表沒食子兒茶素沒食子酸酯對豬精液常溫保存效果的影響

張凌蛟，張 眉，呂東良，劉偉東，任毅杰，趙夢潔，陳美杰，胡建宏*

(1. 西北農(nóng)林科技大學，陜西 楊凌 712100；2.陜西省漢中市鎮(zhèn)巴縣漁渡鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)綜合服務站，陜西 鎮(zhèn)巴 723600；3.陜西省畜牧技術推廣總站，陜西 西安 710016)

為了提高種公豬的生產(chǎn)性能，人工授精技術成為生豬養(yǎng)殖必不可少的關鍵技術，而精液保存是人工授精技術的核心環(huán)節(jié)。精液保存依據(jù)保存溫度的不同又可分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存，其中常溫保存是生產(chǎn)實踐中應用最為廣泛的保存方式。在低溫環(huán)境下，精子的代謝水平降到最低，但仍會產(chǎn)生ROS，而過量ROS能夠引起脂質(zhì)過氧化，進而破壞對維持精子功能至關重要的膜的完整性，并導致精子活率下降。目前的研究表明，稀釋液中添加外源性的抗氧化劑可以有效降低ROS對精子膜的氧化損傷，從而提高精液品質(zhì)。Li等研究報道，低聚青花素能夠有效清除自由基和ROS，顯著提高豬精液總抗氧化能力。侯震坤研究表明，淫羊藿苷能夠有效防止豬精液在常溫保存時受到氧化損傷。任發(fā)的研究指出，鞣花酸對豬精液常溫保存效果起到了積極的作用。另外，Zhu等研究報道，白藜蘆醇能夠顯著提高精子抗氧化的防御系統(tǒng)功能；Tian等研究發(fā)現(xiàn)，丹參酸A能夠增強豬精液總抗氧化能力。

兒茶素作為一種天然酚類物質(zhì)，具有抗氧化的作用，而兒茶素中的EGCG更具有抗菌、抗炎及抗癌作用，并且具有較強的清除活性氧能力及金屬螯合特性。謝東淇研究指出，在豬精液稀釋液中加入茶多酚作為外源抗氧化劑，可以有效提高常溫保存精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，有效抵御過量ROS對精子的傷害。趙琦研究認為，將沒食子酸加入豬精液稀釋液中可以起到較好的抗氧化效果。另外，Bucci等研究顯示，EGCG與白藜蘆醇配伍，可提高冷凍-解凍后豬精子活率和頂體完整率，明顯提高豬精子的抗凍效果；Tvrda等指出，牛冷凍精液稀釋液中添加表兒茶素可以顯著減少脂質(zhì)過氧化及DNA氧化損傷，提高冷凍-解凍后精子活力；Bucci等認為，犬冷凍精液稀釋液中添加EGCG能夠有效改善犬精子的運動性能，提高冷凍-解凍后精子活率和頂體完整性。因此，EGCG能夠有效地減緩精液保存時精子所遭受的氧化損傷，并保護其膜完整性，從而提高精液品質(zhì)。但是，目前關于EGCG對動物冷凍精液保存的相關研究較多，而在豬精液常溫保存的方面研究較少，所以本試驗旨在研究不同濃度EGCG對常溫保存豬精液的影響，為豬精液常溫保存提供應用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 精液 本試驗采用的精液均來自于陜西楊凌秦亥旺養(yǎng)殖場，用手握法采集3頭14月齡的健康長白公豬精液。精液采集時間固定于早上8：00-9：00，僅收集射精中段精子富集部分，30 min內(nèi)于墊有3層濾紙的保溫杯中送回實驗室檢測原精品質(zhì)，只有氣味及顏色正常、鏡檢后活率大于80%、密度為2×10～4×10mL為合格原精，檢測合格后方可用于后續(xù)試驗。

1.1.2 藥品和試劑 表沒食子兒茶素沒食子酸酯，分析標準品，純度≥98%，上海源葉生物有限公司生產(chǎn)；葡萄糖(分析純)、檸檬酸(分析純)等為國產(chǎn)分析純試劑；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(北京索萊寶科技有限公司)、FITC-PNA(1 MG，Sigma)、DAPI(10 mL，Solarbio)。

1.1.3 主要儀器設備 豬精液檢測系統(tǒng)CASA(HVIEW-SSA V8.0)，倒置熒光顯微鏡，立式壓力蒸汽滅菌器，17 ℃恒溫箱，離心機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將不同濃度EGCG添加到豬精液常溫保存基礎稀釋液中，其中，添加0 μmol/L(即不添加)EGCG組作為對照組；添加EGCG的處理組作為試驗組，其添加濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L和50 μmol/L，每組有6個重復。

