5歲以下喘息患兒ADRβ2、ORMDL3基因SNP與API的相關(guān)性研究

王冰潔?王桂蘭?劉翔騰?林嘉鏢?黃娟

通信作者簡介：王桂蘭，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院兒科主任，兼小兒呼吸內(nèi)科主任。任中山市醫(yī)師協(xié)會(huì)兒科分會(huì)主任委員，中華醫(yī)學(xué)會(huì)變態(tài)反應(yīng)學(xué)分會(huì)兒童過敏和哮喘學(xué)組委員，中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)呼吸學(xué)組哮喘，感染及間質(zhì)性肺病協(xié)作組委員，中國醫(yī)師協(xié)會(huì)內(nèi)鏡分會(huì)兒童呼吸內(nèi)鏡專業(yè)委員會(huì)常委，廣東省胸部疾病協(xié)會(huì)兒童呼吸與介入專業(yè)委員會(huì)副主任委員，廣東省臨床醫(yī)學(xué)會(huì)兒童呼吸專業(yè)委員會(huì)副主任委員，廣東省醫(yī)學(xué)會(huì)變態(tài)反應(yīng)分會(huì)兒童過敏及哮喘學(xué)組副組長，廣東省臨床醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)兒科呼吸專業(yè)委員會(huì)副主任委員，廣東省基層醫(yī)藥學(xué)會(huì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)常委，粵港澳大灣區(qū)兒科基礎(chǔ)呼吸介入聯(lián)盟主席，中珠江兒童哮喘協(xié)作組組長，另任廣東省級(jí)協(xié)會(huì)委員4項(xiàng)及Pediatric Allergy and Immunology編委。獲得廣東省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)三等獎(jiǎng)1項(xiàng)，中山市科技進(jìn)步獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)1項(xiàng)、二等獎(jiǎng)2項(xiàng)、三等獎(jiǎng)1項(xiàng)。主持中山市重大立項(xiàng)2項(xiàng)，主持或參與廣東省立項(xiàng)、中山市重大立項(xiàng)、中山市青年立項(xiàng)、中山市科技局立項(xiàng)、中山市衛(wèi)生局立項(xiàng)等多個(gè)項(xiàng)目。在國外重要期刊、國內(nèi)核心期刊等發(fā)表論文80余篇。

【摘要】 目的 探討腎上腺素能受體β2（ADRβ2）、血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與哮喘預(yù)測指數(shù)（API）陽性嬰幼兒喘息的相關(guān)性。方法 將124例5歲以下喘息患兒分為API陽性組（66例）與API陰性組（58例）。選取兒童哮喘易感基因 SNP位點(diǎn)：ADRβ2 R16G、ORMDL3 rs12603332，采用 TaqMan 探針法對(duì)2組患兒進(jìn)行基因分型，分別比較上述SNP位點(diǎn)在2組間的分布差異。結(jié)果 ORMDL3 rs12603332基因型在API陽性組與API陰性組之間的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 2.524，P > 0.05）。ADRβ2 R16G基因型在API陽性組以AA占比最高，AG次之，GG最少;在API陰性組以AG占比最高，GG次之，AA最少;API陽性組AA占比高于API陰性組（χ2 = 25.358，P < 0.05）。ADRβ2基因型AG和GG是API陽性的保護(hù)因素，與AA比較，AG、GG是API陽性的概率分別為18.8%和6.4%。結(jié)論 ADRβ2 R16G基因型分布在API 陽性與陰性的5歲以下喘息患兒中存在差異，攜帶基因型AA 的喘息患兒或更具進(jìn)展為哮喘的危險(xiǎn)性。ADRβ2或可聯(lián)合 API 作為預(yù)測兒童哮喘的臨床指標(biāo)。ORMDL3 rs12603332基因型或與API預(yù)測哮喘發(fā)生無一致性。

【關(guān)鍵詞】 腎上腺素能受體β2基因;血清類黏蛋白1樣蛋白 3基因;單核苷酸多態(tài)性;哮喘預(yù)測指數(shù)

