微生物群落對(duì)氨脅迫響應(yīng)的宏基因組學(xué)研究

彭 韻,李 蕾,伍 迪,楊屏錦,彭緒亞,王小銘

微生物群落對(duì)氨脅迫響應(yīng)的宏基因組學(xué)研究

彭 韻,李 蕾*,伍 迪,楊屏錦,彭緒亞,王小銘

(重慶大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400045)

為探析厭氧消化微生物群落對(duì)氨脅迫的響應(yīng),在串聯(lián)批次實(shí)驗(yàn)中引入氨氮(TAN)脅迫,結(jié)合宏基因組學(xué)分析,研究了不同TAN濃度下,厭氧消化系統(tǒng)的過(guò)程參數(shù)、群落結(jié)構(gòu)/組成及其功能基因/代謝途徑的響應(yīng).結(jié)果顯示,TAN為3000mg/L時(shí),系統(tǒng)性能逐步優(yōu)化;TAN為6000mg/L時(shí),甲烷產(chǎn)率逐步下降,并伴隨著丙酸、丁酸積累.從群落組成上看,兩個(gè)氨氮梯度下,抗性和冗余性保障了水解酸化菌代謝底物的能力.產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷方面,低氨氮組兩類功能菌群豐度持續(xù)增加,但高氨氮組增加幅度低甚至出現(xiàn)豐度下降,指示該環(huán)節(jié)可能受到了氨脅迫.進(jìn)一步分析兩階段的功能基因變化,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷和互營(yíng)乙酸氧化途徑在氨脅迫下表現(xiàn)出抗性和冗余性,但高濃度TAN(6000mg/L)抑制了丁酸和丙酸代謝途徑中關(guān)鍵基因和的表達(dá).可見(jiàn),氨抑制失穩(wěn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段.

餐廚垃圾；厭氧消化；氨抑制；宏基因組學(xué)

厭氧消化技術(shù)能將有機(jī)廢物轉(zhuǎn)化為沼氣,但是厭氧消化易遭遇過(guò)程失穩(wěn),其中氨抑制是全規(guī)模厭氧消化系統(tǒng)中主要的失穩(wěn)誘因[1-2].不少研究者探索了氨脅迫下微生物群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng),早期研究普遍認(rèn)為水解酸化細(xì)菌受氨氮(TAN)的影響較少[3-6];但氨脅迫會(huì)強(qiáng)烈抑制產(chǎn)甲烷菌,其中乙酸型產(chǎn)甲烷菌,如,對(duì)氨氮尤其敏感,相比之下,混合營(yíng)養(yǎng)型的耐受性強(qiáng)得多[6-9].氨脅迫會(huì)使反應(yīng)器內(nèi)的主導(dǎo)甲烷菌由向演替[10-11].也有研究者著重關(guān)注氨脅迫對(duì)產(chǎn)甲烷代謝途徑的影響,通過(guò)同位素檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與低氨氮反應(yīng)器以乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑為主不同,高氨脅迫反應(yīng)器的產(chǎn)甲烷途徑多以互營(yíng)乙酸氧化(SAO)聯(lián)合氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑(HM)為主[9].但矛盾的是,有些反應(yīng)器已經(jīng)是主導(dǎo),依然在3500mg/L左右的氨氮下就出現(xiàn)失穩(wěn)[12].更有研究者直接用互營(yíng)乙酸氧化細(xì)菌(SAOB)進(jìn)行生物強(qiáng)化,卻發(fā)現(xiàn)根本無(wú)法改善氨抑制現(xiàn)象[13].

由于氨抑制失穩(wěn)的反應(yīng)器往往伴隨著丙酸、丁酸等脂肪酸的大量積累[12],研究者逐步意識(shí)到產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段受氨抑制的程度可能甚于產(chǎn)甲烷階段[14-17].如Li等[14]在反應(yīng)器中塑造氨脅迫環(huán)境(TAN 為2500mg/L),并以丙酸為唯一碳源,發(fā)現(xiàn)丙酸降解菌(e和)相對(duì)豐度減少,導(dǎo)致丙酸積累,但少量丙酸降解產(chǎn)生的乙酸卻可被立即轉(zhuǎn)化為沼氣.Zhang等[17]直接對(duì)比了氨脅迫下,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度的變化,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌(和)對(duì)高濃度氨氮(6000mg/L)非常敏感,連續(xù)高氨氮暴露下,其豐度不能恢復(fù)并且沒(méi)有被具有相似功能的丙酸降解菌代替,相比之下,暴露于高濃度氨氮,乙酸型產(chǎn)甲烷菌出現(xiàn)了主導(dǎo)菌的演替,氫型產(chǎn)甲烷菌表現(xiàn)出抗性,維持了群落產(chǎn)甲烷功能.Peng等[12]開(kāi)展了長(zhǎng)期的餐廚垃圾干式厭氧消化實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)隨著內(nèi)源氨積累,乙酸在積累一段時(shí)間后能夠穩(wěn)定到一個(gè)特定水平,相比之下,丙酸和戊酸卻在乙酸停止積累后呈現(xiàn)更為迅猛的積累,且最終造成了反應(yīng)器不可逆的抑制.同時(shí),微生物交互分析證實(shí)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌()與TAN負(fù)相關(guān).

目前對(duì)氨抑制失穩(wěn)機(jī)理研究中微生物的測(cè)定一般采用的是高通量測(cè)序技術(shù),這種方法雖然能較為準(zhǔn)確地識(shí)別出系統(tǒng)中的微生物類別,卻無(wú)法分析微生物的功能.因此,對(duì)群落功能的描述只能根據(jù)其他文獻(xiàn)中報(bào)道的親緣關(guān)系較為接近的已鑒定物種的功能進(jìn)行推斷[18],而實(shí)際上不同微生物的功能存在極大差異[10],因此該方法準(zhǔn)確度有限.宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)環(huán)境中的全基因組進(jìn)行測(cè)序,不僅可以全面地分析微生物群落具有的功能及代謝途徑,使得反應(yīng)器性能、微生物群落結(jié)構(gòu)和功能/代謝特征之間的相關(guān)性研究成為可能,還有助于驗(yàn)證或者解釋通過(guò)16S rRNA方法獲得的關(guān)于氨脅迫對(duì)群落組成的影響機(jī)理,以進(jìn)一步明確氨抑制失穩(wěn)根源.采用宏基因組學(xué)研究氨抑制失穩(wěn)機(jī)理的研究鮮有報(bào)道.基于此,本研究開(kāi)展了串聯(lián)批次實(shí)驗(yàn),基于宏基因組學(xué)技術(shù)觀察氨脅迫下,微生物群落結(jié)構(gòu)/分類學(xué)組成及其功能基因/代謝途徑的響應(yīng).本研究的目的是找出氨抑制失穩(wěn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),并從功能基因?qū)用娼馕鲈摥h(huán)節(jié)受到擾動(dòng)的原因,為解析氨抑制失穩(wěn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 接種物和底物

