植物乳桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵對薏仁米發(fā)酵液品質(zhì)及抗氧化活性的增效性

高維錫，李鋼，李娜

(煙臺職業(yè)學(xué)院 食品與生化工程系，山東 煙臺，264670)

薏仁米屬禾本科，又名薏米、六谷米等，是一種1年生或多年生草本植物，一直被用作營養(yǎng)膳食補(bǔ)充劑被人們所用[1]。薏仁米不僅富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪和多糖等營養(yǎng)成分，還含有豐富的多酚、黃酮和三萜類化合物等多種天然生物活性成分[1]。大量研究表明，薏仁米具有許多有益的健康功效，包括利尿、抗過敏、抗炎[2]和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[3]。我國是薏仁米種植和消費(fèi)大國，擁有較為完整的薏仁米產(chǎn)業(yè)鏈[4]，然而以薏仁米為原料的發(fā)酵飲品存在品質(zhì)差和體外抗氧化活性不高等特點(diǎn)[5]，嚴(yán)重限制了其營養(yǎng)和開發(fā)價(jià)值。探尋薏仁米的高值轉(zhuǎn)化加工技術(shù)成為薏仁米加工企業(yè)和廣大科研人員面臨的重要問題。

微生物發(fā)酵是谷物生物技術(shù)加工中最古老和最經(jīng)濟(jì)的技術(shù)之一，因?yàn)槠淇裳娱L谷物的貨架期，并改善谷物的營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味和生理活性[6]。在谷物發(fā)酵過程中，微生物的代謝與谷物成分相互作用，會(huì)改變薏仁米淀粉結(jié)構(gòu)、流變和糊化特性及消化率[7]。YIN等[6]研究發(fā)現(xiàn)接種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum，LP)發(fā)酵薏仁米能顯著增加有機(jī)酸、游離氨基酸和可溶性膳食纖維的含量。王清爽等[8]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌發(fā)酵脫脂薏仁米可顯著提高總酚含量和抗氧化活性。XU等[9]研究發(fā)現(xiàn)酵母發(fā)酵薏仁米會(huì)顯著增加低分子質(zhì)量肽、游離氨基酸及總酚的含量。然而，利用多菌種協(xié)同發(fā)酵以提高薏仁米的營養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究鮮有報(bào)道。

LP因其保健功能和產(chǎn)細(xì)菌素特性是工業(yè)發(fā)酵最常用的乳酸菌[10]。而釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，SC)作為一種發(fā)酵特性優(yōu)良的發(fā)酵劑，可在谷物發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種水解酶，對谷物產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和生物活性產(chǎn)生重大影響[9]。本研究分別采用LP、SC及其組合發(fā)酵薏仁米，探究多菌種協(xié)同發(fā)酵對薏仁米發(fā)酵液營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化的增效性，為薏仁米的發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：薏仁米，本地超市；LP(CICC20766)、SC(CICC33072)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

試劑：葡萄糖、氫氧化鈉、磺基水楊酸(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；蘆丁、沒食子酸、甲醇(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸、乙酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH自由基清除活性試劑盒、鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082生化培養(yǎng)箱，上海東麓儀器設(shè)備有限公司；PHS-2F pH計(jì)，上海三信儀表廠；UV752N紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；L-8900氨基酸分析儀，日本日立公式；1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液制備

將LP和SC甘油保藏管分別接入MRS和YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化2代后，4 500 r/min離心15 min，棄去上清液，無菌生理鹽水重懸沉淀，分別得到活菌數(shù)為2.4×107、3.8×107CFU/mL的LP和SC菌懸液。

1.3.2 薏仁米發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)