1.2.2 溶液配制 基礎稀釋液：按照配方準確稱取氯化鉀、Tris、D-葡萄糖等試劑于滅菌燒杯中，隨后向燒杯中添加1 L雙蒸水。

EGCG溶液的配制：稱取20 mg EGCG，充分溶解于10 mL雙蒸水，配制成2 mg/mL的溶液，分裝于1.5 mL滅菌離心管中，用封口膜密封，錫箔紙包裹后-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

原精檢驗合格后，預熱稀釋液并根據(jù)精子密度確定稀釋比例。先將稀釋液緩緩加入原精中按照1：1的比例進行稀釋；平衡30 s后繼續(xù)加入稀釋液以達到所需濃度；混合均勻后進行分裝，并置于17 ℃恒溫箱中避光保存，每12 h緩慢翻動一次。

1.3 精液質(zhì)量檢測

1.3.1 精子活率 精子活率采用豬精液檢測系統(tǒng)CASA(HVIEW-SSA V8.0)對常溫保存第1、3、5天的精子活率進行檢測。用移液槍吸取100 μL保存于17 ℃恒溫箱中的精液，移入到滅菌的1.5 mL離心管中，于37 ℃水浴5 min；將載玻片與蓋玻片37 ℃預熱。將載玻片放置于恒溫載物臺，取10 μL精液滴加于載玻片上，蓋上蓋玻片，調(diào)節(jié)顯微鏡以獲得清晰圖像，并用CASA系統(tǒng)進行檢測計算。

1.3.2 質(zhì)膜完整率 本試驗采用SYBR-14/PI熒光染色法對豬精液常溫保存第1、3、5天的精子質(zhì)膜完整率進行檢測。

1.3.3 頂體完整率 花生凝集素-異硫氰酸熒光素法染色檢測豬精液常溫保存第1、3、5天的精子頂體完整率。

1.3.4 CAT活性 鉬酸銨比色法原理檢測豬精液常溫保存第1、3和5天的CAT活性，比色波長為405 nm，相關操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.3.5 ROS水平 DHE-ROS活性氧檢測檢測豬精液常溫保存第1、3和5天的CAT活性，相關操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.3.5 SOD活性 氮藍四唑(NBT)光化還原法檢測豬精液常溫保存第1、3和5天的SOD活性，相關操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對常溫保存豬精子活率的影響

豬常溫保存精液稀釋液中添加不同濃度EGCG對精子活率的影響見表1所示。由表1可知，在保存1～5 d時，對照組與稀釋液中添加50 μmol/L EGCG組相比，精子活率無顯著差異(>0.05)。但是，20、30 μmol/L EGCG組精子活率在保存1～5 d時均顯著高于其他處理組和對照組(<0.05)，且保存到第5天時20、30 μmol/L EGCG組精子活率分別達到78.36%、76.97%。因此，稀釋液中添加EGCG對常溫保存的豬精子活率具有積極作用，且其最適添加量為20 μmol/L。

表1 豬精液常溫保存添加EGCG后的精子活率Table 1 The sperm motility of boar after adding EGCG in normal temperature

2.2 EGCG對豬精液常溫保存精子質(zhì)膜完整率的影響

豬精子質(zhì)膜完整性檢測結(jié)果見表2和圖1。由表2可知，在保存2～4 d，添加 EGCG的處理組精子質(zhì)膜完整率顯著高于對照組(<0.05)。保存1～5 d，添加20、30 μmol/L EGCG組的精子質(zhì)膜完整率顯著高于其它組(<0.05)，且保存到第5天時質(zhì)膜完整率分別達到74.17%、73.99%。因此，稀釋液中添加一定濃度的EGCG對精子質(zhì)膜具有保護作用，且其最適添加量為20 μmol/L。

表2 豬精液常溫保存添加EGCG后的精子質(zhì)膜完整率Table 2 The plasma membrane integrity of boar sperm after adding EGCG in normal temperature

圖1 豬精子質(zhì)膜完整性檢測SYBR-14染色呈綠色熒光代表質(zhì)膜完整的精子，PI染色呈紅色熒光代表質(zhì)膜破損的精子。Scale bars=100 μmFig.1 Detection of boar sperm plasma membrane integrity The green fluorescence stained by SYBR-14 represents sperm with intact plasma membrane, and red fluorescence stained by PI represents sperm with damaged plasma membrane.Scale bars=100 μm

2.3 EGCG對常溫保存豬精子頂體完整率的影響

豬精子頂體完整性檢測結(jié)果見表3和圖2。由表3可知，在保存第1、2、5天時，添加EGCG的處理組，精子頂體完整率均顯著高于對照組(<0.05)。添加20、30 μmol/L EGCG后，保存第1～5天的頂體完整率均顯著高于其它組(<0.05)，第5天時頂體完整率分別為63.09%和62.25%。因此，稀釋液中添加一定濃度的EGCG對精子頂體具有保護作用，且其最適添加量為20 μmol/L。

