛波酯(Phobo ester,PMA)(Sigma公司)處理THP-1細(xì)胞(4×105)，并孵育24 h。分化后，用PBS洗滌細(xì)胞3次。

1.2 外泌體純化、表征和分析 使用總外泌體分離試劑(Invitrogen公司，美國)從細(xì)胞培養(yǎng)基中提取外泌體。THP-1細(xì)胞在不含胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，10 000 g離心30 min除去細(xì)胞碎片。將總外泌體分離試劑加入到無細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后在4 ℃條件下孵育16 h。4 ℃條件下10 000 g離心1 h收集外泌體，然后用500 μL PBS重懸，并用Bicinchoninic Acid Assay蛋白測定法(賽默飛公司,美國)進(jìn)行定量。同時(shí)使用透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit,賽默飛公司，美國)捕獲外泌體圖像；使用馬爾文激光粒度儀(M-ZNano ZS,馬爾文公司，英國)來測定外泌體的粒徑和分布。

1.3 外泌體標(biāo)記和追蹤 使用PKH67綠色熒光細(xì)胞標(biāo)記試劑盒(Sigma公司)標(biāo)記來自TWEAK刺激的巨噬細(xì)胞的上清液中分離的外泌體。標(biāo)記的外泌體與ATCC 5637細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，隨后洗脫。使用Leica TCS SP5 Ⅱ激光掃描共焦顯微鏡來觀察受體ATCC 5637細(xì)胞對標(biāo)記的外泌體的攝取。

1.4 miRNA微陣列測定 使用miRNA標(biāo)記試劑和雜交試劑盒(Agilent Technologies公司，美國)及人miRNA微陣列試劑盒(Agilent公司，美國)對未刺激或TWEAK刺激的TMs源性的外泌體進(jìn)行微陣列檢測。每個樣本100 ng總RNA先進(jìn)行磷酸化處理，然后用Cyanine 3-pCp標(biāo)記。使用Micro Bio-spin柱(Bio-Rad)純化標(biāo)記的RNA，隨后在58 ℃下與人miRNA微陣列載玻片雜交20 h。后使用洗滌緩沖液洗滌，并使用Agilent微陣列掃描儀掃描。使用安捷倫的特征提取軟件獲得原始雜交強(qiáng)度，并檢測總共1 852個miRNAs。其中TWEAK刺激的巨噬細(xì)胞源性的外泌體miRNA顯著升高的列出。

1.5 RNA提取及RT-PCR檢測miRNA 使用miRNeasy Mini試劑盒(Qiagen公司，美國)來分離和富集外泌體中的RNA，并使用TRIzol法提取外泌體(100 mg/mL)處理24 h后的卵巢癌細(xì)胞中的總RNA。用特異性RT引物逆轉(zhuǎn)錄成熟的miRNA-17-3p，設(shè)計(jì)miRNA-17-3p引物,F:5′-TGC GTT GAC GTC ACT CCC G-3′;R:5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′[8]。人snRNA RNU6B(U6)用于miRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化(U6引物,F:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,R:5′-ACG CTT CAC GAA TTT GCG T-3′)[8]。使用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。

1.6 miRNA轉(zhuǎn)染 人micrOFF antagomiR-17-3p序列(3′-CUA CAA GUG CCU UCA CUG CAG U-5′)antagomiR和micrOFF antagomiR-NC序列(5′-UUU GUA CUA CAC AAA AGU ACU G-3′)陰性對照購自上海生工(上海，中國)。根據(jù)廠家說明書，直接將人hsa-miR-7-5p antagomiR或陰性對照以200 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染到THP-1巨噬細(xì)胞。