參考YIN等[6]的發(fā)酵方法，并有所改動(dòng)。取新鮮、無蟲的干薏仁米，加入3倍質(zhì)量的溫水浸泡3 h，瀝干水分置于墊有紗布的蒸籠中，105 ℃蒸煮15 min，將煮熟的薏仁米用2倍質(zhì)量的無菌水進(jìn)行打漿，分別加入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))α-淀粉酶(10 000 U)和0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶(8 000 U)，60 ℃酶解4 h，裝入無菌玻璃罐，分別接種1% LP菌懸液、1%SC菌懸液和1%LP菌懸液及1%SC菌懸液的組合(LP+SC)，混勻后置于37 ℃ 培養(yǎng)箱發(fā)酵36 h，得到發(fā)酵薏仁米，5 000 r/min離心15 min，收集上清液，-20 ℃冰箱貯存。未發(fā)酵的(non-fermented，NF)薏仁米按相同的步驟制備。

1.3.3 生物量測定

參考GB 4789.35—2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》進(jìn)行測定；參照GB 4789.15—2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行測定。

1.3.4 pH、總酸、還原糖和可溶性蛋白的測定

使用pH計(jì)測定各組樣品的pH值；采用GB 12456—2021《食品中總酸的測定》進(jìn)行測定；利用GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》進(jìn)行測定；根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白的含量[11]。

1.3.5 有機(jī)酸測定

根據(jù)楊希等[12]的方法，采用HPLC檢測各種有機(jī)酸的含量。取適量發(fā)酵液，加入等體積的硫酸鋅和亞鐵氰化鉀，8 000 r/min離心15 min取上清液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為YMC-ODS C18色譜柱，流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鈉溶液，流速為0.7 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm[12]。

1.3.6 多肽分子質(zhì)量分布測定

根據(jù)XU等[13]的方法，采用凝膠過濾色譜法對多肽分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱為TSK-GEL G2000 SWXL凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸的10%乙腈，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm[13]。

1.3.7 游離氨基酸測定

參考XU等[13]的方法，采用氨基酸分析儀檢測游離氨基酸的含量。將1 mL發(fā)酵液與9 mL 50 g/L磺基水楊酸混合均勻，室溫下反應(yīng)30 min，10 000 r/min離心5 min取上清液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)行氨基酸分析。分析條件：分離柱為TS263離子交換柱，流速為60 μL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為440、570 nm[13]。

1.3.8 總黃酮、總多酚、可溶性膳食纖維和總?cè)频臏y定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量[14]；利用Folin-Ciocalteu比色法測定總多酚的含量[14]；根據(jù)GB 5009.88—2014 《食品中膳食纖維的測定》進(jìn)行測定；使用香菜醛-高氯酸比色法測定總?cè)频暮縖15]。

1.3.9 抗氧化活性測定

使用DPPH自由基清除能力試劑盒檢測DPPH自由基清除能力[14][DPPH自由基清除能力以水溶性維生素E(trolox)當(dāng)量μmol TE/mL表示]及FRAP檢測試劑盒檢測總抗氧化能力[14][總抗氧化能力以亞鐵離子(Fe2+)μmol FE/mL當(dāng)量表示]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。使用GraphPad Prism 8.0和Excel 2017繪制圖表。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液菌落數(shù)量的影響

在谷物發(fā)酵過程中，酵母菌和乳酸菌的細(xì)胞數(shù)量對谷物產(chǎn)品品質(zhì)和香氣有顯著影響[16]。由表1可知，接種發(fā)酵劑發(fā)酵的薏仁米發(fā)酵液中微生物菌落數(shù)量均遠(yuǎn)高于未發(fā)酵薏仁米，但不同發(fā)酵劑之間的微生物菌落數(shù)量差異較大。發(fā)酵36 h后，LP組中LP菌落數(shù)量可達(dá)8.85 lgCFU/mL，而SC中SC菌落數(shù)量則為8.37 lgCFU/mL。LP+SC組中LP和SC的菌落數(shù)量分別可達(dá)9.22、8.74 lgCFU/mL，均遠(yuǎn)高于只接種單一發(fā)酵劑實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)量(P<0.05)，表明乳酸菌和酵母菌在薏仁米發(fā)酵體系中呈現(xiàn)互利共生的關(guān)系。酵母菌分泌的脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶分解基質(zhì)物質(zhì)為乳酸菌的生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)以乳酸菌生長過程中產(chǎn)生的乳酸鹽和半乳糖作為能源物質(zhì)生長繁殖[17]。

