單核/巨噬細胞在尿源性膿毒血癥發(fā)病機制中的作用研究進展

楊逸銘 賴良海 關登海 柳建軍

膿毒血癥(sepsis)是由于機體對外來炎性因子反應失調引起的全身炎性反應綜合征，每年全球重癥膿毒血癥患者高達180萬[1]。李恭會等[2]指出尿源性膿毒血癥發(fā)生率為0.5%～5%，其中膿毒血癥性休克患者的病死率為28.3%～41.4%。尿源性膿毒血癥起病初期癥狀不明顯、進展迅速、病情兇險、病死率極高[3]。大腸埃希菌是尿源性膿毒血癥最常見的革蘭氏陰性菌致病菌，主要由其細胞壁上的脂多糖致病(lipopoly saccharide,LPS)[4]。LPS誘導Toll樣受體(toll liker eceptors,TLRs)信號通路激活單核/巨噬細胞內信號傳導，引起宿主細胞因子失衡、免疫細胞功能改變及調亡，最終可能引起患者休克或死亡[5]。當微生物LPS入侵機體后，首先激活機體的單核/巨噬固有免疫反應，早期爆發(fā)性釋放使機體的固有免疫和特異性免疫系統(tǒng)使機體發(fā)生重要變化，如單核/巨噬細胞功能改變、細胞因子失衡、免疫細胞凋亡等，提示患者已經進入尿源性膿毒血癥免疫抑制狀態(tài)[6]。至今無特效免疫治療方法，尿源性膿毒血癥造成患者多器官功能衰竭需要ICU監(jiān)護治療，對患者造成重大經濟損失、嚴重危害患者的生命健康。目前對于尿源性膿毒血癥主要在早期診斷、早期干預及有效的對癥治療。因此，對單核/巨噬細胞在尿源膿毒血癥機制的研究進行綜述。有助于臨床治療尿源性膿毒血癥、提高患者生存率提供可靠依據。

1 目前尿源性膿毒血癥的研究

尿源性膿毒血癥主要是上尿路梗阻引起泌尿系感染，引起梗阻最常見病因是輸尿管結石。當宿主固有免疫系統(tǒng)的模式識別病原體或損傷相關分子模式產生促炎細胞因子時，膿毒血癥復雜的發(fā)病機制就開始了。首先侵入病原體啟動先天免疫系統(tǒng)迅速發(fā)展適應性免疫系統(tǒng)，最后導致免疫抑制。膿毒血癥由第三個國際共識的膿毒癥和膿毒性休克(膿毒癥-3)定義為“由于宿主對感染的反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙”[7]。但膿毒血癥診斷的臨床標準在重癥醫(yī)學科之外，qSOFA評分用于敗血癥三個標準組成：精神狀態(tài)改變(格拉斯哥昏迷評分)、收縮壓≤100 mm Hg和呼吸頻率≥22次/min。如果符合≥2項標準，患者被視為高風險患者[8]。但由于尿源性膿毒血癥初期癥狀不明顯、病情進展快、病情兇險。所以早期診斷，早期目標導向治療顯者尤為重要，包括血漿和泌尿道中抗菌藥物的最佳藥效暴露；還要重視尿路并發(fā)癥的識別和控制，如觀察患者血壓、呼吸頻率、脈搏、肢體溫度及神志變化。另外，臨床中常用早期感染指標包括有降鈣素原(PCT)、白細胞計數、C-反應蛋白(CRP)、血小板、纖維蛋白原、D-二聚體、白細胞介素6等炎性指標[9]。近幾年，有學者提出血單核細胞計數的下降與尿源性膿毒血癥的發(fā)生具有密切關系，早期血單核細胞計數的下降對于早期尿源性膿毒血癥的診斷有較大價值[10]。