接種污泥來(lái)自實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行的中溫餐廚垃圾厭氧消化器,使用前進(jìn)行預(yù)孵化去氣.接種污泥的pH值、總固體含量(TS)、揮發(fā)性固體含量(VS)和TAN分別為7.89±0.2、(2.73±0.26)%、(2.04±0.07)%和(1723.43±166.78)mg/L.為保證底物的均勻性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,采用根據(jù)實(shí)際餐廚垃圾性質(zhì)配制的?；?濕基質(zhì)量比,蔬菜:肉:米飯:植物油=35%:8%:50%:7%)為底物,模化垃圾分裝到自封袋內(nèi)于-18℃冰凍保存.臨用前1d置于4℃冰箱中解凍.?；腡S、VS分別為(27.70±0.19)%、(27.54±0.14)%;蛋白質(zhì)及粗脂肪含量分別為(17.21±0.63)%和(23.32±1.88)%;理論甲烷產(chǎn)率為(507.43±7.31)mLCH4/gVS.

1.2 反應(yīng)器及運(yùn)行

根據(jù)本團(tuán)隊(duì)前期研究,TAN為3000,6000mg/L時(shí)反應(yīng)器性能都會(huì)受到擾動(dòng),但TAN為3000mg/L的實(shí)驗(yàn)組在連續(xù)批次實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)性能可完全恢復(fù),TAN為6000mg/L的實(shí)驗(yàn)組性能則不斷惡化[17],因此,本研究針對(duì)這2個(gè)濃度進(jìn)行研究.

共開(kāi)展3批次實(shí)驗(yàn).第1批次實(shí)驗(yàn)在總?cè)莘e1L,有效容積800mL的反應(yīng)器(R1_3000)內(nèi)進(jìn)行.運(yùn)行至日產(chǎn)氣量小于累計(jì)產(chǎn)氣量的1%時(shí)停止,繼續(xù)孵化至完全不產(chǎn)氣后開(kāi)展第2批次實(shí)驗(yàn).第2批次以R1_3000的消化渣作為接種物,R1_3000的消化渣被均分為2份,其中1份消化渣被暴露在原來(lái)的TAN濃度下(R2_3000),而另1份則被暴露至6000mg/L的TAN濃度下消化(R2_6000).第2批次實(shí)驗(yàn)中各反應(yīng)器產(chǎn)氣完成后,以反應(yīng)器內(nèi)全部消化渣作為接種物繼續(xù)開(kāi)展第3批次實(shí)驗(yàn)(R3_3000和R3_6000).為了保證各批次反應(yīng)器中污泥濃度及有效容積的一致性,2、3批次實(shí)驗(yàn)在總?cè)莘e500mL,有效容積400mL的反應(yīng)器內(nèi)開(kāi)展.

所有反應(yīng)器均調(diào)節(jié)接種污泥濃度為5gVSS/L,底物與接種物濃度比設(shè)置為1.氨氮以NH4Cl溶液的形式添加,隨后向每個(gè)反應(yīng)器內(nèi)添加20%(體積比)的營(yíng)養(yǎng)液[17],并添加蒸餾水達(dá)到有效容積.反應(yīng)器內(nèi)的初始pH值采用1mol/L的HCl溶液或3mol/L的NaOH溶液調(diào)至7.5.向反應(yīng)器內(nèi)充5min氮?dú)?以排空瓶?jī)?nèi)的氧氣,保證厭氧環(huán)境.反應(yīng)器置于(36±1)℃的恒溫水浴鍋內(nèi)發(fā)酵,每次記錄氣體體積前手動(dòng)搖晃1min.

在每個(gè)批次反應(yīng)末期,取液體樣品,每次采樣后立即在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心15min,獲得的上清液用于分析理化指標(biāo),污泥樣品則保存至-80℃冰箱中,以備進(jìn)行宏基因組學(xué)分析.

1.3 性能參數(shù)分析

產(chǎn)生的甲烷通過(guò)排NaOH(3mol/L)法進(jìn)行收集,并換算成標(biāo)態(tài)下(273.15K,101.325kPa)的體積[19]. pH值、TS、VS和TAN采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[20].揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)(乙酸、丙酸、丁酸)用氣相色譜(7890A,Agilent,美國(guó))測(cè)定.底物的蛋白質(zhì)和脂肪含量分別采用凱氏定氮法(KDN-1,上海)和索氏提取法測(cè)定[21-22].碳水化合物用差減法計(jì)算[12].根據(jù)式(1)將獲得的底物組分用于理論甲烷產(chǎn)率計(jì)算[23]:

式中:是理論甲烷產(chǎn)率, mLCH4/gVS;是底物中碳水化合物含量, mg/gTS;是底物中蛋白質(zhì)含量, mg/gTS;是底物中脂肪含量, mg/gTS.

1.4 動(dòng)力學(xué)模型

考慮到餐廚垃圾極易降解,反應(yīng)器啟動(dòng)初期底物被快速水解酸化產(chǎn)生大量VFAs,繼而轉(zhuǎn)化為甲烷,可使反應(yīng)器出現(xiàn)第1個(gè)產(chǎn)氣高峰.而本研究向各反應(yīng)器中引入了氨氮擾動(dòng),氨氮逐步擴(kuò)散至微生物細(xì)胞內(nèi),會(huì)對(duì)其活性產(chǎn)生抑制,由此迅速引發(fā)產(chǎn)氣下降甚至停滯;直至微生物適應(yīng)后,系統(tǒng)才會(huì)恢復(fù)產(chǎn)氣,慢慢呈現(xiàn)第2個(gè)產(chǎn)氣高峰.鑒于此,采用origin 9.3用含有前后兩個(gè)產(chǎn)氣高峰和中間產(chǎn)氣平臺(tái)的修正的兩級(jí)Gompertz模型[24]對(duì)各反應(yīng)器的產(chǎn)氣情況進(jìn)行模擬.根據(jù)模擬結(jié)果,各實(shí)驗(yàn)組實(shí)際甲烷產(chǎn)率和模擬甲烷產(chǎn)率的RMSE極小,2極高(0.99～1.00),表明該模型模擬效果很好.模型方程見(jiàn)式(2).

