LncRNA AL133467.1作為miR-661的ceRNA抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲

王 馨， 黃嘉星， 周麗歡， 陳伙娣， 馮正富， 邱惠思

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院腫瘤科，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院，廣東， 清遠(yuǎn) 511518)

據(jù)2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球最常見的癌癥，預(yù)估2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，占總癌癥發(fā)生病例的11.7%，死亡病例約為86萬例，占總癌癥死亡病例的6.9%[1]。雖然隨著乳腺癌治療方式的不斷改進(jìn)和調(diào)整，乳腺癌患者的5年生存率在不斷提高，但乳腺癌的發(fā)病率在全球呈逐年上升趨勢[2]。因此，闡釋乳腺癌發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，提高乳腺癌治療效果和降低乳腺癌患者的死亡率至關(guān)重要。

長非編碼RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸，并缺乏明顯的開放式閱讀框架的長鏈RNAs。LncRNAs參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程[3-4]。越來越多的證據(jù)表明，LncRNAs可能通過作為“分子海綿”吸附miRNA，抑制miRNA的靶基因，在癌細(xì)胞中形成競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤的作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR通過結(jié)合miR-331-3p上調(diào)人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)表達(dá)促進(jìn)胃癌進(jìn)展[7]。此外，外泌體傳遞的lncARSR可作為miR-34/miR-449的“分子海綿”，誘導(dǎo)間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(c-mesenchymal-epithelial transition factor, c-MET)和AXL(Anexelekto)表達(dá)，介導(dǎo)腎細(xì)胞癌對舒尼替尼耐藥[8]。MiR-661作為一種腫瘤抑制因子首次在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)，它通過抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis associated protein 1, MTA1)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1作為ceRNA與miR-661競爭性結(jié)合，上調(diào)細(xì)胞分裂周期34(cell division cycle 34, CDC34)的表達(dá)，促進(jìn)胃癌進(jìn)展[10]。前期我們分析TCGA(the cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫中正常乳腺組織(113例)和乳腺癌組織(1 109例)中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中LncRNA AL133467.1的表達(dá)明顯下調(diào)，Kaplan-Meier生存分析提示，AL133467.1與乳腺癌癌患者的預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)。本研究將探索AL133467.1在乳腺癌中的生物學(xué)功能及其相關(guān)分子機(jī)制，為揭示AL133467.1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、T47D、SKBR3、BT549、BT474、MCF7、HCC1937和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A，以及人胚胎腎細(xì)胞HEK293T由本實(shí)驗(yàn)室保存，乳腺癌細(xì)胞接種于含10% FBS(Biological Industries公司)的1640培養(yǎng)基(Biological Industries公司)中，HEK293T細(xì)胞接種于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(Biological Industries公司)中，MCF10A細(xì)胞接種于含有5%馬血清，10 mg/ml胰島素和0.5 mg/mL氫化可的松的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(Gibco公司)中，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)時熒光定量PCR

用miRNA Isolation Kit試劑盒(Omega公司)提取細(xì)胞中mRNA和miRNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermofisher公司)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBR Master Mix 試劑盒(Fermentas公司)進(jìn)行qRT-PCR，用All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒(GeneCopoeia公司)進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，上述操作按說明書進(jìn)行，再于實(shí)時定量熒光PCR儀(BioRad)上運(yùn)行相應(yīng)程序。根據(jù)2-ΔΔct值計算并分析結(jié)果。miR-661和U6引物購于銳博生物，其他引物序列見Table 1。

Table 1 List of primers

1.3 Western 印跡檢測

實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗2遍，用1/100蛋白酶抑制劑(cocktail)的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，用刮子刮下細(xì)胞放入1.5 mL EP管中置于冰上超聲5次(超聲2 s，間隔5 s)，4 ℃條件下12 000 g離心15 min，吸取離心后的上清，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，30 μg蛋白質(zhì)上樣進(jìn)行電泳，經(jīng)恒流200 mA轉(zhuǎn)膜90 min，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，再孵育一抗anti-TOB2(1∶500，sc-293326，Santa cruz)、β-肌動蛋白(β-actin)(1∶3 500，A5316，Sigma)，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜后，孵育二抗(1∶5 000，Cat. #31430，Thermo Scientific)，室溫下?lián)u2 h，TBST洗膜，在膜上滴加ECL液在暗室發(fā)光，待膠片晾干后掃描。

