法舒地爾對早產(chǎn)鼠腦白質(zhì)損傷后OLs成熟及髓鞘形成的影響

唐穎林，徐瓊芳，許立婷

隨著早產(chǎn)兒救治技術(shù)的提高，早產(chǎn)兒存活率逐年上升。但是，有5%~10%的早產(chǎn)兒［包括50%低出生體質(zhì)量（＜1 kg）早產(chǎn)兒幸存者］存在腦白質(zhì)損傷（white matter injury，WMI）［1］。WMI可導(dǎo)致長期神經(jīng)功能損害，包括認(rèn)知延遲、運(yùn)動障礙、腦癱和神經(jīng)感覺障礙［2-3]。然而，目前尚無有效療法促進(jìn)早產(chǎn)兒WMI后神經(jīng)功能恢復(fù)。白質(zhì)的主要成分是髓鞘，是由成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）包繞神經(jīng)軸突形成的多層脂質(zhì)膜。OLs可提供代謝支持以滿足軸突的能量需求，確保髓鞘動作電位的精確、快速傳導(dǎo)［4］。越來越多的證據(jù)表明，WMI后髓鞘減少和成熟OLs數(shù)量不足的現(xiàn)象十分突出，這可能是由于未成熟OLs急性死亡，導(dǎo)致髓鞘發(fā)育缺陷和神經(jīng)行為改變［5］。因此，筆者推測保護(hù)OLs可以挽救髓鞘缺陷，從而改善WMI后神經(jīng)元功能的恢復(fù)。法舒 地 爾（Fasudil，F(xiàn)SD）是Rho/Rho激 酶（Rhoassociated coiled-coil forming kinase，ROCK）抑制劑，已被證明對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）相關(guān)疾病有治療作用［6］。在自身免疫性腦脊髓炎中，F(xiàn)SD可通過刺激抗炎反應(yīng)及促進(jìn)M1向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變、小膠質(zhì)細(xì)胞激活來減輕疾病的嚴(yán)重程度［7］。然而，F(xiàn)SD是否具有神經(jīng)再生和神經(jīng)保護(hù)作用尚待闡明。本研究旨在探討FSD對早產(chǎn)鼠WMI后OLs成熟及髓鞘形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、試劑及儀器（1）實(shí)驗(yàn)動物。20只懷孕的SPF級Sprague-Dawley大鼠（動情周期的第18~19天）購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司［生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2018-0004］，允許分娩（每只母鼠產(chǎn)10~14只幼仔）。幼仔的出生體質(zhì)量為5.5~7.0 g，平均（6.5±0.3）g。為排除性別干擾，選擇90只雄性幼仔及其母親飼養(yǎng)在12 h明暗循環(huán)、無特定病原體環(huán)境中，并自由獲得食物和水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將90只幼仔分為假手術(shù)組、WMI組和FSD組，每組30只；除假手術(shù)組外，WMI組和FSD組建立WMI模型；WMI組、FSD組各有5只在造模后死亡。（2）試劑。FSD購自天津大通紅日制藥有限公司；5%胎牛血清白蛋白、0.2%Triton X-100、picrotoxin購自美國Sigma公司；山羊抗鼠多克隆Olig2、山羊抗鼠單克隆Nkx2.2購自美國Cell Signaling公司；兔抗鼠單克隆髓鞘堿性蛋白（MBP）、Cy-3結(jié)合驢抗山羊二抗購自美國Abcam公司；ECL系統(tǒng)購自美國GE Healthcare公司；人工腦脊液購自福州Phygene生物科技有限公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；Laemmli緩沖液購自美國Bio-Rad公司。（3）儀器。VT1200半自動振動刀片切片機(jī)、MS 1850冰凍切片機(jī)購自德國Leica公司，Axio Imager M2熒光顯微鏡購自德國Zeiss公司，LKB-V超薄切片機(jī)購自瑞士LKB-Produkter公司，HT7700透射電子顯微鏡購自日本HITACHI公司，BX51WI顯微鏡購自日本Olympus公司，Digidata-1440A接口購自美國Axon Instruments公司。