表1 各組樣品的LP和SC菌落數(shù)量的差異 單位：CFU/mL

2.2 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液基礎(chǔ)理化指標(biāo)的影響

如圖1所示，發(fā)酵36 h后，薏仁米發(fā)酵液的pH、還原糖含量和可溶性蛋白含量顯著低于未發(fā)酵薏仁米(P<0.05)，而總酸含量則顯著高于未發(fā)酵薏仁米(P<0.05)。不同發(fā)酵劑發(fā)酵樣品之間的基礎(chǔ)理化指標(biāo)存在較大差異。LP+SC組具有最低的pH和最高的總酸含量，分別為3.96、3.23 mg/mL；其次為LP組，pH和總酸含量分別為3.96、2.94 mg/mL；而SC組中pH和總酸含量分別為5.73、0.52 mg/mL，與LP+SC組和LP組差異明顯。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，pH快速下降至5.3以下，可抑制沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長[18]。因此，乳酸菌發(fā)酵可通過防止病原體的生長確保發(fā)酵薏仁米的安全性。乳酸菌和酵母菌的快速生長繁殖會(huì)導(dǎo)致薏仁米發(fā)酵液中還原糖和可溶性蛋白的迅速減少。LP+SC組具有最低的還原糖和可溶性蛋白含量，分別僅為5.67、0.42 mg/mL；LP組中可溶性蛋白含量則可達(dá)0.59 mg/mL；而SC組中還原糖含量為11.31 mg/mL，遠(yuǎn)高于LP+SC組。這是由于乳酸菌對還原糖的消耗速率強(qiáng)于酵母菌[19]。發(fā)酵環(huán)境的酸化會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵體系中可溶性蛋白在大量H+水解作用下降解為氨基酸和多肽[10]。

a-pH；b-總酸；c-還原糖；d-可溶性蛋白圖1 各組樣品的pH、總酸、還原糖和可溶性蛋白的差異Fig.1 The differences in pH, total acid, reducing sugar and soluble protein of each group samples 注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液有機(jī)酸的影響

有機(jī)酸是微生物發(fā)酵的產(chǎn)物，其含量及比例會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品酸感的差異，并決定產(chǎn)品的口感[20]。由圖2可知，未發(fā)酵薏仁米上清液中只檢測出草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等4種有機(jī)酸，其含量分別為73.04、158.42、22.96、23.62 μg/mL。而接種SC發(fā)酵不會(huì)改變有機(jī)酸的種類，但會(huì)改變其含量，檸檬酸和琥珀酸含量分別可達(dá)305.64、33.03 μg/mL。此外，在LP和LP+SC組中還檢測到乳酸和乙酸，其中乳酸含量增加最顯著，在LP和LP+SC組的含量分別可達(dá)2 150.58、2 312.67 μg/mL，分別占各組整個(gè)有機(jī)酸比例的72.63%和71.32%。乳酸作為乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，其含量會(huì)直接影響薏仁米發(fā)酵液的酸感，并且參與酯類化合物的合成[21]。檸檬酸是LP和LP+SC組中含量僅次與乳酸的有機(jī)酸，其含量分別可達(dá)435.64、538.92 μg/mL，分別占各組整個(gè)有機(jī)酸比例的14.71%和16.62%。徐磊等[22]研究發(fā)現(xiàn)碳水化合物酶協(xié)同干酪乳桿菌發(fā)酵可增加脫脂薏米水提取液的有機(jī)酸總含量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液多肽分子質(zhì)量分布的影響