式中:Y是最終甲烷產(chǎn)率, mLCH4/gVS;Y1和Y2分別是第1階段和第2階段的甲烷產(chǎn)率, mLCH4/gVS;R1和R2分別是第1階段和第2階段的比產(chǎn)甲烷活性, mLCH4/(gVS·d);1和2分別是第1階段和第2階段的停滯期, d;e為自然對(duì)數(shù),等于2.718.

1.5 宏基因組學(xué)分析方法

用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒進(jìn)行樣品DNA抽提.分別利用TBS-380、NanoDrop200、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度、純度和完整性.通過(guò)Covaris M220將DNA片段化,篩選約400bp的片段,使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq構(gòu)建PE文庫(kù).通過(guò)上海美吉生物技術(shù)有限公司Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序,原始數(shù)據(jù)已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào):SRP231897).

每個(gè)樣品獲得94440174～123356644條原始序列.利用fastp(v0.20.0)對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控,去除長(zhǎng)度小于50bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的序列,獲得優(yōu)化序列.使用基于succinct de Bruijn graphs原理的拼接軟件Megahit(v1.1.2)對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝,在拼接結(jié)果中篩選3300bp的重疊群作為最終的組裝結(jié)果.使用MetaGene對(duì)拼接結(jié)果中的重疊群進(jìn)行基因預(yù)測(cè).選擇核酸長(zhǎng)度3100bp的基因,并將其翻譯為氨基酸序列.使用CD-HIT(v4.6.1)對(duì)所有樣品預(yù)測(cè)出來(lái)的基因序列進(jìn)行聚類(相似度390%、覆蓋率390%),每類取最長(zhǎng)的基因作為代表序列,構(gòu)建非冗余基因集.使用SOAPaligner(v2.21),分別將每個(gè)樣品的高質(zhì)量序列與非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)(相似度395%),統(tǒng)計(jì)基因在對(duì)應(yīng)樣品中的豐度信息.基因豐度計(jì)算方法為Reads Per Kilobase Million,即每1百萬(wàn)條序列中,每個(gè)基因以1000個(gè)堿基為單位,比對(duì)上的序列條數(shù).

采用基于bray_curtis距離算法的樣本層級(jí)聚類分析計(jì)算了微生物樣本之間的相似度.使用Diamond (v0.8.35)將非冗余基因集的氨基酸序列與NR數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(BLAST比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5),以獲得物種和功能注釋.為識(shí)別在兩樣本組中具有顯著差異的微生物,基于費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)和fdr多重檢驗(yàn)校正對(duì)兩樣本進(jìn)行了組間差異檢驗(yàn),設(shè)置值為0.05.

2 結(jié)果與討論

2.1 氨氮對(duì)反應(yīng)器性能的影響

從表1可知,第1批次實(shí)驗(yàn)中,氨氮濃度為3000mg/L時(shí),甲烷回收率(實(shí)際甲烷產(chǎn)率/理論甲烷產(chǎn)率)僅88.25%,這顯著低于批次實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定運(yùn)行反應(yīng)器的甲烷回收率(通常在94%以上[25-26]),也顯著低于本團(tuán)隊(duì)前期研究[17]中報(bào)道的本底氨氮濃度(1800mg/L)下反應(yīng)器的甲烷回收率(96.53%±2.66%).可見(jiàn)R1_3000產(chǎn)氣性能受到了氨氮的影響.當(dāng)將R1_3000中污泥繼續(xù)暴露在3000mg/L的TAN濃度下時(shí),R2_3000的甲烷產(chǎn)率和R2都顯著增加(< 0.05),同時(shí)乙酸、丙酸濃度顯著下降(<0.05),丙酸甚至降至0mg/L,表明其性能在連續(xù)的暴露中逐漸恢復(fù)了.R2_3000較長(zhǎng)的2可能代表此階段微生物正在重組適應(yīng)新環(huán)境[27-28].繼續(xù)暴露于相同氨氮濃度,R3_3000甲烷產(chǎn)率保持穩(wěn)定,R2也維持在較高水平,2及乙酸含量進(jìn)一步下降.說(shuō)明此氨氮脅迫下,微生物代謝功能已恢復(fù)并維持到穩(wěn)定狀態(tài),系統(tǒng)運(yùn)行良好.Tian等[29]也觀察到TAN為3300～3800mg/L時(shí), 中溫厭氧反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定的現(xiàn)象.

注:*各類酸濃度是指實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谒岬臐舛?

當(dāng)將來(lái)自R1_3000的種泥暴露于6000mg/L時(shí),R2_6000組反應(yīng)器的2顯著增加(<0.05),指示微生物也發(fā)生了重組;R2顯著提高,甲烷產(chǎn)率也呈現(xiàn)輕微上浮,暗示產(chǎn)氣性能似乎在優(yōu)化.但同時(shí),反應(yīng)器末期出現(xiàn)了更大量的VFAs積累,特別是丙酸,高達(dá)(428.36±56.79)mg/L.繼續(xù)暴露于6000mg/L時(shí), R3_6000組反應(yīng)器的R2下降,甲烷產(chǎn)率不僅顯著低于R2_6000組反應(yīng)器(<0.05),也顯著低于R1_3000組反應(yīng)器(<0.05).VFAs方面,乙酸含量繼續(xù)下降,但丙酸積累卻沒(méi)有絲毫改善(>0.05),丁酸盡管積累程度不如丙酸,但也呈現(xiàn)持續(xù)積累趨勢(shì).這是可以理解的,因?yàn)閺臒崃W(xué)角度來(lái)看,在標(biāo)況下(即101325Pa, 298.15K以及反應(yīng)濃度為1mol/L時(shí)),丁酸和丙酸氧化反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能分別為48.4, 76.2kJ[30],兩者的氧化均無(wú)法自發(fā)進(jìn)行,但與丁酸相比,丙酸氧化反應(yīng)需要吸收的能量更多,因此更難降解.前期在其他擾動(dòng)因素造成的過(guò)程失穩(wěn)中,丙酸和丁酸也曾被鑒定為主要的過(guò)程失穩(wěn)原因[15,31-32].綜上,TAN為6000mg/L時(shí),乙酸沒(méi)有明顯積累,指示其代謝未受阻遏,但丙酸、丁酸在連續(xù)暴露實(shí)驗(yàn)中積累,因此它們的代謝可能是造成系統(tǒng)失穩(wěn)的關(guān)鍵.