1.2 方法

1.2.1 WMI模型建立及治療 使用出生后第2天（P2）的幼鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先將吸入異氟醚麻醉1~2 min后的幼鼠固定在手術(shù)臺上，選取頸部中線做1.0 cm的切口，行右側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎術(shù)。WMI組和FSD組均采用5-0縫合線結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，手術(shù)完成時(shí)間＜10 min。隨后將WMI組和FSD組幼鼠放回鼠籠中2 h后再次取出，并暴露于低氧（94%N2+6%O2）環(huán)境中2 h后放回鼠籠。假手術(shù)組幼鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)過程，但不進(jìn)行結(jié)扎和缺氧暴露。其后連續(xù)4 d給予FSD組幼鼠腹腔注射FSD 25 mg/（kg·d），而假手術(shù)組與WMI組只給予等量生理鹽水。

1.2.2 各實(shí)驗(yàn)分組方法 共使用80只幼鼠，分為4個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。（1）實(shí)驗(yàn)1考察FSD對WMI幼鼠神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度和OLs細(xì)胞凋亡、成熟的影響，包括3組：假手術(shù)組（n=8）、WMI組（n=7）和FSD組（n=7）。各組隨機(jī)抽取6只幼鼠分別在缺氧暴露后0.5、1、2、4、7 d進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評估。并在缺氧暴露后7 d（P9），于完成神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評估后，各組選取5只幼鼠用1%戊巴比妥鈉深度麻醉，收集腦組織進(jìn)行OLs細(xì)胞凋亡、成熟評估。（2）實(shí)驗(yàn)組2考察FSD對WMI幼鼠髓鞘的影響。該組中包括3組小鼠：假手術(shù)組（n=8）、WMI組（n=6）和FSD組（n=6）。所有小鼠在缺氧暴露后12 d（P14），各組選取5只幼鼠用1%戊巴比妥鈉深度麻醉，收集腦組織進(jìn)行胼胝體和放射冠中MBP體積分?jǐn)?shù)、腦組織中MBP蛋白表達(dá)、胼胝體和放射冠的超微結(jié)構(gòu)評估。（3）實(shí)驗(yàn)組3考察FSD對WMI幼鼠體外電生理學(xué)的影響。該組中包括3組小鼠：假手術(shù)組（n=8）、WMI組（n=6）和FSD組（n=6）。所有小鼠在缺氧暴露后19 d（P21），用1%戊巴比妥鈉深度麻醉，收集腦組織進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。（4）實(shí)驗(yàn)組4考察FSD對WMI幼鼠運(yùn)動行為的影響。該組中包括3組小鼠（n=6）：假手術(shù)組、WMI組和FSD組。所有小鼠在缺氧暴露后38 d（P40）進(jìn)行平衡測試和新型物體識別測試。

1.2.3 神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分 分別在術(shù)后0.5、1、2、4、7 d進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評估。神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，大鼠前爪不能伸展；2分，爬行時(shí)向左旋轉(zhuǎn)；3分，爬行時(shí)向左翻滾；4分，不能獨(dú)立行走或失去知覺［8］。得分越高，表明腦損傷越嚴(yán)重。

1.2.4 腦組織處理 幼鼠用1%戊巴比妥鈉深度麻醉，用0.01 mol/L PBS沖洗后經(jīng)心灌注4%多聚甲醛。收集腦組織，并在4%多聚甲醛中固定過夜，然后分別經(jīng)15%、30%蔗糖梯度脫水后在MS 1850冰凍切片機(jī)上進(jìn)行冰凍切片（20μm）。

1.2.5 TUNEL分析OLs細(xì)胞凋亡 在出生后第9天時(shí)檢測細(xì)胞凋亡，切片用PBS沖洗2次，每次30 min，然后用0.1%Triton X-100在冰上處理20 min；在37℃黑暗環(huán)境中，用含有45μL核苷酸反應(yīng)液和5μL酶溶液的TUNEL反應(yīng)緩沖液孵育1 h；然后用PBS清洗切片3次，每次15 min，以去除未結(jié)合的熒光素dUTP。用熒光顯微鏡觀察樣品，激發(fā)波長為450~500 nm。TUNEL陽性染色為綠色。隨機(jī)讀取圍繞胼胝體和放射冠的6個非重疊區(qū)域，400倍鏡下計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞，取平均值。