Correlation between single nucleotide polymorphism of ADRβ2， ORMDL3 and asthma predictive index in wheezing children under 5 years old Wang Bingjie， Wang Guilan， Liu Xiangteng， Lin Jiabiao， Huang Juan. Department of Pediatric Respiratory Medicine， Boai Hospital of Zhongshan， Southern Medical University， Zhongshan 528400， China

Corresponding author， Wang Guilan， E-mail： 53046697@qq.com

【Abstract】 Objective To investigate the correlation between the single nucleotide polymorphism （SNP） of Adrenergic receptor beta 2（ADRβ2） gene， Orosomucoid1-like protein 3（ORMDL3） gene and positive asthma predictive index （API） in wheezing children. Methods One hundred and twenty four wheezing children aged under 5 years old were divided into the positive （n =

66） and negative API groups （n = 58）.The SNP loci of ADRβ2 R16G and ORMDL3 rs12603332 of childhood asthma susceptibility genes were selected. Genotyping was performed between two groups by using TaqMan probe assay. The distribution differences of these SNP loci were compared between two groups. Results There was no significant difference in the genotypes of ORMDL3 rs12603332 between the positive and negative API groups（χ2 = 2.524，P > 0.05）. In the positive API group， the proportion of AA was the highest in ADRβ2 R16G genotype， followed by AG and GG. In the negative API group， the proportion of AG was the highest， followed by GG and AA. The proportion of AA in the positive API group was significantly higher than that in the negative API group（χ2 = 25.358，P < 0.05）. AG and GG genotypes of ADRβ2 was protective factors of positive API. Compared with AA， AG and GG were 18.8% and 6.4% of the probability of positive API. Conclusions The genotypes of ADRβ2 R16G between positive and negative API groups are different in wheezing children under 5 years old， and the wheezing children with AA genotype may have a higher risk of developing asthma. ADRβ2 may be combined with API as a clinical indicator for the diagnosis of childhood asthma.There is no consistency between ORMDL3 rs12603332 and API in predicting asthma.

【Key words】 Adrenergic receptor beta 2 gene; Orosomucoid1-like protein 3 gene; Single nucleotide polymorphism;

Asthma predictive index

喘息是兒童較常見的呼吸道癥狀，5歲以下兒童年齡小、難以正確描述癥狀、難以配合檢查，判斷該年齡段患兒喘息病因及是否會(huì)進(jìn)展為哮喘難度大。臨床上常用哮喘預(yù)測指數(shù)（API）預(yù)測喘息患兒未來進(jìn)展為哮喘的危險(xiǎn)性，目前建議API陽性的5歲以下喘息患兒按嬰幼兒哮喘規(guī)范治療[1]。

哮喘是兒童時(shí)期最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，過敏性疾病患兒的數(shù)量明顯增多，過敏所致兒童哮喘發(fā)病率亦逐年上升，其影響因素復(fù)雜，目前認(rèn)為哮喘基因與環(huán)境因素相互作用是引發(fā)兒童哮喘的原因[2]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）基因與兒童時(shí)期起病的哮喘相關(guān)，本課題組的前期研究顯示ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs12603332位點(diǎn)（ORMDL3 rs12603332）與廣東地區(qū)兒童哮喘的發(fā)生有關(guān)[3]。有研究顯示腎上腺素能受體β2（ADRβ2）基因SNP R16G位點(diǎn)（ADRβ2 R16G）與漢族兒童哮喘的發(fā)病、嚴(yán)重程度及呼吸道重塑有關(guān)[4-5]。但ORMDL3及ADRβ2是否與 API 陽性患兒喘息發(fā)病相關(guān)、是否與 API 在預(yù)測哮喘危險(xiǎn)性方面具有一致性尚未清楚。鑒于此，本研究對(duì)ORMDL3 rs12603332及ADRβ2 R16G與API陽性患兒喘息的相關(guān)性進(jìn)行了探討。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

