復(fù)方氧化鋅搽劑微生物限度檢查方法學(xué)研究

李立娜（天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院，天津 300400）

復(fù)方氧化鋅搽劑是天津市兒童醫(yī)院的院內(nèi)制劑品種，該制劑由氧化鋅、氯霉素、醋酸曲安奈德及植物油組成，具有對(duì)皮膚保護(hù)和收斂的功效，用于治療化膿性皮膚病、膿泡病、毛囊炎、病毒性皮膚病、帶狀皰疹、單獨(dú)皰疹急性滲出性濕疹、過敏性皮膚病等[1]。筆者根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版四部附錄“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查”項(xiàng)下規(guī)定，建立了該制劑微生物限度檢查方法[2]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該制劑具有極強(qiáng)的抑菌作用且不易消除，本文通過聯(lián)合采用不同的處理方法，可有效消除其抑菌性，使檢測(cè)結(jié)果更接近于該制劑的真實(shí)染菌狀態(tài)，客觀地反映了其微生物污染程度。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LMQ.C新華立式滅菌器、天馬TD10002電子天平、DHG-9203A鼓風(fēng)干燥箱、GHX-9270B隔水式恒溫培養(yǎng)箱、LRH-250生化培養(yǎng)箱。

1.2 材料 培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，均購自北京三藥科技有限公司，卵磷脂（Sigma公司），聚山梨酯80（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），均已通過培養(yǎng)基適用性檢查并在有效期內(nèi)使用。

試驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]（均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院），菌株代次為第3代。

樣品：復(fù)方氧化鋅搽劑（天津市兒童醫(yī)院，規(guī)格為30g，批號(hào)20210601、20210602、20210603）。

2 方法與結(jié)果[3-4]

2.1 溶液制備

2.1.1 供試液制備 取本品2瓶，混勻，稱取10g，加至溶化的5g司盤80、10g聚山梨酯80和3g單硬脂酸甘油酯無菌混合物中，充分乳化，加含有5%聚山梨酯80與0.5%卵磷脂的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1∶10供試液。取1∶10供試液10ml，加含有5%聚山梨酯80與0.5%卵磷脂的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1∶100供試液。

2.1.2 菌液制備 按《中國(guó)藥典》2020年版四部附錄1105項(xiàng)下方法，分別制備每1ml含菌數(shù)為50-100cfu的菌懸液，備用。

2.2 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果

2.2.1 需氧菌總數(shù) 取2.1.1項(xiàng)下1∶100供試液1ml，用100ml含2%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋，全量薄膜過濾，同時(shí)用800ml含2%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分8次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入制備好的枯草芽孢桿菌1ml（50-100cfu），取膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，設(shè)定溫度為32.5℃，培養(yǎng)3天；按上述方法同法操作金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。同法測(cè)定菌液組和供試液對(duì)照組菌落數(shù)。

2.2.2 霉菌和酵母菌總數(shù) 取2.1.1項(xiàng)下1∶10供試液9.9ml，分別加入制備好的不大于1000cfu的白色念珠菌、黑曲霉兩種試驗(yàn)菌各0.1ml，混勻，取1ml注入平皿中，平行制備兩皿，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝，設(shè)定溫度為22.5℃，培養(yǎng)5天，測(cè)定試驗(yàn)組菌落數(shù)，同法測(cè)定菌液組和供試品對(duì)照組菌落數(shù)。

2.2.3 回收率 按《中國(guó)藥典》2020年版四部1105項(xiàng)下規(guī)定，回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)，回收率比值應(yīng)在0.5-2之間。試驗(yàn)結(jié)果顯示，各試驗(yàn)菌回收率比值均達(dá)到試驗(yàn)要求。結(jié)果見表1、表2。

表1 1:100供試液需氧菌總數(shù)回收率比值

表2 1:10供試液霉菌和酵母菌總數(shù)回收率比值

2.3 控制菌方法適用性試驗(yàn)及結(jié)果

2.3.1 銅綠假單胞菌 取1∶10供試液10ml置于1500ml含有5%聚山梨酯80和0.5%卵磷脂胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入銅綠假單胞菌1ml（10-100cfu），混勻，32.5℃下培養(yǎng)18小時(shí)，作為供試品組。同時(shí)以10ml pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液代替供試品，同法制備銅綠假單胞菌陰性對(duì)照組。另取銅綠假單胞菌1ml（10-100cfu），同法操作，作為陽性對(duì)照組。取上述培養(yǎng)物分別劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，32.5℃下培養(yǎng)18小時(shí)后觀察。

2.3.2 金黃色葡萄球菌 取1∶10供試液10ml，每1ml分別用100ml含2%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋，全量薄膜過濾，同時(shí)用800ml含2%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分8次沖洗，并在最后一張膜上最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌1ml（10-100cfu），取10張膜置于同一1000ml含有5%聚山梨酯80和0.5%卵磷脂胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，32.5℃下培養(yǎng)18小時(shí)，作為供試品組。同時(shí)以10ml pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液代替供試品，同法制備金黃色葡萄球菌陰性對(duì)照組。另取金黃色葡萄球菌1ml（10-100cfu），同法操作，作為陽性對(duì)照組。取上述培養(yǎng)物分別劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，32.5℃下培養(yǎng)18小時(shí)后觀察。

2.3.3 控制菌檢查結(jié)果 陽性對(duì)照組與供試品組均有菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)，菌落形態(tài)符合相應(yīng)菌落特征。結(jié)果見表3。

表3 控制菌檢查結(jié)果

2.4 試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，復(fù)方氧化鋅搽劑可以采用中和法、培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)合薄膜過濾法測(cè)定需氧菌總數(shù)，采用中和法測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)，采用中和法聯(lián)合培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定銅綠假單胞菌，采用中和法、培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)合薄膜過濾法進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢查。采用該方法對(duì)3批樣品進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。結(jié)果見表4。

表4 復(fù)方氧化鋅搽劑微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

氯霉素屬廣譜抑菌抗生素，廣泛應(yīng)用于各種敏感菌感染的治療，氧化鋅具有收斂和抑菌作用。該制劑品種廣泛應(yīng)用于臨床，兩種成分制備的復(fù)方氧化鋅搽劑具有極強(qiáng)的抑菌性。筆者查閱文獻(xiàn)，暫未發(fā)現(xiàn)同時(shí)消除上述兩種成分抑菌性的微生物限度檢查方法的文獻(xiàn)報(bào)道。本文研究發(fā)現(xiàn)氯霉素采用稀釋法或薄膜過濾即可消除其抑菌性；氧化鋅因?yàn)槭枪腆w，必須聯(lián)合采用中和法才可有效消除其抑菌性，單獨(dú)采用某一種方法，均無法有效消除其抑菌性，必須聯(lián)合多種方法。該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為該品種的微生物限度檢查方法，同時(shí)對(duì)藥檢人員具有一定的參考價(jià)值。