表3 豬精液常溫保存添加EGCG后的精子頂體完整率Table 3 The acrosome integrity of boar sperm after adding EGCG in normal temperature

圖2 豬精子頂體完整性檢測豬精子細胞核經(jīng)DAPI染色呈藍色熒光，豬精子頂體經(jīng)FITC-PNA染色呈綠色熒光，箭頭標記代表頂體破損的精子，三角標記代表頂體完整的精子。Scale bars=100 μmFig. 2 Detection of boar sperm acrosome integritySperm nucleus is stained by DAPI (blue). Sperm acrosome is stained by FITC-PNA (green). Arrow represents damaged acrosome sperm. Triangle represents intact acrosome sperm.Scale bars=100 μm

2.4 EGCG對常溫保存豬精液中CAT活性的影響

豬精液CAT活性檢測結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，稀釋液中添加不同濃度EGCG保存的第1、3、5天對CAT活性影響趨勢基本相同，所有添加EGCG的處理組CAT活性均高于對照組，其中20 μmol/L EGCG組CAT活性最強，并顯著高于其他組(<0.05)；稀釋液中添加10、30 μmol/L處理組CAT活性僅次于20 μmol/L處理組，并顯著高于其他組(<0.05)。5 μmol/L EGCG組CAT活性顯著高于對照組(<0.05)，但顯著低于10、40 μmol/L組(<0.05)。另外，稀釋液中添加EGCG的第1天豬精液中CAT活性顯著高于第3和第5天(<0.05)，且第3與第5天精液中CAT活性無顯著差異(>0.05)。

圖3 不同濃度EGCG對常溫保存豬精液中CAT活性的影響同一天數(shù)據(jù)間標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖5同F(xiàn)ig. 3 Effects of different concentrations of EGCG on CAT activities in boar semen at room temperature The data with different lowercase letters for the same day demonstrate significant difference (P<0.05), while the same lowercase letters indicate insignificant difference(P>0.05). The same for fig. 5

2.5 EGCG對常溫保存豬精液中ROS水平的影響

豬精液常溫保存第3天ROS水平見圖4。由圖4可知，稀釋液中添加20 μmol/L EGCG保存3 d后，精液中ROS顯著低于其他組(<0.05)；5、10、30、40 μmol/L的EGCG處理后均使精液中ROS水平降低，且與對照組相比差異顯著(<0.05)。另外，在稀釋液中添加5、10、20 μmol/L EGCG時ROS水平逐漸降低，但在添加30、40、50μmol/L EGCG后ROS水平呈現(xiàn)上升趨勢，且50 μmol/L處理組與對照組相比無顯著差異(>0.05)。

圖4 不同濃度EGCG對常溫保存豬精液中ROS水平的影響柱上標相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Fig. 4 Effects of different concentrations of EGCG on ROS level in boar semen at room temperature The same or the absence of letters above the columns indicate insignificant difference (P>0.05), different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05)

2.6 EGCG對豬精液常溫保存SOD活性的影響

常溫保存豬精液SOD活性檢測結(jié)果見圖5。由圖5可知，稀釋液中添加不同濃度EGCG保存的第1、3和5天對SOD活性的影響趨勢基本相同，所有添加EGCG的處理組其SOD活性均高于對照組。其中20 μmol/L EGCG組SOD活性最強，且顯著高于其他組(<0.05)； 30 μmol/L處理組SOD活性僅次于20 μmol/L組，并顯著高于其他組(<0.05)。另外，10、40 μmol/L EGCG處理組SOD活性顯著高于對照組(<0.05)，5、50 μmol/L EGCG處理組也顯著高于對照組(<0.05)，但顯著低于10和40 μmol/L組(<0.05)。稀釋液中添加EGCG常溫保存第1天豬精液中SOD活性顯著高于第3天和第5天(<0.05)，但第3天與第5天之間精液中SOD活性無顯著差異(>0.05)。

圖5 豬精液常溫保存稀釋液中添加EGCG后豬精液SOD活性Fig. 5 SOD activities of boar semen after adding EGCG to the storage diluent of boar