2 單核/巨噬細胞發(fā)育及分布

嬰幼兒時期，單核/巨噬細胞大部分來源于骨髓造血干細胞，逐漸發(fā)育各時期單核細胞后，進入血流循環(huán)定居不同器官組織并有不同的命名。學者提出單核吞噬細胞系統(tǒng)(mono-nuclear phagocyte system,MPS)在機體狀態(tài)下分布在組織中的巨噬細胞均由單核細胞發(fā)育發(fā)展而來[11]。單核細胞在免疫系統(tǒng)中是免疫效應細胞，具有分泌炎性因子功能以及表明表達受體分子識別模式。正常機體循環(huán)在血液、骨以及肝脾中的單核細胞是不能增殖的[12,13]；機體被感染初期時，單核細胞并在趨化因子作用下從血液循環(huán)遷移至感染灶，并在遷移過程中主要分化發(fā)育成樹突狀細胞(dendritic cell，DC)與巨噬細胞。有國外研究發(fā)現單核細胞在感染性抗原及受體識別模式作用下遷移并分化成巨噬細胞和DC[12]。隨著對巨噬細胞深入研究發(fā)現定居外周組織的巨噬細胞具一定增殖與自我更新能力。目前按起源巨噬細胞的可分為由髓系干細胞發(fā)育、卵黃囊衍生、自我更新增殖。局部巨噬細胞自我增殖，猜測是一部分骨髓造血干細胞脫離骨髓微環(huán)境進入外周組織器官，受到細菌感染、受傷等因素刺激后增殖分化，進一步發(fā)育成巨噬細胞[14]。當機體受到感染，單核/巨噬細胞首先誘導、吞噬及消滅外來入侵病原體，進一步釋放細胞因子啟動免疫反應。

3 單核/巨噬細胞與尿源性膿毒血癥促炎期

在尿源性膿毒血癥中，宿主主要通過定位于炎性細胞膜和內膜上的Toll樣受體(TLRs)。直至今日發(fā)現的TLRs有13種，且一種Toll樣受體能夠識別多種受體的配基。在哺乳動物中，TLR4是識別細菌的脂多糖的主要受體[15,16]，并且TLR4主要表達于巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞等免疫細胞。當內毒素入血后激活患者單核巨噬細胞，提呈抗原及誘導特異性T淋巴細胞活化，起動機體免疫功能。首先微生物內毒素激活激活血漿中結合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)，其與LBP結合為LPS-LBP復合物。LBP與LPS的結合取決于濃度，最終以LBP介導LPS轉運到單核巨噬細胞膜的表面。另外，LBP可以分解LPS為單體并與分化簇14(cluster of differentiation 14，CD14)結合成CD14-LPS-LBP三聯復合物。但由CD14沒有跨膜區(qū)和胞漿內段，CD14-LPS-LBP三聯復合物與TLR4結合并轉入細胞內。LPS-LBP-CD14三分子復將活化信號傳入細胞內。期間需要單核巨噬細胞輔助分子髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2，MD-2)的協同作用下，結合形成TLR4-MD-2-LPS復合物，再以對稱的方式形成二聚體激活促炎癥信號通路[17]。

二聚體形成后，標志著LPS-TLR4-MD-2途徑被激活。TLR4通過膜受體Toll/IL-1受體結構域(TIR結構域)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的TIR結構域相結合，它們互相作用后啟動細胞內信號傳導鏈。引起下游核因子κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)等活化。其中白介素受體相關激酶(IRAK-1/4)與TNF受體相關因子6(TRAF-6)被激活。在正常情況下，NF-κB與NF-κB抑制蛋白(IκB)形成復合物存在于單核巨噬細胞漿中。當機體受到微生物LPS信號刺激后，引起IRAK-1/4和TRAF-6I活化并作用于κB激酶復合體(IKK)將IκB磷酸化。最終使NF-κB與IκB分解，其中游離的NF-κB激活并通過核膜進入胞核。產生大量的促炎性細胞因子如：TNF-α、IL-6、IL-8等促炎細胞因子。TNF-α和IL-1的產生并在粒細胞集落刺激因子和干擾素γ協同作用下容易使尿源性膿毒性患者休克狀態(tài)。這些炎性因子相互作用使機體引發(fā)瀑布式炎癥效應，甚至出現強烈的免疫反應[18]。