參考既往研究采用的方法，選取2020年1月至2021年1月于本院小兒呼吸內(nèi)科門診就診的喘息患兒124例為研究對(duì)象并進(jìn)行分組[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡 < 5歲;②有咳嗽、喘息癥狀，聽診雙肺聞及哮鳴音;③排除由先天性呼吸道疾病、氣管異物、支氣管淋巴結(jié)核、胃食管反流等引起的喘息。按API評(píng)估結(jié)果將124例患兒分為API陽性組（66例）和API陰性組（58例）。

API陽性是指在過去 1 年內(nèi)喘息發(fā)作 ≥ 4次，具有以下 1 項(xiàng)主要危險(xiǎn)因素或2項(xiàng)次要危險(xiǎn)因素。主要危險(xiǎn)因素包括：①父母有哮喘史;②經(jīng)醫(yī)師診斷為特應(yīng)性皮炎;③有吸入變應(yīng)原致敏的依據(jù)。次要危險(xiǎn)因素包括：①有食物變應(yīng)原致敏的依據(jù);②外周血嗜酸性粒細(xì)胞 ≥ 4%;③與上呼吸道感染無關(guān)的喘息[6]。不具有任何1項(xiàng)主要危險(xiǎn)因素或2項(xiàng)次要危險(xiǎn)因素為API 陰性。

本研究獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：2017 B1003）。

二、基因組DNA提取及SNP基因型分析

由于124例患兒均為門診就診者，故于喘息發(fā)作期抽取其空腹靜脈血3 mL進(jìn)行基因組DNA提取及SNP基因型分析，患兒家屬對(duì)此知情同意。在抽取的空腹靜脈血中加入0.02 g/mL乙二胺四乙酸（EDTA） 0.4 mL， 用低滲法分離白細(xì)胞， 用酚氯仿提取細(xì)胞基因組DNA。通過TaqMan探針法（Applied Biosystems）進(jìn)行基因型分析，使用Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物及探針序列為：ORMDL3 rs12603332引物序列，正向5′- GAGACTTTCGTGTGACTATG-3′;反向5′- GCAGGTTATGAAACCACATC-3′;ADRβ2 R16G引物序列，正向5′-GAGTGTTCTGGACAC GTGATTCTTA-3′，反向5′-CAGAGGATCGTGTTTA

TATGAAGAATTAA-3′。PCR循環(huán)反應(yīng)條件：50 ℃

預(yù)變性2 min; 95 ℃ 變性10 min， 95 ℃復(fù)性15 s， 60 ℃ 延伸60 s， 循環(huán)40次;72 ℃后延伸5 min。采用ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems/Life Technologies）進(jìn)行擴(kuò)增，然后在ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems/Life Technologies）中進(jìn)行終點(diǎn)讀板。反應(yīng)結(jié)果經(jīng)ABI SDS 2.3軟件分析得出基因型。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用達(dá)格斯提諾檢驗(yàn)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用二元非條件logistic回歸（進(jìn)入法）分析API發(fā)生的獨(dú)立影響因素。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、API陽性組與API陰性組喘息患兒年齡及性別比較

API陽性組與API陰性組的年齡、性別具可比性（P均 > 0.05），見表1。

二、API陽性組與API陰性組喘息患兒基因型分布比較

ADRβ2 R16G基因型在API陽性組以AA占比最高，AG次之，GG最少;在API陰性組以AG占比最高，GG次之，AA最少，AA在API陽性組中的占比高于API陰性組（P < 0.05）。ORMDL3 rs12603332基因型在API陽性組及API陰性組均以CC占比最高，CT次之，TT最少，基因型在2組間分布無差異（P > 0.05），見表2。