1.2.6 免疫熒光染色檢測Olig2、MBP和Nkx2.2表達(dá) 腦組織切片在PBS中脫蠟清洗，用5%胎牛血清白蛋白和0.2%Triton X-100在室溫下阻斷切片2 h，然后加入山羊抗鼠多克隆Olig2（1∶200）、兔抗鼠單克隆MBP（1∶200）、山羊抗鼠單克隆Nkx2.2（1∶200），4℃下孵育過夜；加入Cy-3結(jié)合驢抗山羊二級抗體（1∶500），室溫下孵育2 h。使用Axio Imager M2熒光顯微鏡拍攝熒光圖像。MBP和Olig2免疫染色為紅色，Nkx2.2免疫染色為綠色。通過用Olig2和Nkx2.2抗體對切片進(jìn)行雙重標(biāo)記來評估OPCs成熟情況。采用Stereologer軟件（美國Stereology Resource Center公司）計(jì)算幼鼠放射冠和胼胝體中MBP的體積分?jǐn)?shù)。

1.2.7 Western blot檢測MBP蛋白表達(dá) 在出生后第14天時(shí)，使用機(jī)械均質(zhì)器在樣品緩沖液（3%SDS、10%甘油和62.5 mmol/L Tris-HCl）中均質(zhì)冷凍腦組織，然后在離心前超聲處理裂解物。使用BCA蛋白分析試劑盒測量上清液蛋白質(zhì)濃度。在Laemmli緩沖液中煮沸樣品后，通過SDS-PAGE分離總蛋白樣品。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子質(zhì)量，將等量的蛋白質(zhì)（20μg）裝載到4%~20%梯度預(yù)制凝膠。將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；然后將膜在4℃下與一抗MBP（1∶200）或β-actin（1∶1 000）孵育過夜。次日在室溫下與HRP結(jié)合的二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000）共孵育1 h。最后在化學(xué)發(fā)光ECL系統(tǒng)檢測目標(biāo)蛋白，采用ImageJ軟件分析灰度值并計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 電子顯微鏡檢測髓軸突 在出生后第14天時(shí)，幼鼠用含有1.25%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS灌注。快速移除大腦，并在培養(yǎng)皿中解剖放射冠和胼胝體。將白質(zhì)組織標(biāo)本固定于2.5%戊二醛中過夜；然后將組織樣本在pH7.4的0.1 mol/L碳酸鈉緩沖液中洗滌，在含1%四氧化鋨的PBS中固定2 h，1%醋酸鈾酰整體染色，梯度（30%~60%）乙醇脫水，后嵌入環(huán)氧樹脂中。使用LKB-V超薄切片機(jī)切割超薄切片（60 nm），并在HT7700透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.9 體外電生理學(xué)分析頻率和振幅 在出生后第21天時(shí)進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。切片（300~400μm）用VT1200半自動振動刀片切片機(jī)切割，移至充氧人工腦脊液中。采用配備紅外差分干涉對比度的BX51WI顯微鏡對皮質(zhì)錐體神經(jīng)元進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。電生理信號通過Digidata-1440A接口輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。神經(jīng)元膜電位維持在-70 mV，注入5 mV、50 ms的矩形電壓脈沖，監(jiān)測全細(xì)胞膜電容、串聯(lián)電阻和膜電阻。如果串聯(lián)電阻變化超過15%，神經(jīng)元被排除。將1μmol/L河豚毒素和100μmol/L木防己苦毒素預(yù)先添加到正常的人工腦脊液中，記錄至少15 min的小興奮性突觸后電流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）。使用Mini analysis 6.0（美國Synaptosoft公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.10 平衡測試和新型物體識別測試動物行為 出生后第40天時(shí)對幼鼠進(jìn)行行為測試。所有測試均在12∶00—18∶00進(jìn)行。測試包括：（1）平衡測試。將一束0.5 cm寬的橫梁放在離地面50 cm的暗室中，一端用燈照明，另一端放在一個盒子中（不透明，20 cm×20 cm×10 cm）。在訓(xùn)練期間，將從籠子中取出的填充物放在盒子中，以吸引幼鼠按30、50和70 cm長的距離在橫梁上行走。實(shí)驗(yàn)前將幼鼠置于光照下，每天訓(xùn)練3次，連續(xù)3 d。在測試當(dāng)天，從橫梁兩側(cè)錄制視頻，記錄當(dāng)幼鼠行走80 cm長距離時(shí)，后肢滑脫的頻率，作為橫梁行走性能的指標(biāo)。（2）新型物體識別測試。實(shí)驗(yàn)裝置由1個白色的聚乙烯醇塑料方形開闊場地（40 cm×25 cm×25 cm）組成。2個長方形的塑料物體放置在離墻壁8 cm的地方，將幼鼠置于其中5 min。2 h后，其中一個長方形物體被一個圓柱體取代，然后將同一只鼠置于其中5 min。識別指數(shù)為幼鼠識別新物體所花費(fèi)的時(shí)間與探測兩個物體所花費(fèi)的總時(shí)間之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad PRISM 5.0軟件和SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)或Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分比較（1）組間比較：WMI組在術(shù)后0.5、1、2、4、7 d時(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分均高于假手術(shù)組（P＜ 0.05）；FSD組在術(shù)后0.5、1、2、4 d時(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分均顯著低于WMI組（P＜ 0.05）。（2）組內(nèi)比較：假手術(shù)組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；WMI組和FSD組術(shù)后2、4 d時(shí)的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分低于術(shù)后0.5、1 d，術(shù)后7 d低于術(shù)后0.5、1、2 d（P＜ 0.05），見表1。