單核細胞在尿源性膿毒血癥發(fā)病機制中還存在MAPK信號通路，MAPK作為絲裂原活化蛋白激酶。在哺乳動物中MAPK信號通路有調節(jié)蛋白激酶(ERK-1/2)、p38MAPK、c-JunN端激酶(JNK)通路[19]。當機體受到微生物LPS入侵，MAPK信號通路活化，導致ERK、JNK和p38各級聯信息傳導，誘導轉錄因子c-Jun和c-fos活化后轉入細胞核形成轉錄因子AP-1。轉錄因子AP-1主要功能是調控IL-1、IL-6和TNF-α等促炎性因子的轉錄釋放，從而形成過度性炎性反應損傷機體器官。唐亞純等[20]研究抑制p38 MAPK信號通路可以減少尿源性膿毒血癥兔腎組織細胞凋亡。單核/巨噬細胞在尿源性膿毒血癥中的發(fā)病機制還包括可溶性髓樣細胞觸發(fā)受體1、胞漿內的NOD樣受體、C型凝集素受體、HIN200蛋白等。綜述國內外膿毒血癥研究進展，將有利于提高早期尿源性膿毒血癥的診斷及治療。

4 單核/巨噬細胞與尿源性膿毒血癥免疫抑制期

4.1 單核/巨噬細胞功能改變 在微生物LPS等TLR激動劑以及微生物化合物持續(xù)的刺激下，單核/巨噬細胞分泌促炎細胞因子減低，而抗炎性細胞因子逐漸增強。尿源性膿毒血癥免疫抑制狀態(tài)與LPS耐受中的現象有相近之處。單核/巨噬細胞在尿源性膿毒血癥免疫抑制期分泌促炎細胞因子TNF家族(TNF-α、TNF-β、Fas)、IL-1、IL-1α、IL-6和高遷移率族蛋白1(HMGB1)等能力下降，但產生IL-10、TGF-β、IL-4、IL-1受體拮抗劑(IL-RA)等免疫抑制因子的釋放能力不受損，甚至增強[21]。單核/巨噬細胞的功能并沒有完全消除，而只是從促炎性反應模式轉變?yōu)榭寡仔苑磻Ｊ?，這符合了單核/巨噬細胞核基因重新表達的概念[22]。單核/巨噬細胞LPS耐受病理機制主要為編碼免疫抑制分子基因表達增加，而表達促炎因子及趨化因子受體基因表達能力下降。免疫抑制分子大量釋放以IL-10、TGF-β為主，另外單核/巨噬細胞表面人類白細胞抗原-DR(HLA-DR)表達降低導致抗原提呈至T淋巴細胞能力降低，二者暗示尿源性膿毒癥免疫抑制期預示不良。其中IL-10可誘導單核/巨噬細胞抗炎因子分泌加強，同時抑制促炎細胞因子合成；除此之外，IL-10也可以誘導IL-1RA抑制抗原提呈能力，從而增加再次感染的機會。陳冬萍等[23]發(fā)現單核/巨噬細胞在尿源性膿毒血癥免疫抑制期HLA-DR與共刺激分子CD80/86表達降低、抗原遞呈能力下降。我們能夠確定這種類型的臨床發(fā)展與免疫單核巨噬細胞的失活有關。單核細胞上HLA-DR的表達減少到<30%(通常是>80%)，部分單核細胞喪失抗原遞呈活性，從而合成促炎細胞因子發(fā)揮能力進一步降低。在尿源性膿毒血癥免疫抑制期,單核/巨噬細胞功能重建主要是由干擾素-γ(IFN-γ)和重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等因子發(fā)揮作用。IFN-γ分泌減少是尿源性膿毒癥免疫抑制的關鍵因素。IFN-γ主要是通過誘導單核巨噬細胞HLA-DR以致恢復單核/巨噬細胞分泌促炎細胞因子。研究表明，GM-CSF不但可以促進尿源性膿毒癥患者單核/巨噬細胞HLA-DR的表達，而且促進炎性因子IFN-γ的釋放，逆轉免疫抑制狀態(tài)[24]。單核/巨噬細胞功能恢復對尿源性膿毒血癥免疫抑制患者至關重要。單核巨噬細胞激活劑進行免疫調節(jié)治療雖然未取得突破性進展，但我們仍可以更好地致力于規(guī)劃未來的尿源性膿毒血癥研究。