1.7 免疫印跡分析 從巨噬細(xì)胞源性外泌體(100 μg/mL)處理的ATCC 5637細(xì)胞中分離總蛋白。用于免疫印跡分析的抗體包括：EGFR兔單抗(碧云天公司,中國)，磷酸化(Ser473/Thr308)AKT兔單抗mAb(碧云天公司,中國)，Akt 1/2兔單抗(碧云天公司,中國)，磷酸化p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)兔單抗，p44/42 MAPK兔單抗(Santa Cruz公司,美國)，GAPDH兔單抗(碧云天公司,中國),羊抗兔IgG單抗(Abcam公司,美國)。兔單抗為一抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次；羊抗兔IgG單抗為二抗(1∶8 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次；加入ECL置于儀器中曝光顯影。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移檢測：傳代培養(yǎng)的 ATCC 5637細(xì)胞2×106/mL重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，鋪于Trans-well聚碳酸酯膜嵌套(康寧公司，美國)上層，將TWEAK刺激后的TMs及對照組置于Trans-well下層。37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h后，除去殘留在膜上表面的細(xì)胞，用顯微鏡放大200倍計(jì)數(shù)，平均每個視野的細(xì)胞數(shù)，每組3個重復(fù)試驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TWEAK刺激的TMs源性的外泌體被ATCC 5637細(xì)胞內(nèi)化 PMA誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞24 h后，圓形浮動的THP-1細(xì)胞變成了貼壁的扁平細(xì)胞(見圖1A)。巨噬細(xì)胞的兩個公認(rèn)的標(biāo)志物，CD36和CD71的表達(dá)顯著性增加(見圖1B)；行馬爾文納米顆粒分析儀觀察，其外泌體直徑主要分布在92 nm左右(見圖2A和圖2B)。且激光共聚焦顯微鏡觀察，其能夠被ATCC 5637細(xì)胞內(nèi)化(見圖3)。

2.2 TWEAK誘導(dǎo)TMs產(chǎn)生的外泌體中miRNAs的檢測 經(jīng)miRNAs芯片檢測，TWEAK處理TMs產(chǎn)生的外泌體中差異表達(dá)1 852種miRNAs，其中9種顯著高表達(dá)miRNAs被羅列(見表1)；在獲得TWEAK處理TMs產(chǎn)生的外泌體、GW4869預(yù)處理的TMs以及接受外泌體的受體細(xì)胞ATCC5637中，發(fā)現(xiàn)TWEAK處理后TMs及外泌體中miRNA-17-3P水平均高于未處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)；而受體細(xì)胞同樣在接受TWEAK處理組的外泌體后，miRNA-17-3P水平均高于未處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表1 TWEAK誘導(dǎo)TMs產(chǎn)生的外泌體中高表達(dá)的部分miRNAs(n=3)

表2 TWEAK誘導(dǎo)前后不同胞體內(nèi)miRNA-17-3p水平的比較(n=3)

2.3 外泌體促進(jìn)膀胱癌ATCC 5637細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 通過Transwells實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，細(xì)胞數(shù)，未處理組高于PBS處理組，PBS處理組高于TWEAK處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明TWEAK誘導(dǎo)的TMs能夠通過外泌體抑制ATCC5637細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(見表3)；而GW4869預(yù)處理能夠抑制TWEAK激發(fā)巨噬細(xì)胞外泌體的釋放；TWEAK預(yù)處理后的DMSO組和PBS組比較，2組ATCC5637細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表3 不同處理組巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體對ATCC 5637細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

表4 TWEAK誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體對ATCC 5637細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

2.4 通過 MiRNA-17-3p抑制AKT和ERK1/2的磷酸化促進(jìn)膀胱癌ATCC 5637細(xì)胞的轉(zhuǎn)移 本研究分別使用不同處理的巨噬細(xì)胞(未處理組、TWEAK處理TMs組、TWEAK處理轉(zhuǎn)染antagomiR-17-3p的TMs組及TWEAK處理轉(zhuǎn)染antagomiR-NC的TMs組)分泌的外泌體與ATCC 5637細(xì)胞一起孵育，并且通過qRT-PCR和Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了通過干擾TMs中miRNA-17-3p的表達(dá)水平，從而影響受體細(xì)胞ATCC 5637中miRNA-17-3p的攝入水平(見表 5)，進(jìn)而影響ATCC 5637細(xì)胞轉(zhuǎn)移(見表 6)；通過Western blotting檢測ATCC 5637細(xì)胞中EGFR、磷酸化AKT和ERK1/2的表達(dá)。結(jié)果表明，TWEAK刺激的巨噬細(xì)胞源性的外泌體在ATCC 5637細(xì)胞中均能抑制EGFR的表達(dá)，并抑制AKT和ERK1/2的磷酸化，但不影響總AKT和ERK1/2的表達(dá)(見圖4)。