2.2 氨氮對(duì)微生物群落組成的影響

由表2可見(jiàn),來(lái)自同一接種源的微生物樣品暴露于不同TAN后,群落出現(xiàn)了越來(lái)越明顯的差異;但同一TAN下,不同批次樣品的群落相似性指數(shù)逐步增大,這與前期通過(guò)16S rRNA分析方法得到的研究結(jié)果一致[17,33].來(lái)自同一接種源(R1_3000組反應(yīng)器)的R2_3000和R2_6000組微生物樣品的群落相似性為88.53%,繼續(xù)暴露在對(duì)應(yīng)氨氮濃度下, R3_3000和R3_6000組樣品相似性指數(shù)下降至83.77%.表明不同TAN濃度使群落朝著不同的方向演替.相比之下,R1_3000與R2_3000的相似性僅78.23%,這與R2_3000反應(yīng)器較長(zhǎng)的2是對(duì)應(yīng)的.但R2_3000與R3_3000的群落相似性達(dá)到86.94%,暗示群落在朝著相同的方向演替.TAN為6000mg/L的實(shí)驗(yàn)組也有群落相似性逐漸增大的規(guī)律,R2_6000與R3_6000的群落相似性達(dá)到90.31%,表明長(zhǎng)期暴露會(huì)使微生物的動(dòng)態(tài)演替趨于平衡.通過(guò)解析此反應(yīng)器的群落演替來(lái)揭示氨抑制失穩(wěn)機(jī)理是可行的.

采用組間差異檢驗(yàn)找出了不同氨氮濃度下,各反應(yīng)器末期具有顯著差異的微生物,并將其按功能分為水解酸化菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌.如圖1a可見(jiàn),不同氨氮濃度下,相對(duì)豐度具有顯著差異的水解酸化菌共檢測(cè)到12種.其中,7種微生物在R3_6000中顯著富集(<0.05),5種微生物相對(duì)豐度在R3_6000中顯著少于R3_3000(<0.05).總體上, TAN為3000mg/L時(shí),主導(dǎo)水解酸化菌有10種,總相對(duì)豐度為28.94%;TAN為6000mg/L時(shí),主導(dǎo)水解酸化菌有11種,總相對(duì)豐度為33.11%.多樣性和高豐度保障了水解酸化菌在氨脅迫下代謝底物的能力,因此水解產(chǎn)酸階段并非導(dǎo)致氨抑制反應(yīng)器失穩(wěn)的關(guān)鍵,這與以前的研究結(jié)論一致[17,34].

如圖1b可見(jiàn),在2個(gè)氨氮濃度下相對(duì)豐度具有顯著差異的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌包括、、、、.據(jù)報(bào)道,主要降解C4～C18的脂肪酸[17],與R1_3000相比,該菌相對(duì)豐度在R2_3000增加了1.02倍,在R3_3000繼續(xù)增加,相對(duì)豐度達(dá)到R1_3000的3.11倍,但在高氨氮濃度下,盡管R2_ 6000和R3_6000都出現(xiàn)明顯的丁酸積累(表1),但相對(duì)豐度遠(yuǎn)低于低氨氮組(R2_3000和R3_3000),暗示系統(tǒng)丁酸代謝功能可能受到了高氨氮的影響.Du等[35]也指出由于丁酸降解過(guò)程發(fā)生在熱力學(xué)平衡附近,微小的環(huán)境變化(如中間化合物)都會(huì)導(dǎo)致生物代謝途徑受到影響.除以外的菌都是丙酸降解菌[36-37],低氨氮反應(yīng)器中丙酸降解菌總相對(duì)豐度在R2_3000有所下降,在R3_3000出現(xiàn)回彈,反應(yīng)末期無(wú)丙酸積累;但當(dāng)TAN為6000mg/L時(shí),盡管兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組的丙酸降解菌總相對(duì)豐度與R1_3000相比僅略有下降,但系統(tǒng)內(nèi)丙酸積累到131.70～472.90mg/L,暗示該階段代謝功能可能受到擾動(dòng).這些結(jié)果表明,微生物群落能夠抵抗或成功適應(yīng)低濃度TAN(3000mg/L),但可能無(wú)法在高濃度TAN(6000mg/L)下維持丁酸、丙酸互營(yíng)氧化功能,丁酸、丙酸的互營(yíng)降解可能是氨脅迫下反應(yīng)器性能惡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

表2 不同樣本之間的相似性指數(shù)

不同氨氮濃度下相對(duì)豐度具有顯著差異的產(chǎn)甲烷菌僅有氫營(yíng)養(yǎng)型和混合營(yíng)養(yǎng)型.但鑒于檢測(cè)到的主導(dǎo)甲烷菌僅3種,乙酸營(yíng)養(yǎng)型也列于圖1c中.從演替趨勢(shì)來(lái)看,2個(gè)氨氮濃度下,除外,和相對(duì)豐度都較R1_3000顯著上升(<0.05),導(dǎo)致R3_3000和R3_ 6000總產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度分別增加了89.18%和33.64%.說(shuō)明兩個(gè)氨氮濃度下,產(chǎn)甲烷菌都得到了富集.而高氨氮反應(yīng)器中產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度的增加幅度不如低氨氮反應(yīng)器,除氨氮脅迫外,也可能是產(chǎn)甲烷菌底物受限造成的.雖然2個(gè)氨氮濃度下,相對(duì)豐度均顯著下降(<0.05),但研究報(bào)道,隨著氨水平增加,當(dāng)受到抑制后,可代替進(jìn)行乙酸型產(chǎn)甲烷[17,38],因此的富集也許可以代行乙酸型產(chǎn)甲烷功能.而耐受性強(qiáng)的則維持了群落氫型產(chǎn)甲烷功能[39].因此,產(chǎn)甲烷階段不一定是氨抑制失穩(wěn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

2.3 氨氮對(duì)微生物代謝途徑的影響

分析產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和產(chǎn)甲烷階段功能基因的響應(yīng),而由于本研究及前期研究普遍認(rèn)為水解酸化階段不是導(dǎo)致氨抑制失穩(wěn)的關(guān)鍵[3],本研究未關(guān)注此階段.

2.3.1 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段 水解酸化產(chǎn)物,如丙酸、丁酸等,不能直接被產(chǎn)甲烷菌利用,而要先被產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌轉(zhuǎn)化為乙酸和H2,再分別被乙酸型和氫型產(chǎn)甲烷菌降解.產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段包括丁酸及更長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化、丙酸互營(yíng)氧化和SAO.其中,丁酸及更長(zhǎng)鏈脂肪酸主要通過(guò)β氧化途徑降解,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和本研究檢測(cè)到的基因,簡(jiǎn)化脂肪酸β氧化途徑如圖2a,脂肪酸β氧化產(chǎn)乙酸的過(guò)程就是脂肪酸的羧基在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中與輔酶A結(jié)合,生成?；o酶A,并循環(huán)往復(fù)地被催化脫去乙基,直至生成乙酰輔酶A,乙酰輔酶A通過(guò)三羧酸循環(huán)生成乙酸.