三、API陽性影響因素的二元logistic回歸

上述結(jié)果顯示在API陽性及API陰性組間僅ADRβ2 R16G基因型分布存在差異，但既往有研究顯示 ORMDL3基因表達(dá)水平與 API之間呈正相關(guān)[16]。另外，性別、年齡等可能對(duì)API結(jié)果存在影響，故將它們共同納入方程進(jìn)行非條件二元logistic回歸。結(jié)果顯示，ADRβ2 R16G基因型AG和GG是API的保護(hù)因素，與AA比較，AG和GG是API陽性的概率為18.8%和6.4%。

討 論

目前國內(nèi)外對(duì)5歲以下兒童哮喘的診斷及管理尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，5歲以下患兒又因年齡、認(rèn)知的特殊性無法配合肺功能檢查，兒童喘息病因多樣，5歲以下兒童呼吸道結(jié)構(gòu)尚未發(fā)育完善，功能尚不成熟，呼吸道慢性炎癥、呼吸道重塑是否存在仍缺少客觀依據(jù)，因此，在臨床工作中，對(duì)此年齡段哮喘患兒存在漏診、誤診、無法規(guī)范管理等問題[7]。臨床上常用API預(yù)測5歲以下反復(fù)喘息患兒進(jìn)展為哮喘的風(fēng)險(xiǎn)，2000年Castro-Rodríguez等[8]提出 API 的概念，將其用于識(shí)別可能進(jìn)展為哮喘的嬰幼兒，其后API在臨床被廣泛應(yīng)用，目前 API已成為預(yù)測兒童哮喘的有效臨床指標(biāo)，并被寫入兒科教科書及全球哮喘防治創(chuàng)議，5歲以下API陽性患兒被建議接受哮喘規(guī)范管理及治療[6， 9] 。

多項(xiàng)研究顯示ORMDL3基因與兒童哮喘相

關(guān)[10-13]。本課題組前期研究也顯示ORMDL3 rs12603332與廣東地區(qū)兒童哮喘相關(guān)，其基因型CC為兒童哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素[3]。本研究顯示在API陽性組及API陰性組間ORMDL3 rs12603332基因型分布無差異，提示ORMDL3 rs12603332與API預(yù)測哮喘發(fā)生或無一致性，這與前述研究結(jié)果有差異，不能排除以下因素的影響：①按API結(jié)果進(jìn)行分組可能與臨床實(shí)際發(fā)生哮喘不完全一致，部分患兒雖然1年內(nèi)喘息次數(shù) ≥4次，且API陽性，但由于其年齡尚小，呼吸道可塑性大，將來可能不會(huì)進(jìn)展為哮喘;反之，盡管部分患兒1年內(nèi)只發(fā)生1次喘息，其最終卻可能進(jìn)展為哮喘，尚需要長期觀察方能得出結(jié)論。②樣本量不夠大，需要在以后的研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探索。

ADRβ2 R16G是ADRβ2基因位于染色體 5q31上的一個(gè)重要突變位點(diǎn)，研究顯示其與受體下調(diào)失敏、呼吸道高反應(yīng)、哮喘的嚴(yán)重程度以及夜間哮喘的發(fā)生相關(guān)[14]。本研究顯示ADRβ2 R16G基因型AA在API陽性組中的占比高于API陰性組，這與既往ADRβ2 R16G在中國臺(tái)灣地區(qū)喘息人群中基因型分布頻率的報(bào)道不同，不排除哮喘易感基因具有地域性的可能，另外也可能與各地區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)狀況、飲食、生活習(xí)慣、環(huán)境氣候等有關(guān)[15]。在預(yù)測哮喘危險(xiǎn)性方面，此位點(diǎn)與API一致，本研究的logistic回歸分析結(jié)果顯示ADRβ2 R16G基因型AG和GG是API的保護(hù)因素，與AA比較，AG、GG是API陽性的概率分別為18.8%和6.4%，但由于上文提及的樣本量較小原因，尚需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

綜上所述，ADRβ2 R16G基因型分布在API 陽性與陰性的5歲以下喘息患兒中存在差異，與攜帶AG或GG者相比，攜帶AA的喘息患兒或更具進(jìn)展為哮喘的危險(xiǎn)性，ADRβ2 R16G與API預(yù)測哮喘的作用或具有一致性，或可聯(lián)合API作為預(yù)測兒童哮喘的臨床指標(biāo)。ORMDL3 rs12603332在預(yù)測哮喘方面與 API 的一致性雖未能在本研究得到證實(shí)，但由于本研究的樣本量較小，后續(xù)仍應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入探討[16]。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)呼吸學(xué)組，中華兒科雜志編輯委員會(huì). 兒童支氣管哮喘診斷與防治指南. 中華兒科雜志，2016，54（3）：167-181.