4.2 DC與尿源性膿毒血癥 DC是由骨髓單核源性細胞分化而來。DC能夠吞噬以及分解提呈病原體的抗原，還能夠誘導免疫耐受、激活T細胞的特異性免疫反應。DC在固有免疫應答中作為機體防御第一防線，以保護宿主免受入侵感染。尿源性膿毒血癥免疫抑制期,淋巴組織和非淋巴組織的樹突狀細胞丟失，主要是由于細胞凋亡。在對尿源性膿毒血癥患者的尸檢報告中發(fā)現循環(huán)和脾臟DC的數量明顯減少[15]。更嚴重的是在尿源性膿毒血癥患免疫抑制期DC數量更加減少，存活的DC提呈、傳遞抗原能力降低。DC在尿源性膿毒血癥免疫抑制期分泌HLA-DR水平也逐漸降低，IL-10分泌不受損或增加。在小鼠膿毒血癥研究中發(fā)現，DC能夠明顯分泌抗炎細胞因子，有利于小鼠抵制嚴重性膿毒血癥[25]。然而，在微生物LPS刺激TLRs激活MyD88信號通路，增強促炎因子釋放。尿源性膿毒血癥免疫抑制期發(fā)生導致脾臟DC細胞負荷消耗殆盡[26]。DC不但通過誘導效應T細胞，而且能使T細胞調亡以及抑制效應T細胞亞群(Treg)增殖，決定免疫反應類型[27]。有研究發(fā)現，通過防止DC凋亡或加強介導DC增殖分化功能，明顯提高患者生存率[28]。其中表達Bcl-2的DC在膿毒血癥中減少免疫細胞凋亡有重要作用[29]。TLR激動劑或FMS樣酪氨酸激酶3配體(FLT3L)能促進DC細胞增殖以及增強促炎細胞因子釋放，同時對單核細胞以及其他免疫細胞的功能也有極深影響[28]。研究DC細胞在尿源性膿毒血癥發(fā)病中的作用，合理應用DC拮抗劑或者激活劑，是治療尿源性膿毒血癥的一種重要途徑。

5 免疫細胞凋亡與免疫細胞影響

隨的膿毒血癥的進展，特別是膿毒血癥抑制期免疫細胞的功能出現大量的損傷甚至調亡。主要包括單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和DC等在機體中大量凋亡，最終導致了機體的免疫抑制出現惡性循環(huán)。有文獻研究表明預防免疫細胞凋亡可以明顯降低膿毒血癥患者的死亡率[30]。在尿源性膿毒血癥抑制期，單核細胞、巨噬細胞和DC進一步吞噬凋亡細胞，導致無功能的細胞增多，誘導IL-10分泌，導免疫抑制[31]。在哺乳動物中由一類髓系發(fā)展有未完全分化、免疫抑制功能特點的早期抑制細胞(MDSC)。MDSC主要包括單核/巨噬細胞、粒細胞、DC的前體等。單核細胞型MDSC可以通過調節(jié)活性氧類(ROS)的濃度，從而誘導T細胞抗原受體-ζ鏈(TCR-ζ)鏈干擾免疫T細胞發(fā)揮正常功能；而粒細胞型MDSC通過提高一氧化氮的濃度及精氨酸酶的活性，破壞下游IL-2受體傳導信號通路，進而誘導T細胞凋亡。尿源性膿毒血癥促炎因子TNF-α可以誘導單核細胞凋亡，并促進Fas分泌。在JNK信號途徑激活后并引起JNK激酶活化,而JNK存在誘導FasL表達促進淋巴細胞凋亡。另外，單核細胞、巨噬細胞、DC表面HLA-DR的表達降低，并且抑制正常T細胞的功能，表現為免疫無應答，更重要的是促進Treg細胞的增殖。其中，促炎因子HMGB1與高級糖化終物(RAGE)受體特異性結合激活細胞內兩個不同信號傳導通路，其中天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)級聯激發(fā)巨噬細胞凋亡起決定性作用[32]。在免疫抑制期，中性粒細胞凋亡對正常巨噬細胞凋亡有密切的相關作用。有研究認為，Treg可以經過Fas/FasL途徑誘導和增加單核細胞的凋亡，從而激活caspase-8[33]。車頔等[34]發(fā)現膿毒血癥患者器官損傷與細胞內線粒體功能異常引起細胞凋亡重要聯系。對尿源性膿毒血癥凋亡機制研究，應用相關拮抗劑或激活劑將有利于阻止尿源性膿毒血癥進展及降低患者死亡率。