表5 不同處理組巨噬細(xì)胞外泌體作用于ATCC 5637細(xì)胞對其miRNA-17-3p的表達(dá)的影響

表6 不同處理組巨噬細(xì)胞外泌體作用于ATCC 5637細(xì)胞對其轉(zhuǎn)移的影響

3 討論

TWEAK在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中起重要作用，并調(diào)控腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用[7,9]，但其機(jī)制仍未清楚。本研究表明TMs衍生的外泌體可以通過將外泌體miR-17-3p轉(zhuǎn)移到ATCC 5637細(xì)胞中而在體內(nèi)外抑制膀胱癌的轉(zhuǎn)移。

近年來研究表明，外泌體是腫瘤細(xì)胞與周圍環(huán)境之間相互作用的重要介質(zhì)之一。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體能有效地破壞緊密連接和血管內(nèi)皮屏障的完整性以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[10]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以被遞送至巨噬細(xì)胞，激活巨噬細(xì)胞成為具有SCOS3/STAT3途徑參與的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞樣表型[11]。然而，關(guān)于巨噬細(xì)胞源性的外泌體轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞對其影響的報(bào)道較少。本研究首先通過PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，其表面標(biāo)記物CD36和CD71的表達(dá)顯著性增加。且證實(shí)了TMs源性外泌體的一種新功能，它能減弱ATCC 5637細(xì)胞的遷移。以GW4869消除條件培養(yǎng)基中巨噬細(xì)胞源性外泌體會導(dǎo)致TWEAK對ATCC 5637細(xì)胞的轉(zhuǎn)移幾乎沒有影響，表明TWEAK主要通過巨噬細(xì)胞源性外泌體轉(zhuǎn)移來減弱ATCC 5637細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

miRNAs被證實(shí)包含在外泌體中，并可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移[12]。外泌體miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)和相對穩(wěn)定的特性。很多研究已經(jīng)確定miR-17-3p(腫瘤抑制性miRNA)在許多癌癥的遷移、侵襲和生長中起著重要作用，如乳腺癌[13]、前列腺癌[14]和多發(fā)性骨髓瘤[15]。膀胱癌細(xì)胞表達(dá)高水平的EGFR，活化的EGFR在細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移中起重要作用[16-17]。因此，抑制EGFR是治療癌癥的一種潛在方法[18]。在本研究中，我們確定TWEAK增加了巨噬細(xì)胞源性外泌體和受體ATCC 5637細(xì)胞中miR-17-3p的水平，從而降低EGFR/AKT/ERK1/2途徑的活性，并最終抑制膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。我們還發(fā)現(xiàn)，在TMs中轉(zhuǎn)染antagomiR-17-3p降低了分泌的外泌體和受體ATCC 5637細(xì)胞中miR-17-3p的水平，并使遷移和侵襲增強(qiáng)，這說明從TMs轉(zhuǎn)移的外泌體可以調(diào)節(jié)ATCC 5637細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。我們研究揭示了miR-17-3p通過外泌體介導(dǎo)而抑制ATCC 5637細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新方法。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了TMs能夠通過外泌體將miR-17-3p轉(zhuǎn)移到ATCC 5637細(xì)胞，并抑制EGFR/AKT/ERK1/2通路，最終導(dǎo)致體內(nèi)外腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲受到抑制。此外，我們初步探索了外泌體miR-17-3p作為體內(nèi)治療的靶點(diǎn)。