[2] Chen Y， Wong G W， Li J. Environmental exposure and genetic predisposition as risk factors for asthma in China. Allergy Asthma Immunol Res，2016，8（2）：92-100.

[3] 王桂蘭，王冰潔，陳德暉，等. 支氣管哮喘患兒ORMDL3基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)其發(fā)病的影響.中華實(shí)用兒科臨床雜志，2015，30（4）： 26-29.

[4] Khan S J， Dharmage S C， Matheson M C， et al. Is the atopic march related to confounding by genetics and early-life environment？ A systematic review of sibship and twin data. Allergy，2018，73（1）：17-28.

[5] 陳虹，劉海沛，鮑一笑，等. 哮喘易感基因多態(tài)性與哮喘預(yù)測指數(shù)陽性嬰幼兒喘息的相關(guān)性. 臨床兒科雜志，2013，31（6）：547-550.

[6] Castro-Rodriguez J A， Cifuentes L， Rodríguez-Martínez C E. The asthma predictive index remains a useful tool to predict asthma in young children with recurrent wheeze in clinical practice. J Allergy Clin Immunol，2011，127（4）：1082-1083.

[7] Mokhallati N， Schuler C L， Thomas S， et al. Use of the composite asthma severity index in a pediatric subspecialty clinic. Ann Allergy Asthma Immunol，2021，126（6）：702-706.

[8] Castro-Rodríguez J A， Holberg C J， Wright A L， et al. A clinical index to define risk of asthma in young children with recurrent wheezing. Am J Respir Crit Care Med，2000，162（4 Pt 1）：1403-1406.

[9] Global Initiative for Asthma. Global strategy for asthma management and prevention： update 2021. [2021-11-10].https：//ginasthma.org/wp-content/uploads/2021/05/GINA-Main-Report-2021-V2-WMS.pdf.

[10] Luthers C R， Dunn T M， Snow A L. ORMDL3 and asthma： linking sphingolipid regulation to altered T cell function. Front Immunol，2020，11：597945.

[11] James B， Milstien S， Spiegel S. ORMDL3 and allergic asthma： from physiology to pathology. J Allergy Clin Immunol，2019，144（3）：634-640.

[12] Li Y， Cao L， Yu Q， et al. Association between peripheral blood mononuclear cell ORMDL3 expression and the asthma predictive index in preschool children. J Int Med Res，2019，47（8）：3727-3736.

[13] Kelly R S， Chawes B L， Guo F， et al. The role of the 17q21 genotype in the prevention of early childhood asthma and recurrent wheeze by vitamin D. Eur Respir J，2019，54（4）：1900761.

[14] Wang X， Li Q， Liu R， et al. ADRB2 Arg16Gly polymorphism and pulmonary function response of inhaled corticosteroids plus long-acting beta agonists for asthma treatment： a systematic review and meta-analysis. Can Respir J，2018，2018：5712805.

[15] Lee Y L， Wang S T， Tsai C H， et al. Associations of beta2-adrenergic receptor genotypes and haplotypes with wheezing illness in Taiwanese schoolchildren. Allergy，2009，64（10）：1451-1457.

[16] 李亞琴. 5歲以下喘息兒童ORMDL3基因表達(dá)及哮喘預(yù)測指數(shù)在臨床中的應(yīng)用研究. 上海：上海交通大學(xué)，2015.

（收稿日期：2021-11-30）

（本文編輯：洪悅民）