2.2 FSD對WMI幼鼠OLs細(xì)胞凋亡以及成熟的影響 WMI組P9幼鼠胼胝體、放射冠中凋亡細(xì)胞總數(shù)以及OLs凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組凋亡細(xì)胞總數(shù)和OLs凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著少于WMI組（P＜0.05）。WMI組胼胝體和放射冠中OLs成熟細(xì)胞數(shù)量顯著少于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組OLs成熟細(xì)胞數(shù)量顯著多于WMI組（P＜0.05）。見表2，圖1、2。

Tab.1 The neurological severity scores of rats after operation in different experimental groups表1 各組幼鼠術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分 （n=6，分，±s）

Tab.1 The neurological severity scores of rats after operation in different experimental groups表1 各組幼鼠術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重程度評分 （n=6，分，±s）

F組間=32.648，F(xiàn)時(shí)間=142.706，F(xiàn)交互=17.240，均P ＜ 0.05；＊P ＜ 0.05；組間比較：a與假手術(shù)組比較，b與WMI組比較，P ＜ 0.05；組內(nèi)比較：A與術(shù)后0.5 d比較，B與術(shù)后1 d比較，C與術(shù)后2 d比較，P ＜ 0.05。

組別假手術(shù)組WMI組FSD組F術(shù)后0.5 d 0.21±0.01 6.82±0.24a 4.06±0.13ab 44.815＊術(shù)后1 d 0.42±0.03 6.05±0.33a 3.56±0.08ab 40.365＊術(shù)后2 d 0.29±0.02 4.82±0.24aAB 2.07±0.14abAB 18.214＊術(shù)后4 d 0.23±0.01 3.48±0.14aAB 1.63±0.09abAB 12.092＊術(shù)后7 d 0.24±0.01 2.32±0.11aABC 1.14±0.13abABC 4.851＊F 0.427 13.844＊10.962＊

Tab.2 Comparison of apoptosis and maturation of OLs cells between the three groups表2 各組OLs細(xì)胞凋亡和成熟情況的比較（n=5，±s）

Tab.2 Comparison of apoptosis and maturation of OLs cells between the three groups表2 各組OLs細(xì)胞凋亡和成熟情況的比較（n=5，±s）

＊P ＜ 0.05；a與假手術(shù)組比較，b與WMI組比較，P ＜ 0.05；TUNEL+：總凋亡細(xì)胞；TUNEL+Olig2+：OLs凋亡細(xì)胞；Olig2+：總OLs細(xì)胞；Nkx2.2+Olig2+：OLs成熟細(xì)胞。