1.4 慢病毒包裝和穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

將AL133467.1全長序列克隆入pReceiver-Lv201載體，將TOB2全長序列克隆入pReceiver-Lv203載體。上述質(zhì)粒及相應(yīng)的過表達(dá)質(zhì)粒用慢病毒包裝試劑盒(Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit，廣州易錦生物有限公司)進(jìn)行病毒包裝。步驟如下：1)將HEK293T細(xì)胞接種10×10 cm皿中，待密度達(dá)到80%左右；2)配制體系：(1)將5 μL lenti-Pac HIV mix，2.5 μg質(zhì)粒和200 μL Optim-MEM輕輕混勻；(2)將15 μL EndoFection lenti和200 μL Optim-MEM輕輕混勻；(3)將(1)滴加到(1)中輕輕混勻，室溫下靜置18 min；3)將上述混合液加入到含有10 mL新鮮培養(yǎng)基的HEK293T細(xì)胞皿中培養(yǎng)12 h；4)將HEK293T細(xì)胞皿中的培養(yǎng)基換成含有20 μL TiterBoost 的10 mL新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，收集病毒液，離心后，于-80 ℃保存。將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于12孔板中，密度約40%左右，每孔加入1 mL病毒液，轉(zhuǎn)染48 h，用1 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞篩選。檢測過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系建立后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞計數(shù)

取500 μL完全培養(yǎng)基，重懸1×104個細(xì)胞/孔于24孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置3個復(fù)孔，分別于1、2、3、4和5 d，將細(xì)胞消化。計數(shù)后，統(tǒng)計各孔細(xì)胞總數(shù)目，計算兩組之間的P值，并繪制曲線。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞消化，并用無血清培養(yǎng)基清洗2遍，細(xì)胞計數(shù)1×106/mL，取200 μL細(xì)胞懸液，分別接種于已經(jīng)水化基底膜Transwell小室的上室中，在下室中加入600 μL的完全培養(yǎng)基，再將細(xì)胞置于37 ℃、5%細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。將Transwell小室放入甲醇中固定30 min，結(jié)晶紫中染色20 min。晾干后與顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)消化和計數(shù)后，接種800個/孔細(xì)胞到6孔板中。每個孔含有2 mL完全培養(yǎng)基，然后置于37 ℃、5%細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔3 d換液1次。培養(yǎng)8 d后，用甲醇固定細(xì)胞過夜，結(jié)晶紫染色20 min，經(jīng)水漂洗干凈，晾干后在顯微鏡下拍照，并統(tǒng)計克隆個數(shù)。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞消化和計數(shù)后，接種于12孔板中，第2 d待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行細(xì)胞劃痕，分別于0 h、24 h、72 h在顯微鏡下拍照。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

提前1 d將HEK293T細(xì)胞以10 000個/孔接種于96孔板中，用Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染：(1) 50 μL無血清RPMI1640+0.5 μL Lipofectamine 3 000，輕輕混勻；(2) 50 μL無血清RPMI1640+0.03 μg RLTK和0.3 μg質(zhì)粒，輕輕混勻；再將(1)和(2)輕輕混勻，室溫下靜置18 min；96孔板換成100 μL的完全培養(yǎng)基，再將上述混合物輕輕滴加入到96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)檢測。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測