通常，來自植物基蛋白質(zhì)水解的多肽具有多種生物活性，是一類獨(dú)特的功能性食品成分[9]。由表2可知，15 000～10 000 Da的多肽占未發(fā)酵薏仁米上清液中整個(gè)多肽比例的20.26%，其次為10 000～5 000 Da的多肽。發(fā)酵36 h后，15 000～10 000、10 000～5 000、5 000～1 000、1 000～500 Da的多肽比例比未發(fā)酵薏仁米顯著降低(P<0.05)，而<180 Da和500～180 Da的多肽則顯著增加(P<0.05)，占發(fā)酵薏仁米發(fā)酵液中整個(gè)多肽比例的72.23%以上，表明發(fā)酵薏仁米發(fā)酵液中的多肽主要是二肽、三肽和氨基酸。LP+SC組中<180 Da和500～180 Da的多肽比例最高，分別可達(dá)40.44%和40.98%。這一結(jié)果與XU等[9]的研究結(jié)果相一致，說明LP和SC共發(fā)酵可將更多的長鏈多肽水解為短鏈多肽和氨基酸。

2.5 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液游離氨基酸的影響

如表3所示，未發(fā)酵薏仁米上清液中只檢測出8種游離氨基酸，總含量為22.08 μg/mL。發(fā)酵可顯著增加薏仁米發(fā)酵液中總游離氨基酸含量(P<0.05)，尤其是LP+SC組的含量最高，可達(dá)120.5 μg/mL。未發(fā)酵薏仁米上清液中非必需氨基酸含量(13.47 μg/mL)是必需氨基酸(8.61 μg/mL)的1.6倍。然而，發(fā)酵36 h后，薏仁米發(fā)酵液中非必需氨基酸含量(48.34～59.79 μg/mL)與必需氨基酸(49.05～60.71 μg/mL)無顯著差異。這一結(jié)果與XU等[9]的研究結(jié)果相一致，表明微生物發(fā)酵有助于提高必需氨基酸的比例。精氨酸和脯氨酸分別占未發(fā)酵薏仁米上清液非必需氨基酸的42.09%和24.79%。發(fā)酵36 h后，天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、精氨酸和半胱氨酸的含量明顯增加。未發(fā)酵薏仁米上清液必需氨基酸中組氨酸含量最高(5.48 μg/mL)，其次是賴氨酸(3.13 μg/mL)和酪氨酸(3.13 μg/mL)。發(fā)酵后必需氨基酸含量是未發(fā)酵薏仁米的5.7～7.1倍。這一結(jié)果與YIN等[6]的研究結(jié)果相一致，說明必需氨基酸含量的增加來自微生物的代謝和其他氨基酸的轉(zhuǎn)化。

表3 各組樣品的游離氨基酸含量的差異 單位：μg/mL

2.6 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液總黃酮、總多酚、總?cè)坪涂扇苄陨攀忱w維的影響

由圖3-a和圖3-b可知，未發(fā)酵薏仁米上清液中總黃酮和總多酚含量分別為32.53、433.63 μg/mL。發(fā)酵可顯著增加薏仁米發(fā)酵液中總黃酮和總多酚含量(P<0.05)，分別增加了79.37%～128.07%和68.53%～91.42%。在微生物發(fā)酵麥麩中也發(fā)現(xiàn)總黃酮和總多酚增加的類似情況[23]。發(fā)酵36 h后，LP+SC組中總黃酮和總多酚含量最高，分別可達(dá)74.19、830.06 μg/mL，表明乳酸菌和酵母菌共發(fā)酵促進(jìn)黃酮和多酚類化合物的釋放及轉(zhuǎn)化。谷物中的多酚類化合物以游離和結(jié)合形式存在[24]。微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶和果膠酶可從不溶性基質(zhì)中釋放結(jié)合酚類化合物，并將其水解為游離形式，增加發(fā)酵產(chǎn)物中多酚含量[9]。如圖3-c和3-d所示，未發(fā)酵薏仁米上清液中總?cè)坪涂扇苄陨攀忱w維的含量分別為10.65、133.05 μg/mL。發(fā)酵后各組薏仁米發(fā)酵液中總?cè)坪涂扇苄陨攀忱w維的含量均顯著增加(P<0.05)。其中，LP+SC組中總?cè)坪涂扇苄陨攀忱w維的含量最高，分別可達(dá)30.34、212.55 μg/mL，分別比未發(fā)酵薏仁米提高了184.88%和59.78%。乳酸菌和酵母菌互利共生生成更多的淀粉酶和蛋白酶，促進(jìn)三萜類化合物和可溶性膳食纖維溶出及合成。發(fā)酵后產(chǎn)生的三萜類化合物和可溶性膳食纖維可能增加薏仁米發(fā)酵液的益生功效。