圖2b展示了β氧化途徑相關(guān)基因的豐度變化,通過(guò)對(duì)樣本進(jìn)行差異檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的相對(duì)豐度在不同氨氮濃度下具有顯著差異,分別是烯酰輔酶A水合酶編碼基因()、乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因()和丁酰輔酶A脫氫酶編碼基因().其中,和均在TAN為3000mg/L時(shí)得到顯著富集,在TAN為6000mg/L時(shí)其相對(duì)豐度則維持在R1_3000水平,說(shuō)明這2個(gè)基因氨耐受性強(qiáng),但低氨氮環(huán)境更有助于它們的高度表達(dá),這可能是TAN為3000mg/L的反應(yīng)器中微生物群落丁酸氧化功能更優(yōu),系統(tǒng)性能得以恢復(fù)的原因之一.丁酸的互營(yíng)氧化過(guò)程中,關(guān)鍵步驟是丁酰輔酶A的氧化,涉及到?；o酶A氧化酶編碼基因()//酰基輔酶A脫氫酶編碼基因(),在低氨氮環(huán)境中顯著上調(diào)(< 0.05),而在高氨氮環(huán)境中受到嚴(yán)重抑制(<0.05),導(dǎo)致負(fù)責(zé)丁酰輔酶A氧化的基因總相對(duì)豐度下降了46.78%.由此可見(jiàn),丁酸互營(yíng)氧化途徑確實(shí)受到了高濃度氨氮的影響,證實(shí)了2.1節(jié)的推論.

圖2 脂肪酸β氧化途徑及相關(guān)基因豐度變化

丙酸互營(yíng)氧化途徑主要為甲基丙二酰輔酶A途徑(MMC途徑).如圖3a所示,丙酸首先被活化為丙酰輔酶A,然后通過(guò)MMC途徑進(jìn)行互營(yíng)降解,轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A后進(jìn)入三羧酸循環(huán),被進(jìn)一步氧化為乙酸.對(duì)于丙酸活化過(guò)程,由圖3b可知,丙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶編碼基因()和乙酸輔酶A連接酶編碼基因()在2個(gè)氨氮濃度下都保持穩(wěn)定.磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因()在TAN為3000mg/L時(shí)受到抑制作用,與Yu等[27]的研究結(jié)果類似.催化輔酶A和CH3-CO-Pi生成Acetyl-CoA,CH3-CO-Pi可以可溶性CH3-CO-PO4K2、CH3-CO-PO4Na2及其他金屬離子的形式存在.在產(chǎn)甲烷菌的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中,大多數(shù)金屬離子會(huì)不受控的富集,同時(shí)氨分子向細(xì)胞壁擴(kuò)散的可控性較差,也會(huì)因質(zhì)子泵而在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中積累,2者反應(yīng)生成CH3-CO-PO4[NH4]2,預(yù)期轉(zhuǎn)化率超過(guò)90%,且反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀[27].而根據(jù)研究報(bào)道,氨氮對(duì)的抑制率可達(dá)95.57%[27].因此,CH3- CO-Pi更多的被用于與氨分子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為CH3- CO-PO4[NH4]2沉積物,由于底物缺乏,丙酸通過(guò)丙酰磷酸生成丙酰輔酶A路徑受到抑制.但是乙酰輔酶A合成酶編碼基因()相對(duì)豐度在R3_3000開(kāi)始上升,增長(zhǎng)率為8.91%,丙酸活化過(guò)程代謝途徑的轉(zhuǎn)變,有助于維持丙酸活化功能.Yu等[27]運(yùn)行了5組TAN濃度不等(171.17～3043.83mg/L)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器,也發(fā)現(xiàn)了丙酸活化途徑從生成丙酰磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯杀Ｏ佘账?相比之下,TAN為6000mg/L時(shí),相對(duì)豐度并無(wú)顯著變化(>0.05),但在兩批次氨氮暴露過(guò)程中,相對(duì)豐度持續(xù)下降,較R1_3000下降約24.28%,在一定程度上影響了丙酸活化功能.

對(duì)于MMC途徑,丙酰輔酶A羧化酶α鏈編碼基因()與類似,在R2_3000和R2_6000中豐度均顯著下降(<0.05),但持續(xù)暴露在低氨氮環(huán)境中,該基因相對(duì)豐度開(kāi)始上調(diào),增長(zhǎng)率為17.45%,而在高氨氮環(huán)境中,該基因的受抑制情況毫無(wú)改善, 其在R3_6000組樣品中的相對(duì)豐度較R1_3000組少54.73%.相比之下,連續(xù)暴露下甲基丙二酰輔酶A編碼基因()和甲基丙二酰輔酶A變位酶編碼基因()的相對(duì)豐度也有所下降,但其在兩個(gè)氨氮濃度下(R2_3000和R2_6000、R3_3000和R3_6000)并沒(méi)有顯著差異(>0.05),因此它們可能不是氨抑制失穩(wěn)的關(guān)鍵基因.

圖3 MMC途徑及相關(guān)基因豐度變化

由此可見(jiàn),MMC途徑的關(guān)鍵基因受到不可逆抑制是高氨氮環(huán)境丙酸大量積累的主要原因,進(jìn)一步證實(shí)了丙酸互營(yíng)氧化過(guò)程是反應(yīng)器失穩(wěn)的根源.

SAO是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段中的特殊環(huán)節(jié),該環(huán)節(jié)在乙酸代謝受阻時(shí),發(fā)揮重要作用[39],將乙酸轉(zhuǎn)化為H2和CO2進(jìn)而被氫型產(chǎn)甲烷菌代謝.大多數(shù)已鑒定的SAOB都是通過(guò)反向Wood-Ljungdahl途徑(WL途徑)進(jìn)行乙酸氧化[40].反向WL途徑由2個(gè)分支組成,甲基分支和羧基分支.在甲基分支中,乙酰輔酶A被氧化為甲基進(jìn)而氧化為CO2,而在羧基分支中,乙酰輔酶A被氧化為CO進(jìn)而氧化為CO2(圖4a).