用miRDB在線軟件預(yù)測AL133467.1與miR-661的可能結(jié)合位點(diǎn)。分別合成含有 miR-661 結(jié)合位點(diǎn)的AL133467.1的 3′ UTR區(qū)片段。并將其克隆到熒光素酶報告基因pGL3載體上為野生型(WT)，含有突變AL133467.1 3′ UTR 結(jié)合位點(diǎn)的載體，被克隆入熒光素酶報告pGL3載體為突變型(Mut)。按照上述轉(zhuǎn)染步驟，分別將miR-661 mimics或Vector分別與野生或突變載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T，轉(zhuǎn)染48 h，吸去培養(yǎng)基，PBS洗細(xì)胞2次，每孔加入25 μL 1×裂解緩沖液室溫下慢速搖20 min。吸取每孔中20 μL裂解液轉(zhuǎn)移到Costar白板上，每孔再加入50 μL螢火蟲熒光素酶底物，再于多功能酶標(biāo)儀檢測；每孔再加入50 μL終止液&海腎熒光素酶底物，于酶標(biāo)儀檢測，計算螢火蟲熒光值與海腎熒光值的比值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AL133467.1在乳腺癌中低表達(dá)并與患者預(yù)后相關(guān)

通過分析TCGA(The cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫中113例正常乳腺組織和1 109例乳腺癌組織中AL133467.1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AL133467.1在乳腺癌組織中的表達(dá)量明顯低于正常乳腺組織(Fig.1A)；進(jìn)一步通過生存分析發(fā)現(xiàn)，AL133467.1的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)(Fig.1B)；本文采用qRT-PCR檢測了乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的AL133467.1表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、T47D、SKBR3、BT549、BT474、MCF7、HCC1937的表達(dá)量分別是MCF10A細(xì)胞的0.39倍、0.49倍、0.1倍、0.24倍、0.16倍、0.36倍和0.6倍(Fig.1C)。

Fig.1 AL133467.1 is expressed at a low level in breast cancers and is correlated with prognosis of patients (A) The expression of AC009686.2 and (B) correlation between AL133467.1 expression and prognosis of breast cancer patients in normal breast tissues (n=113) and breast cancer tissues (n=1 109) in TCGA (The cancer genome atlas) database. (C) The qRT-PCR assay was used to determine the AL133467.1 expression, vs MCF10A, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

2.2 AC009686.2能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力

上述研究發(fā)現(xiàn)，AL133467.1在乳腺癌細(xì)胞SKBR3和BT474中表達(dá)量較低。為了進(jìn)一步研究AL133467.1在乳腺癌中的作用，本文在SKBR3和BT474細(xì)胞中建立過表達(dá)AL133467.1的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過qRT-PCR驗(yàn)證過表達(dá)AL133467.1的細(xì)胞株成功建立(Fig.2A)；進(jìn)一步通過細(xì)胞計數(shù)和平板克隆檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AL133467.1能明顯抑制SKBR3和BT474細(xì)胞的增殖能力(Fig.2B)(P<0.05)和克隆形成能力(P<0.001)(Fig.2C)。

Fig.2 AL133467.1 inhibited the proliferation and colony formation of breast cancer cells (A) AL133467.1 overexpression plasmids and control plasmids were transfected into SKBR3 and BT474 cells, respectively. qRT-PCR assays were used to evaluate AL133467.1 expression levels in each group, vs Vector, ****P<0.0001. (B) The proliferation and (C) Colony numbers of breast cells above were measured by MTS assays and colony formation assay, vs Vector, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001

2.3 過表達(dá)AL133467.1能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲

為了進(jìn)一步研究AL133467.1對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，本文用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AL133467.1能明顯抑制SKBR3和BT474細(xì)胞的遷移能力(Fig.3A)；進(jìn)一步采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，相比于對照組，在SKBR3和BT474細(xì)胞中過表達(dá)AL133467.1侵襲能力下降了92.3%和93.2% (Fig.3B)。

Fig.3 Overexpression of AL133467.1 inhibits the migration and invasion of SKBR3 and BT474 cells (A) Wound Healing assays detected the migration ability of SKBR3 and BT474 cells after overexpression of AL133467.1. (B) Transwell assays were used to show the number of invasion cells, vs Vector, ****P<0.0001