a-總黃酮；b-總多酚；c-總?cè)?；d-可溶性膳食纖維圖3 各組樣品的總黃酮、總多酚、總?cè)坪涂扇苄?膳食纖維的含量差異Fig.3 The differences in the contents of total flavonoids, total polyphenols, total triterpenes and soluble dietary fiber of each group samples

2.7 不同發(fā)酵劑對薏仁米發(fā)酵液抗氧化的影響

DPPH自由基清除活性和還原能力通常被用來評估目標(biāo)物抗氧化活性強(qiáng)弱。由圖4可知，未發(fā)酵薏仁米發(fā)酵液的DPPH自由基清除活性和FRAP分別為2.59 μmol TE/mL和3.12 μmol FE/mL。發(fā)酵后各組薏仁米發(fā)酵液中DPPH自由基清除活性和FRAP均顯著增加(P<0.05)。LP組中DPPH自由基清除活性和FRAP分別為3.43 μmol TE/mL和3.87 μmol FE/mL，而SC組DPPH自由基清除活性和FRAP則分別為3.13 μmol TE/mL和3.96 μmol FE/mL。LP+SC組的DPPH自由基清除活性和FRAP最強(qiáng)，分別可達(dá)3.52 μmol TE/mL和4.04 μmol FE/mL。這可能與乳酸菌和酵母菌的代謝產(chǎn)物及薏仁米發(fā)酵液中活性物質(zhì)變化有關(guān)[9]。徐磊等[25]研究結(jié)果表明不同蛋白酶血糖干酪乳桿菌發(fā)酵可以提高脫脂薏米水提取液的抗氧化能力，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

a-DPPH自由基清除活性；b-FRAP圖4 各組樣品的抗氧化活性的差異Fig.4 The differences in antioxidant activity of each group samples

3 結(jié)論

本文將LP、SC及其組合用于薏仁米發(fā)酵，研究不同發(fā)酵劑微生物的變化及其對薏仁米發(fā)酵液基礎(chǔ)理化指標(biāo)、有機(jī)酸、多肽分子質(zhì)量分布、游離氨基酸、總黃酮、總多酚、總?cè)坪涂扇苄陨攀忱w維及體外抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，LP和SC在薏仁米發(fā)酵過程中表現(xiàn)為互利共生的關(guān)系。此外，LP和SC共發(fā)酵可顯著提高薏仁米發(fā)酵液中總酸、乳酸、總黃酮、總多酚、總?cè)坪涂扇苄陨攀忱w維的含量，加速pH的降低及還原糖及可溶性蛋白的消耗。多菌種混合發(fā)酵還會(huì)顯著提高薏仁米發(fā)酵液中<180 Da和500～180 Da多肽的比例，并增加游離氨基酸的含量，尤其可提高必需氨基酸的比例。本研究發(fā)現(xiàn)，LP與SC共發(fā)酵薏仁米在品質(zhì)和抗氧化方面具有增效性，為薏仁米的發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。