圖4 WL途徑及相關(guān)基因豐度變化

如圖4b所示,TAN為3000mg/L時(shí),甲基分支中亞甲基四氫葉酸還原酶編碼基因()、四氫葉酸連接酶編碼基因()的表達(dá)受到抑制,但羧基分支相關(guān)基因均得到富集,總相對(duì)豐度上調(diào)約11.76%,維持了群落互營(yíng)乙酸氧化功能;TAN為6000mg/L時(shí),羧基分支部分一氧化碳脫氫酶編碼基因()的表達(dá)受到抑制,但甲基分支中、亞甲基四氫葉酸脫氫酶編碼基因()得到富集,有助于維持群落互營(yíng)乙酸氧化功能,從而避免了系統(tǒng)乙酸的積累,與Ruiz-Sánchez等[41]的研究結(jié)果一致.由此可見(jiàn),此環(huán)節(jié)并不是氨抑制失穩(wěn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié).很多研究都指出反應(yīng)器受到氨擾動(dòng)后,除了乙酸型產(chǎn)甲烷途徑,乙酸還會(huì)通過(guò)SAO-HM產(chǎn)甲烷[30,39],氫和還原力通過(guò)SAO途徑得到釋放,是厭氧微生物應(yīng)對(duì)氨氮抑制的重要適應(yīng)性機(jī)制[32].此外,雖然SAO代謝途徑?jīng)]有受損,但本研究卻沒(méi)有檢測(cè)到常見(jiàn)的SAOB,推測(cè)系統(tǒng)中可能存在未知的SAOB,后續(xù)可結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證.

2.3.2 產(chǎn)甲烷階段 厭氧消化的最后1個(gè)階段是產(chǎn)甲烷,根據(jù)底物類型的不同,產(chǎn)甲烷途徑包括:乙酸型產(chǎn)甲烷(M00357)、還原CO2型產(chǎn)甲烷(M00567)、甲醇型產(chǎn)甲烷(M00356)以及甲胺型產(chǎn)甲烷(M00563)4種[42].

圖5 產(chǎn)甲烷途徑及相關(guān)基因豐度變化

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)于M00357,乙酸通過(guò)兩種機(jī)制轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A,其一是乙酸經(jīng)乙酸激酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化利用1分子ATP轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A,主要采用這種機(jī)制;另一種是乙酸通過(guò)乙酰輔酶A合成酶和2分子ATP被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,代表微生物是[42].乙酰輔酶A再分別由乙酰輔酶A羧化酶、四氫甲蝶呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶催化生成甲基輔酶M.對(duì)于M00567,甲酰甲烷呋喃脫氫酶催化還原CO2為甲?；矁r(jià)連接于甲烷呋喃的氨基基團(tuán)形成甲酰甲烷呋喃,接下來(lái)甲酰甲烷呋喃在四氫甲烷蝶呤甲酰轉(zhuǎn)移酶、甲酰四氫甲烷蝶呤環(huán)化水解酶等酶的催化下形成甲基輔酶M[42].M00356和M00563都屬于甲基營(yíng)養(yǎng)途徑,甲基化合物在特殊的輔酶M甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)作用下將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到HS-CoM的巰基上生成甲基輔酶M[42].4個(gè)途徑都包括的共有部分為甲基輔酶M轉(zhuǎn)化為甲烷及輔酶M-S-S-輔酶B轉(zhuǎn)化為輔酶B兩步.

4條完整途徑都在本研究中被檢測(cè)到,由圖5可見(jiàn),R3_3000中4條途徑相關(guān)基因相對(duì)豐度之和均大于R3_6000,盡管R3_3000產(chǎn)甲烷代謝功能整體優(yōu)于R3_6000,但是從基因相對(duì)豐度的變化來(lái)看,4條產(chǎn)甲烷代謝途徑都表現(xiàn)出對(duì)氨的極強(qiáng)抗性,尤其是甲基型產(chǎn)甲烷途徑和共有代謝途徑在兩個(gè)氨氮濃度下均被顯著富集,說(shuō)明氨氮并沒(méi)有抑制群落產(chǎn)甲烷功能.具體來(lái)看,甲基型產(chǎn)甲烷途徑所獨(dú)有的基因和4條途徑共有的基因在氨氮的刺激下均顯著上調(diào)(<0.05),其中,四氫甲烷蝶呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因()的富集有助于增強(qiáng)魯棒性[43],解釋了物種分析中的顯著富集現(xiàn)象.氫型產(chǎn)甲烷途徑所獨(dú)有的基因在不同批次的馴化下均保持穩(wěn)定,SAO途徑可為氫型產(chǎn)甲烷途徑提供電子和碳源[27],結(jié)合SAO途徑的穩(wěn)定再次暗示了系統(tǒng)中可能存在未知SAOB.對(duì)于乙酸型產(chǎn)甲烷途徑所獨(dú)有的基因,高氨氮環(huán)境中,被強(qiáng)烈抑制(>0.05),但乙酸激酶編碼基因()和均保持穩(wěn)定,如前所述,主要采用前者進(jìn)行產(chǎn)甲烷,主要采用后者進(jìn)行產(chǎn)甲烷,結(jié)合物種分析中和相對(duì)豐度的變化,有效證明了本研究中代替維持了乙酸型產(chǎn)甲烷的推論.

另一方面,丙酸和丁酸代謝需要丙酸互營(yíng)氧化功能、丁酸互營(yíng)氧化功能和耗氫的CO2還原型產(chǎn)甲烷功能共同作用,CO2還原途徑是厭氧消化過(guò)程中電子流動(dòng)的關(guān)鍵,氫型產(chǎn)甲烷菌通過(guò)該途徑降解低濃度H2/甲酸鹽,有助于推動(dòng)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段的順利進(jìn)行[44],后者基因功能的穩(wěn)定也說(shuō)明失穩(wěn)狀態(tài)下,丙酸、丁酸代謝受阻僅歸因于前端丙酸、丁酸互營(yíng)氧化過(guò)程被氨氮抑制.總之,群落產(chǎn)甲烷功能并不是氨抑制失穩(wěn)的根本原因.

3 結(jié)論

3.1 氨氮影響厭氧消化系統(tǒng)性能和產(chǎn)氣動(dòng)力學(xué). TAN為3000mg/L時(shí),長(zhǎng)期暴露可使厭氧消化系統(tǒng)性能優(yōu)化;TAN為6000mg/L時(shí),長(zhǎng)期暴露無(wú)法恢復(fù)系統(tǒng)的性能.

3.2 多樣性和高豐度保障了水解酸化菌在氨脅迫下代謝底物的能力,水解酸化階段不是系統(tǒng)運(yùn)行失敗的原因.