2.4 AL133467.1靶向調(diào)控miR-661表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力

為了闡明AL133467.1在乳腺癌中的作用機(jī)制，本文通過在線網(wǎng)站miRDB(http://mirdb.org/)預(yù)測可能與AL133467.1靶向結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)AL133467.1可能與miR-661存在2個結(jié)合位點(diǎn)(Fig.4A)；進(jìn)一步采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-661在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、T47D、BT549、SKBR3、HCC1937、BT474、MCF7中的表達(dá)量分別是乳腺上皮細(xì)胞MCF10A的5.37倍、3.97倍、7.19倍、8.94倍、6倍、8.14倍,和6.02倍(Fig.4B)；Kaplan-Meier 生存分析顯示，miR-661高表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后不良呈正相關(guān)(Fig.4C)；為了觀察AL133467.1與miR-661的相互作用，本文分別構(gòu)建了野生型AL133467.1或具有miR-661靶向位點(diǎn)缺失突變的AL133467.1的熒光素酶報告基因載體，與miR-661 mimics或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，miR-661 mimics能明顯抑制野生型報告基因的熒光素酶活性，而對突變型的報告基因的熒光素酶報告的活性無明顯影響(Fig.4D)；此外，本文用qRT-PCR方法在過表達(dá)AL133467.1的乳腺癌細(xì)胞中檢測miR-661的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)AL133467.1后,乳腺癌細(xì)胞SKBR3和BT474細(xì)胞中miR-661表達(dá)分別是相應(yīng)對照組的0.81倍和0.69倍(Fig.4E)；為了進(jìn)一步觀察miR-661在AL133467.1抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲中的作用，本文在SKBR3和BT474細(xì)胞中過表達(dá)AL133467.1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步過表達(dá)miR-661，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-661能明顯消除過表達(dá)AL133467.1的抑制侵襲作用(Fig.4F)。

Fig.4 AL133467.1 inhibited breast cancer invasion by specifically regulating miR-661 (A) Schematic illustration of the interaction between AL133467.1 and miR-661 predicted with miRDB (http://mirdb.org/custom.html). (B) The expression of miR-661 was determined by qRT-PCR in breast cancer cells, vs MCF10A, ***P<0.001, ****P<0.0001. (C) Kaplan-Meier analysis indicated correlation between high miR-661 levels and poor overall survivals in breast cancer patients. (D) Luciferase activity indicated that miR-661 targeted AL133467.1, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001. (E) The relative expression of miR-661 was detected after overexpression of AL133467.1, vs Vector, ****P<0.0001. (F) Ectopic expression of miR-661 diminished the effects of AL133467.1 overexpression on the invasion of SKBR3 and BT474 cells, ***P<0.001, ****P<0.0001

2.5 AL133467.1通過與miR-661相互作用促進(jìn)酪氨酸激酶2傳感器的表達(dá)

為了探討AL133467.1在乳腺癌細(xì)胞中的下游調(diào)控機(jī)制，本文采用在線數(shù)據(jù)庫miRDB(http://mirdb.org/)預(yù)測miR-661的可能靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-661與TOB2的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)(CCCAGGCA)(Fig.5A)；為了進(jìn)一步研究AL133467.1是否作為內(nèi)源性RNA與TOB2競爭結(jié)合miR-661，本文在SKBR3和BT475細(xì)胞中單獨(dú)過表達(dá)AL133467.1，或同時過表達(dá)AL133467.1和miR-661檢測TOB2的mRNA和蛋白質(zhì)水平，qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)過表達(dá)AL133467.1能明顯上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中TOB2的mRNA水平，較對照組相比上調(diào)了14.4倍和18.1倍，而在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步過表達(dá)miR-661能消除過表達(dá)AL133467.1引起的TOB2的mRNA水平上調(diào)，分別是對照組的0.17倍和0.18倍(Fig.5B)；Western印跡顯示同樣的結(jié)果(Fig.5C)；以上結(jié)果提示，在乳腺癌細(xì)胞中AL133467.1可作為miR-661的內(nèi)源性競爭RNA促進(jìn)TOB2的表達(dá)。

Fig.5 AL133467.1 regulated the expression of TOB2 by interacting with miR-661 (A) Schematic illustration of the binding site of miR-661 and TOB2 mRNA 3′UTR. (B) miR-661 mimics was transfected into SKBR3 and BT474 cells together with AL133467.1 overexpression plasmids. qRT-PCR assays were performed to evaluate TOB2 expression in these cells, vs Vec, ****P<0.0001. (C) Western blotting assays were used to measure TOB2 expression levels in each group