組別假手術(shù)組WMI組FSD組F TUNEL+OLs（個/mm2）TUNEL+6.1±0.2 21.0±1.2a 11.2±0.5ab 20.783＊TUNEL+Olig2+1.0±0.1 5.4±0.3a 2.2±0.2b 6.094＊Olig2+OLs（個/mm2）Olig2+710.0±32.3 804.0±54.7 749.0±61.8 2.513 Nkx2.2+Olig2+514.0±25.0 311.0±16.4a 553.2±32.5b 35.671＊

2.3 FSD對WMI幼鼠髓鞘的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，WMI組P14幼鼠胼胝體和放射冠中MBP體積分?jǐn)?shù)顯著低于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組MBP體積分?jǐn)?shù)高于WMI組（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，WMI組前腦組織中MBP蛋白表達(dá)水平低于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組MBP蛋白表達(dá)水平高于WMI組（P＜0.05）。胼胝體和放射冠的超微結(jié)構(gòu)評估結(jié)果顯示，WMI組幼鼠中有髓軸突數(shù)量少于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組有髓軸突數(shù)量多于WMI組（P＜0.05）。見圖3~5、表3。

2.4 FSD對WMI幼鼠運(yùn)動行為的影響 體外電生理學(xué)分析結(jié)果顯示，WMI組P21幼鼠腦中mEPSC頻率明顯低于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組mEPSC頻率顯著高于WMI組（P＜0.05）；各組mEPSC振幅差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。行為測試結(jié)果顯示，WMI組P40幼鼠后肢滑脫頻率和識別指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組后肢滑脫頻率和識別指數(shù)均低于WMI組（P＜0.05）。見圖6、表4。

Fig.1 Comparison of apoptosis of OLs between the three groups圖1 各組OLs細(xì)胞凋亡情況比較

Fig.2 Comparison of OLs cell maturation between the three groups圖2 各組OLs細(xì)胞成熟情況比較

Fig.3 Representative images of MBP of P14 pups in each group圖3 各組P14幼鼠MBP體積分?jǐn)?shù)比較

Fig.4 Western blot analysis of MBP of P14 pups in each group圖4 Western blot檢測各組P14幼鼠MBP的表達(dá)

Fig.5 Ultrastructure of corpus callosum and corona radiata of P14 pups in each group圖5 各組P14幼鼠胼胝體和放射冠的超微結(jié)構(gòu)

Tab.3 Comparison of myelination between the three groups of WMI rats表3 各組WMI幼鼠髓鞘形成情況比較（n=5，±s）

Tab.3 Comparison of myelination between the three groups of WMI rats表3 各組WMI幼鼠髓鞘形成情況比較（n=5，±s）

＊P ＜ 0.05；a與假手術(shù)組比較，b與WMI組比較，P ＜ 0.05。

組別假手術(shù)組WMI組FSD組F MBP體積分?jǐn)?shù)0.73±0.04 0.28±0.02a 0.47±0.04b 19.584＊MBP 1.23±0.06 0.34±0.03a 0.62±0.05b 28.199＊有髓軸突數(shù)（103個/mm2）17.78±1.24 6.43±0.45a 11.22±0.67b 41.951＊

Fig.6 The frequency and amplitude of mEPSC in each group analyzed by electrophysiology in vitro圖6 體外電生理學(xué)分析各組mEPSC頻率和振幅

Tab.4 Comparison of motor behavior recovery between the three groups of WMI rats表4 各組WMI幼鼠運(yùn)動行為恢復(fù)情況比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of motor behavior recovery between the three groups of WMI rats表4 各組WMI幼鼠運(yùn)動行為恢復(fù)情況比較（n=6，±s）

＊P ＜ 0.05；a與假手術(shù)組比較，b與WMI組比較，P ＜ 0.05。

組別假手術(shù)組WMI組FSD組F振幅（×10 Pa）1.72±0.38 1.37±0.24 1.45±0.33 1.835頻率（Hz）1.40±0.17 0.53±0.07a 1.22±0.14b 12.175＊后肢滑脫（次）1.18±0.24 7.42±1.06a 3.20±0.48ab 35.547＊識別指數(shù)0.23±0.02 0.64±0.07a 0.37±0.03ab 9.730＊