3.3 高氨氮環(huán)境中,甲基型產(chǎn)甲烷途徑相關(guān)基因被富集,氫型產(chǎn)甲烷途徑相關(guān)基因保持穩(wěn)定,乙酸型產(chǎn)甲烷途徑由經(jīng)乙酰輔酶A合成酶催化直接生成乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)橛梢宜峒っ负土姿嵋阴＾D(zhuǎn)移酶聯(lián)合催化生成乙酰輔酶A,維持了群落乙酸型產(chǎn)甲烷功能.因此產(chǎn)甲烷代謝途徑對(duì)氨的極強(qiáng)抗性及其本身的代謝冗余性,也保障了群落產(chǎn)甲烷功能.

3.4 產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段中,高氨氮抑制了關(guān)鍵基因和的表達(dá),影響了群落互營(yíng)丁酸和丙酸氧化功能,由此引起高氨氮反應(yīng)器中丁酸和丙酸的積累,反應(yīng)器產(chǎn)氣性能下降.鑒于此,互營(yíng)丁酸和丙酸氧化是高氨氮反應(yīng)器過(guò)程失穩(wěn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

[1] Wu D, Li L, Zhao X F, et al. Anaerobic digestion: A review on process monitoring [J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2019,103:1-12.

[2] Li L, Peng X Y, Wang X M, et al. Anaerobic digestion of food waste: A review focusing on process stability [J]. Bioresource Technology, 2018,248:20-28.

[3] Chen H, Wang W, Xue L N, et al. Effects of ammonia on anaerobic digestion of food waste: Process performance and microbial community [J]. Energy & Fuels, 2016,30(7):5749-5757.

[4] Bi S J, Mw D, Westerholm M, et al. The metabolic performance and microbial communities of anaerobic digestion of chicken manure under stressed ammonia condition: A case study of a 10-year successful biogas plant [J]. Renewable Energy, 2021,167:644-651.

[5] Wijesinghe D T N, Suter H C, Scales P J, et al. Lignite addition during anaerobic digestion of ammonium rich swine manure enhances biogas production [J]. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2021, 9(1):104669.

[6] Meng X S, Sui Q W, Liu J B, et al. Relieving ammonia inhibition by zero-valent iron (ZVI) dosing to enhance methanogenesis in the high solid anaerobic digestion of swine manure [J]. Waste Management, 2020,118:452-462.

[7] Niu Q G, Qiao W, Qiang H, et al. Microbial community shifts and biogas conversion computation during steady, inhibited and recovered stages of thermophilic methane fermentation on chicken manure with a wide variation of ammonia [J]. Bioresource Technology, 2013,146:223-233.

[8] Yang Z Y, Wang W, He Y F, et al. Effect of ammonia on methane production, methanogenesis pathway, microbial community and reactor performance under mesophilic and thermophilic conditions [J]. Renewable Energy, 2018,125:915-925.

[9] Bi S J, Qiao W, Xiong L P, et al. Improved high solid anaerobic digestion of chicken manure by moderate in situ ammonia stripping and its relation to metabolic pathway [J]. Renewable Energy, 2020, 146:2380-2389.

[10] Buhlmann C H, Mickan B S, Jenkins S N, et al. Ammonia stress on a resilient mesophilic anaerobic inoculum: Methane production, microbial community, and putative metabolic pathways [J]. Bioresource Technology, 2019,275:70-77.

[11] Zhang N, Peng H J, Li Y, et al. Ammonia determines transcriptional profile of microorganisms in anaerobic digestion [J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2018,49(4):770-776.

[12] Peng X Y, Zhang S Y, Li L, et al. Long-term high-solids anaerobic digestion of food waste: Effects of ammonia on process performance and microbial community [J]. Bioresource Technology, 2018,262: 148-158.

[13] Fotidis I A, Karakashev D, Angelidaki I. Bioaugmentation with an acetate-oxidising consortium as a tool to tackle ammonia inhibition of anaerobic digestion [J]. Bioresource Technology, 2013,146:57-62.

[14] Li Y, Zhang Y, Kong X Y, et al. Effects of ammonia on propionate degradation and microbial community in digesters using propionate as a sole carbon source [J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2017,92(10):2538-2545.

[15] Bonk F, Popp D, Weinrich S, et al. Ammonia inhibition of anaerobic volatile fatty acid degrading microbial communities [J]. Frontiers in Microbiology, 2018,9:2921.

[16] Wang H Z, Yan Y C, Gou M, et al. Response of propionate-degrading methanogenic microbial communities to inhibitory conditions [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2019,189(1):233-248.

[17] Zhang H, Peng Y, Yang P J, et al. Response of process performance and microbial community to ammonia stress in series batch experiments [J]. Bioresource Technology, 2020,314:123768.

[18] Ruiz-Sánchez J, Campanaro S, Guivernau M, et al. Effect of ammonia on the active microbiome and metagenome from stable full-scale digesters [J]. Bioresource Technology, 2018,250:513-522.

[19] 何 琴,李 蕾,瞿 莉,等.餐廚垃圾干式厭氧消化污泥膨脹微生態(tài)特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué). 2018,38(3):1010-1017.

He Q, Li L, Qu L, et al. Microbial characteristics of bulking sludge in high-solids anaerobic digestion of kitchen waste [J]. Chinese Environmental Science, 2018,38(3):1010-1017.

[20] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局水與廢水監(jiān)測(cè)分析方法編委會(huì).水與廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M]. 北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2002.

State Environmental Protection Administration. Determination methods for examination of water and wastewater [M]. Beijing:China Environmental Science Press, 2002.

[21] Chen S S, He J, Wang H Y, et al. Microbial responses and metabolic pathways reveal the recovery mechanism of an anaerobic digestion system subjected to progressive inhibition by ammonia [J]. Chemical Engineering Journal, 2018,350:312-323.

[22] Ma X X, Yu M, Song N, et al. Effect of ethanol pre-fermentation on organic load rate and stability of semi-continuous anaerobic digestion of food waste [J]. Bioresource Technology, 2020,299:122587.

[23] Li D, Liu S C, Mi L, et al. Effects of feedstock ratio and organic loading rate on the anaerobic mesophilic co-digestion of rice straw and cow manure [J]. Bioresource Technology, 2015,189:319-326.

[24] Gomes C S, Strangfeld M, Meyer M. Diauxie studies in biogas production from gelatin and adaptation of the modified Gompertz model: Two-phase Gompertz model [J]. Applied Sciences-basel, 2021, 11(3):1067.

[25] Gu J, Liu R, Cheng Y, et al. Anaerobic co-digestion of food waste and sewage sludge under mesophilic and thermophilic conditions: Focusing on synergistic effects on methane production [J]. Bioresource Technology, 2020,301:122765.

[26] Li L, He Q, Zhao X F, et al. Anaerobic digestion of food waste: Correlation of kinetic parameters with operational conditions and process performance [J]. Biochemical Engineering Journal, 2018,130:1-9.