3 討論

長非編碼RNA是ncRNAs的主要組成部分，通過哺乳動物的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA基因的數(shù)量可達(dá)蛋白質(zhì)編碼基因的3倍[11]。lncRNA能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的基本過程，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控以及關(guān)鍵亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或隔間的支架中發(fā)揮關(guān)鍵作用，lncRNA能識別細(xì)胞中的各種分子靶標(biāo)，能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，有助于核結(jié)構(gòu)形成，并協(xié)助轉(zhuǎn)錄和翻譯因子具有正確的靶向性[12-14]。此外，lncRNA在人類疾病中至關(guān)重要，例如癌癥、感染和發(fā)育障礙等。迄今為止，lncRNA被發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、生長和凋亡等細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15-16]。大量研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以執(zhí)行多種功能，包括順式或反式的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)、核結(jié)構(gòu)域的組織或RNA分子的調(diào)節(jié)[17]。反式作用的lncRNA可能通過調(diào)節(jié)其直接結(jié)合的蛋白質(zhì)或RNA的活性或豐度發(fā)揮作用。lncRNA還能通過堿基配對相互作用調(diào)節(jié)與之結(jié)合的其他RNA的豐度或活性，它可以調(diào)節(jié)microRNA (miRNA)的活性，充當(dāng)相互競爭的內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNAs)或天然的microRNA“海綿”，減少對其靶基因的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，LINC01234可作為一種ceRNA，靶向miR-204-5p調(diào)節(jié)核心結(jié)合因子, β 亞基(core-binding factor subunit beta, CBFB)的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[18]。在骨肉瘤中，DANCR通過作為miR-335-5p和miR-1972的“分子誘餌”，促進(jìn)Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated protein kinase-1, ROCK1)介導(dǎo)的腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移[19]。在乳腺癌中，SNORD3A作為miR-185-5p的競爭性內(nèi)源性RNA，導(dǎo)致尿苷單磷酸合成酶(uridine monophosphate synthetase, UMPS)蛋白質(zhì)上調(diào)，特異性增加乳腺癌細(xì)胞對5-FU的化療敏感性[20]。本文從TCGA(The cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA AL133467.1在乳腺癌組織中低表達(dá)，并且與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)。AL133467.1位于14號染色體上，全長993 bp，關(guān)于AL133467.1在乳腺癌中的相關(guān)研究暫未見到報道。本研究為了驗(yàn)證TCGA(The cancer genome atlas)數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，利用qRT-PCR檢測了乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中AL133467.1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AL133467.1在乳腺癌細(xì)胞中明顯低表達(dá)；并且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AL133467.1能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AL133467.1與miR-661存在2個結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報告基因檢測證實(shí)，AL133467.1可通過預(yù)測的2個結(jié)合位點(diǎn)與miR-661特異性結(jié)合。同時，在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)AL133467.1能明顯抑制miR-661的表達(dá)。microRNA是長度在20～22 nt的非蛋白質(zhì)編碼小RNA，參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等多種生理過程，它們通過與mRNA的3′ UTR相互作用促進(jìn)其降解或抑制其翻譯，發(fā)揮抑癌因子或致癌基因的作用[21-22]。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-661在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)miR-661高表達(dá)提示乳腺癌患者的預(yù)后不良，并且過表達(dá)miR-661能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)AL133467.1對乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力的抑制作用。以上結(jié)果提示，AL133467.1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用是通過靶向調(diào)控miR-661的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

為了進(jìn)一步研究miR-661的下游靶基因，通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-661與TOB2的3′ UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。TOB2是 Tob/BTG 家族成員之一，據(jù)報道，TOB2在多種腫瘤中發(fā)揮作用，被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤抑制因子[23-24]。本文發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AL133467.1能明顯上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中TOB2的mRNA和蛋白質(zhì)水平，而過表達(dá)miR-661能逆轉(zhuǎn)這種作用。綜上所述，AL133467.1可作為miR-661的內(nèi)源性競爭性RNA上調(diào)TOB2的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究為以lncRNA為治療靶點(diǎn)的乳腺癌的預(yù)防和治療策略提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。