3 討 論

在本試驗中，添加EGCG可以提高常溫保存豬精液的精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率，且添加20 μmol/L EGCG對精液保存效果最好，這與Plaza的研究結(jié)果一致。Plaza報道，在公馬精液常溫保存稀釋液中加入20 μmol/L EGCG保存5 d后的精子活率為65.20%、精子質(zhì)膜完整率為59.88%、頂體完整率為60.30%，顯著高于對照組與其他處理組；Vallorani等研究發(fā)現(xiàn)，豬精液稀釋液中添加40 μmol/L EGCG在15 ℃孵育24 h后精子活率達到74.30%，質(zhì)膜及頂體完整率分別達到93.60%和95.80%；張文宇研究指出，將120 μmol/L羥基酪醇加入豬精液稀釋液中有利于精液的常溫保存，常溫保存第5天時精子活率為50.00%，質(zhì)膜和頂體完整率分別達到50.00%以上和75.00%以上。EGCG與羥基酪醇均是天然的多酚類化合物，對于生物膜的機械性能及生物活性具有保護作用，當EGCG在生物膜中釋放時穩(wěn)定了生物膜中氫鍵的交聯(lián)作用，從而保護了精子質(zhì)膜和頂體的完整性，提高了精子活率。另外，Kaedei等研究發(fā)現(xiàn)，豬冷凍精液稀釋液中添加50 μmol/L EGCG冷凍-解凍后精子活率為50.36%。這可能是由于稀釋液中EGCG的添加改善了細胞膜的流動性，能夠抵御細胞膜的脂質(zhì)過氧化，保護蛋白質(zhì)硫醇基，從而在冷凍過程中保護精子。

本研究結(jié)果表明，稀釋液中添加20 μmol/L EGCG可以有效提高精子的抗氧化能力，常溫保存5 d后的精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達到78.36%、74.17%和63.09%。Tian等研究表明，在豬精液稀釋液中添加30 μmol/L的丹參素可以有效提高精子保存效果，常溫保存5 d后精子活率為72.21%、質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達到60.00%和62.00%以上。本試驗結(jié)果優(yōu)于Tian等的試驗結(jié)果，這可能是因為EGCG作為一種天然抗氧化劑，在精液保存時能夠更好地清除超氧化物陰離子，同時維持細胞表面雙分子層的穩(wěn)定性，從而降低了精子保存所遭受的氧化損傷，提高精子質(zhì)膜的完整性，進而改善并提高了精液品質(zhì)。

另外，本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著稀釋液中EGCG添加量的增加精液品質(zhì)反而下降，40 μmol/L和50 μmol/L EGCG組精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率明顯低于20 μmol/L和30μmol/L EGCG組，表明高濃度EGCG并不能對精子起到理想的保護效果，這與De Amicis等研究結(jié)果相似，其在人精液中加入20 μmol/L的EGCG 37 ℃孵育30 min精子活率達到85%以上，而60 μmol/L EGCG時精子活率不足60%。原因可能是稀釋液中較高濃度的EGCG影響了精子所處稀釋液中微環(huán)境的滲透壓，不僅降低了Bcl2、Akt和Src等調(diào)控蛋白的活性，而且調(diào)控細胞代謝的蛋白磷酸化也受到影響，破壞了精子膜結(jié)構的穩(wěn)定性，從而導致精子活率降低。關于EGCG在細胞水平和分子水平保護精子的具體機理有待進一步深入研究。

在精液的常溫保存過程中，因精子代謝累積產(chǎn)生的過量ROS會對精子造成氧化損傷，而豬精子中大量的不飽和脂肪酸導致精子對ROS十分敏感，致使精子的質(zhì)膜和頂體更易被ROS所破壞，導致精子活率降低，因而研究人員通過在稀釋液中添加抗氧化劑來維持精液保存過程中精子的正常功能。裴玲等證實了沒食子酸(GA)轉(zhuǎn)移電子的能力，確定了沒食子酸可以清除自由基，具有較強的抗氧化能力；趙琦將GA作為外源性抗氧化物加入豬精液常溫保存稀釋液中，發(fā)現(xiàn)添加后抗氧化指標均顯著提高，ROS顯著減少，精液保存質(zhì)量有所改善。本試驗中選用的EGCG 是沒食子兒茶酚與沒食子酸形成的酯，該物質(zhì)表現(xiàn)出良好的抗氧化性，進而保護精子降低氧化損傷，提高精液品質(zhì)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加20 μmol/L的EGCG能夠顯著提高CAT和SOD的活性。在精液常溫保存中，CAT與SOD是清除自由基的重要抗氧化酶，二者對于細胞的氧化損傷有明顯的逆轉(zhuǎn)效果。Lin等發(fā)現(xiàn)EGCG可以阻止細胞內(nèi)過量ROS的產(chǎn)生，保護線粒體免受損傷，這與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明，向稀釋液中添加EGCG可以降低豬精液保存過程中的ROS含量，抵抗外界環(huán)境對精子造成的氧化應激，從而有效防止或者降低氧化應激對精液品質(zhì)造成的不良影響。

4 結(jié) 論

在豬精液常溫保存稀釋液中添加EGCG可以有效提高保存效果，稀釋液中添加20 μmol/L EGCG時效果最好，常溫保存第5天時精子活率可達78.36%，質(zhì)膜完整率和頂體完整率分別達到74.17%和63.09%。