6 免疫調節(jié)治療在尿源性膿毒血癥中的應用

分子生物學科學技術迅速提高有助于感染性微生物分子檢測以及尿源性膿毒血癥早期確診。同時，尿源性膿毒血癥早期瀑布級聯效應和晚期免疫抑制期的重要性進行深入研究，發(fā)現免疫調節(jié)治療明顯降低嚴重膿毒血癥患者死亡率并且治療重點，已經從抑制炎性反應的抗炎調節(jié)轉變?yōu)槊庖咴鰪娭委煛Ｄ壳爸饕ㄟ^利用細胞炎性因子、白細胞分化抗原、拮抗炎性介質、內毒素抗體、小分子化合物、抗TLR等進行免疫調理，改善膿毒血癥免疫抑制，如應用GM-CSF、IFN-γ增強免疫細胞功能；IL-7、IL-15減少免疫細胞凋亡等。同時，國外研究發(fā)現大麻素受體2在膿毒血癥降低免疫細胞的激活和抑制促炎因子釋放[35]。有效使用大麻素受體2激動劑能減少外周血中IL-6，提高中性粒細胞活性和增強p38活力。以此同時，多黏菌素B固定纖維(PMX-F)治療尿源性膿毒血癥患者明顯降低Treg數量和血清中IL-6和IL-10水平[36]。除此之外，TRIM59參與NF-κB信號傳導并可促進巨噬細胞的吞噬功能，但TRIM59在膿毒癥中的作用尚不清楚。實驗的研究還是存在一定價值。研究首次證明TRIM59通過調節(jié)巨噬細胞的炎癥和吞噬作用保護小鼠免于膿毒血癥[37]。免疫調節(jié)治療雖然有了一定的療效，但其治療效果仍未得到多中心實驗的證實，且免疫調節(jié)治療藥物昂貴，患者經濟負擔較重。

7 結語與展望

盡管尿源膿毒血癥機制非常復雜，單核/巨噬細胞在膿毒血癥病理進程中的重要作用。脂多糖誘導機體固有免疫與特異性免疫和發(fā)生免疫紊亂。近年來，國內外研究發(fā)現針對膿毒血癥中淋巴細胞功能異常的藥物廣泛應用于臨床，比如胸腺五肽能誘導淋巴細胞增殖,分化成熟,并增加抗原提呈細胞活性[38]，胸腺肽α1促進促炎因子與抗炎因子平衡等。這些藥物對阻止膿毒血癥病程的發(fā)生發(fā)展有顯著的效果。尿源性膿毒血癥的診斷非常重要的。單核/巨噬細胞在膿毒血癥發(fā)生中起啟動固有免疫作用。單核/巨噬細胞計數變化在發(fā)生膿毒血癥早期中可能存在一定診斷價值。給治療尿源性膿毒血癥診斷及治療提供新思路。在臨床中，針對尿源性膿毒癥發(fā)病機制不同免疫階段使用有效的免疫藥物治療提供依據。