3 討論

研究顯示，WMI具有一系列病理特征的變化，包括髓鞘減少、突觸丟失、炎癥和細(xì)胞損傷，這可能是由于突觸形成受到抑制所致［9-10］。幼鼠出生后2~5 d，白質(zhì)中的膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞主要構(gòu)成少突膠質(zhì)細(xì)胞，此階段幼鼠大腦發(fā)育與人類早產(chǎn)兒白質(zhì)損傷的高危期（妊娠23~32周）相似［11-12］。本研究結(jié)果顯示，WMI幼鼠在缺氧后出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)缺損，表現(xiàn)為OLs細(xì)胞凋亡數(shù)量增加且成熟度降低，髓鞘減少以及突觸功能下降，與Zhang等［8］描述的WMI大鼠模型特征基本一致。另外，本研究結(jié)果顯示，通過腹腔注射FSD可明顯逆轉(zhuǎn)WMI幼鼠神經(jīng)系統(tǒng)缺損程度，促進(jìn)OLs成熟和髓鞘形成，改善WMI幼鼠運(yùn)動行為，提示FSD可促進(jìn)WMI幼鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

髓鞘在確保動作電位沿軸突的快速有效傳遞中發(fā)揮重要作用，其能改變軸突細(xì)胞骨架并誘導(dǎo)軸突外膜上離子通道的重新排列［13］。有研究顯示，OLs對不同的神經(jīng)元需求有指令作用，并在皮質(zhì)神經(jīng)元和視神經(jīng)的軸突上沉積不同數(shù)量的髓鞘［14］。因此，髓鞘形成的延遲可能會破壞或減緩軸突的信號傳遞，并最終對神經(jīng)元的發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。Rho/ROCK通路抑制劑對新生兒和成人缺氧缺血模型、阿爾茨海默病和帕金森病均具有神經(jīng)保護(hù)作用［15］。FSD是廣泛應(yīng)用的非選擇性ROCK抑制劑，其對脊髓損傷、阿爾茨海默病、卒中和帕金森病均表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)作用［16-17］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SD可促進(jìn)WMI幼鼠白質(zhì)OLs的存活和分化，并增加髓鞘形成。Li等［17］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SD處理的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液可促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞存活和少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟，并且FSD以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子依賴的方式直接促進(jìn)髓鞘再生。此外，F(xiàn)SD可促進(jìn)銅卟啉（CPZ）誘導(dǎo)的多發(fā)性硬化癥小鼠脫髓鞘的恢復(fù)［18］。以上研究提示FSD具有神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)髓鞘形成和神經(jīng)功能恢復(fù)的作用。

研究表明，在缺氧小鼠和其他發(fā)育性神經(jīng)元功能缺陷的嚙齒動物模型中，髓鞘形成的快速進(jìn)展與前3周突觸形成重疊，并且髓鞘形成可以促進(jìn)突觸發(fā)生，特別是興奮性突觸前神經(jīng)支配［19］。此外，神經(jīng)元活動的時(shí)間對突觸可塑性起著至關(guān)重要的作用，髓鞘形成可能通過促進(jìn)發(fā)育中CNS動作電位傳播的效率和速度參與突觸整合和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)［20］。本研究結(jié)果顯示，P21時(shí)WMI幼鼠腦中mEPSC頻率較假手術(shù)組明顯降低，F(xiàn)SD組mEPSC頻率較WMI組升高；P40時(shí)幼鼠后肢滑脫頻率和識別指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組，F(xiàn)SD組后肢滑脫頻率和識別指數(shù)均低于WMI組，提示FSD可通過促進(jìn)WMI幼鼠腦突觸形成來改善神經(jīng)元功能的恢復(fù)。

綜上所述，F(xiàn)SD具有保護(hù)和誘導(dǎo)OLs成熟、促進(jìn)髓鞘形成和神經(jīng)功能恢復(fù)的作用，有望成為早產(chǎn)兒WMI的治療藥物。