[27] Yu D W, Zhang J Y, Chulu B, et al. Ammonia stress decreased biomarker genes of acetoclastic methanogenesis and second peak of production rates during anaerobic digestion of swine manure [J]. Bioresource Technology, 2020,317:124012.

[28] Kurade M B, Saha S, Kim J R, et al. Microbial community acclimatization for enhancement in the methane productivity of anaerobic co-digestion of fats, oil, and grease [J]. Bioresource Technology, 2020,296:122294.

[29] Tian H L, Fotidis I A, Mancini E, et al. Acclimation to extremely high ammonia levels in continuous biomethanation process and the associated microbial community dynamics [J]. Bioresource Technology, 2018,247:616-623.

[30] Pan X F, Zhao L, Li C X, et al. Deep insights into the network of acetate metabolism in anaerobic digestion: focusing on syntrophic acetate oxidation and homoacetogenesis [J]. Water Research, 2021, 190:116774.

[31] Li Y, Sun Y M, Yang G X, et al. Vertical distribution of microbial community and metabolic pathway in a methanogenic propionate degradation bioreactor [J]. Bioresource Technology, 2017,245:1022-1029.

[32] 鄧玉營(yíng).共培養(yǎng)菌群強(qiáng)化秸稈厭氧消化及微生物學(xué)機(jī)制研究 [D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2017.

Deng Y Y. Enhanced anaerobic digestion of straw via co-cultivated consortia and its underlying microbial mechanisms [D]. Wuxi: Jiangnan University, 2017.

[33] 張 虹,李 蕾,彭 韻,等.氨氮對(duì)餐廚垃圾厭氧消化性能及微生物群落的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2020,40(8):3465-3474.

Zhang H, Li L, Peng Y, et al. Effects of ammonia on anaerobic digestion of food waste: Process performance and microbial community [J]. China Environmental Science, 2020,40(8):3465-3474.

[34] Yin D M, Westerholm M, Qiao W, et al. An explanation of the methanogenic pathway for methane production in anaerobic digestion of nitrogen-rich materials under mesophilic and thermophilic conditions [J]. Bioresource Technology, 2018,264:42-50.

[35] Du J, Yin Q D, Gu M Q, et al. New insights into the effect of ethanol and volatile fatty acids proportions on methanogenic activities and pathways [J]. Environmental Research, 2021,194:110644.

[36] Saha S, Jeon B H, Kurade M B, et al. Interspecies microbial nexus facilitated methanation of polysaccharidic wastes [J]. Bioresource Technology, 2019,289:121638.

[37] Xia X X, Zhang J C, Song T Z, et al. Stimulation of Smithella -dominating propionate oxidation in a sediment enrichment by magnetite and carbon nanotubes: Propionate syntrophy in the presence of conductive materials [J]. Environmental Microbiology Reports, 2019,11(2):236-248.

[38] 孫航宇,楊紫怡,李瀟男,等. ADM1模型對(duì)生物強(qiáng)化厭氧產(chǎn)甲烷體系的模擬 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2020,40(3):1049-1058.

Sun H Y, Yang Z Y, Li X N, et al. Simulation of anaerobic digestion based on bioaugmentation by ADM1 [J]. Chinese Environmental Science, 2020,40(3):1049-1058.

[39] Westerholm M, Dolfing J, Schnurer A. Growth characteristics and thermodynamics of syntrophic acetate oxidizers [J]. Environmental Science & Technology, 2019,53(9):5512-5520.

[40] Westerholm M, Moestedt J, Schnurer A. Biogas production through syntrophic acetate oxidation and deliberate operating strategies for improved digester performance [J]. Applied Energy, 2016,179:124-135.

[41] Ruiz-Sánchez J, Guivernau M, Fernandez B, et al. Functional biodiversity and plasticity of methanogenic biomass from a full-scale mesophilic anaerobic digester treating nitrogen-rich agricultural wastes [J]. Science of the Total Environment, 2019,649:760-769.

[42] 方曉瑜,李家寶,芮俊鵬,等.產(chǎn)甲烷生化代謝途徑研究進(jìn)展 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2015,21(1):1-9.

Fang X Y, Li J B, Rui J P, et al.Research progress in biochemical pathways of methanogenesis [J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2015,21(1):1-9.

[43] Yan M, Treu L, Campanaro S, et al. Effect of ammonia on anaerobic digestion of municipal solid waste: inhibitory performance, bioaugmentation and microbiome functional reconstruction [J]. Chemical Engineering Journal, 2020,401:126159.

[44] Leng L, Yang P X, Singh S, et al. A review on the bioenergetics of anaerobic microbial metabolism close to the thermodynamic limits and its implications for digestion applications [J]. Bioresource Technology, 2018,247:1095-1106.

Metagenomic analysis on the responses of microbial community to ammonia stress.

PENG Yun, LI Lei*, WU Di, YANG Ping-jin, PENG Xu-ya, WANG Xiao-ming

(Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China)., 2022,42(2)：777～786

A series of batch experiments were conducted to investigate the responses of anaerobic digestion (AD) microbial community exposed to ammonia (TAN) stress. In combination with Metagenomic sequencing analysis, this paper investigated the responses of process parameters, community structure/composition and functional gene/metabolic pathways of AD to the process disturbance induced by different TAN concentrations. The overall performance of AD system was gradually optimized at the concentration of 3000mg/L TAN while when TAN reached 6000mg/L, an accumulation of propionate and butyrate was observed with a concomitant decrease of methane yield. At both concentration levels, the resistance and redundancy of hydrolytic and acidogenic bacteria can ensure their metabolic performance for substrate degradation. However, the total relative abundance of acetogens and methanogens at the low concentration level continued to increase, whereas a low increase rate and even a decrease in the total relative abundance was observed at the high level, suggesting the potential process inhibition. By further analyzing the functional gene changes in the two process stages, The methanogenesis and syntrophic acetate oxidation pathways showed resistance and redundancy under the ammonia stress, but the high concentration of TAN (6000mg/L) inhibited the expression of key genesandin the syntrophic degradation of butyrate and propionate. Therefore, the key contributor to the ammonia inhibition turned out to be acetogenesis.

food waste；anaerobic digestion；ammonia stress；metagenomics

X705

A

1000-6923(2022)02-0777-10

彭 韻,(1993-),女,重慶人,重慶大學(xué)博士研究生,研究方向?yàn)楣腆w廢物污染控制與資源化.發(fā)表論文5篇.

2021-06-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51708057);重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(cstc2018jcyjAX0743)

* 責(zé)任作者, 副教授, lileich17@cqu.edu.cn