外源性硫化氫通過(guò)Nrf2/ARE/HO-1通路對(duì)精神分裂癥大鼠認(rèn)知功能及腸道屏障功能的影響

陳力，馬亞麗，李本亮

精神分裂癥是一種病因不明、危害性較大的慢性精神病，多在青壯年期緩慢、亞急性起病，臨床上患者常有感知覺(jué)、思維、行為、情感等多方面的障礙，且對(duì)其工作、日常生活、社交等有不利影響［1-2］。隨著病情的不斷進(jìn)展，部分患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能損害、腸道功能障礙等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及身體健康［3-4］。腸道屏障是機(jī)體復(fù)雜且重要的防御系統(tǒng)，主要通過(guò)抵御抗原進(jìn)入、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，精神分裂癥、糖尿病、膿毒癥等非消化系統(tǒng)疾病均可造成腸道屏障功能失調(diào)，進(jìn)而損害機(jī)體健康［4-5］。近年來(lái)硫化氫（H2S）在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)中的病理生理作用引起廣泛關(guān)注，如Sommer等［6］研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S作為精神分裂癥的抗氧化及抗炎介質(zhì)，可用于抗精神病治療；Cui等［7］研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S可顯著改善腸缺血再灌注大鼠腸黏膜損傷、腸黏膜細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷，但其作用機(jī)制仍不清晰。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）/血紅素氧化酶1（HO-1）通路是機(jī)體抵抗外界氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路之一，在保護(hù)神經(jīng)功能［8］、維持腸道屏障功能［9］等方面發(fā)揮重要作用。本研究以Nrf2/ARE/HO-1為切入點(diǎn)，探究外源性H2S對(duì)精神分裂癥大鼠認(rèn)知功能、腸道屏障功能的影響及其可能機(jī)制，旨在為臨床治療精神分裂癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，6~8周齡，體質(zhì)量200~240 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。大鼠于溫度22~24℃，相對(duì)濕度40%~60%，12 h/12 h晝夜交替的條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按照動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑及儀器 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑MK-801、GYY4137（H2S供體）、全反視黃酸（ATRA，Nrf2抑制劑）購(gòu)自上海陶素生化科技有限公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HE染色試劑盒、H2S含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；D-乳酸ELISA試劑盒（JL209792）購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；兔抗鼠Nrf2、HO-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗，IgG二抗購(gòu)自Abcam。組織脫水機(jī)（型號(hào)：ASP6025）、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)：BIOCUT）購(gòu)自德國(guó)Leica公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：BioScope Resolve）購(gòu)自美國(guó)BRUKER；酶標(biāo)儀（型號(hào)：SpectraMax i3x）購(gòu)自?shī)W地利Molecular Devices；蛋白電泳儀（型號(hào)：JY300）購(gòu)自北京君意華鑫；半干轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：TE70X）購(gòu)自美國(guó)Hoefer；凝膠成像儀（型號(hào)：Quantum CX5）購(gòu)自法國(guó)Vilber。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備及分組 精神分裂癥大鼠模型的制備參考文獻(xiàn)［10］，將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（8只）和造模組（32只），造模組大鼠通過(guò)腹腔注射0.2 mg/kg的MK-801構(gòu)建精神分裂癥大鼠模型，每天注射1次，連續(xù)注射2周；對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水。第15天通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型構(gòu)建情況，（造模組大鼠潛伏期-對(duì)照組大鼠潛伏期）/對(duì)照組大鼠潛伏期×100%＞20%表明精神分裂癥大鼠模型構(gòu)建成功［11］。造模過(guò)程中出現(xiàn)不符合條件或者死亡時(shí)（造模組出現(xiàn)2只）及時(shí)選取備用大鼠進(jìn)行精神分裂癥模型的復(fù)制。

將造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、H2S干預(yù)組、Nrf2抑制劑組、H2S+Nrf2抑制劑組，每組8只。H2S干預(yù)組腹腔注射10 mg/kg的GYY4137（H2S供體）［12］，Nrf2抑制劑組腹腔注射10 mg/kg的ATRA（Nrf2抑制劑）［13］，H2S+Nrf2抑制劑組腹腔注射10 mg/kg的GYY4137和10 mg/kg的ATRA，模型組和對(duì)照腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理7 d。

1.3.2 各組大鼠認(rèn)知功能測(cè)定 末次給藥結(jié)束后24 h進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組大鼠的認(rèn)知功能。將水迷宮均分為1、2、3、4四個(gè)象限，在第1象限中央低于水平面1 cm處放置半徑為5 cm的圓形透明平臺(tái)。第1、2、3、4天進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)：每天上午8：00將大鼠從第2、3、4象限的同一位置放入水中，記錄大鼠從入水至爬到圓形平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期；若大鼠在90 s內(nèi)未找到圓形平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠至圓形平臺(tái)上并停留10 s，此時(shí)潛伏期為90 s。第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：將圓形平臺(tái)撤去，記錄120 s內(nèi)大鼠游過(guò)圓形平臺(tái)的次數(shù)，即穿臺(tái)次數(shù)。

1.3.3 各組大鼠相關(guān)標(biāo)本采集 完成Morris水迷宮測(cè)試后取大鼠尾靜脈血0.4 mL，置于肝素化離心管中，3 000 r/min離心15 min后取上層血漿。將大鼠麻醉后處死，取回盲部腸管組織5 cm，其中2.5 cm用于組織病理學(xué)觀察及TUNEL測(cè)定，另2.5 cm用于腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)及Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白的測(cè)定，取大鼠海馬組織CA1區(qū)用于HE染色觀察神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 各組大鼠腸組織、海馬組織病理?yè)p傷及腸黏膜細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取各組大鼠腸管組織適量于4%多聚甲醛中固定72 h，用流水洗去多聚甲醛后于組織脫水機(jī)中脫水，將脫水后的腸組織用融化的石蠟進(jìn)行包埋，待其凝固后切成厚度約為4μm的切片。在漂片機(jī)中展開(kāi)后附著在載玻片上，按照HE染色試劑盒中的要求進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)膠封固后在顯微鏡下觀察、拍照并分析。海馬組織HE染色方法同腸組織HE染色。采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)各組大鼠腸組織中腸黏膜細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞呈棕色，凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3.5 各組大鼠血漿H2S、D-乳酸，腸組織腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)及應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè) 取各組大鼠血漿，用H2S含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠血漿中H2S含量，D-乳酸ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血漿中D-乳酸含量。取各組大鼠腸組織，在光鏡下記錄大鼠腸組織的小腸絨毛高度及隱窩深度。取適量腸組織，用生理鹽水制成組織勻漿，取上清液，用相應(yīng)ELISA試劑盒測(cè)定各組大鼠腸組織中SOD、MDA、TNF-α、IL-6水平。

1.3.6 Western blot檢測(cè)各組大鼠腸組織Nrf2/ARE/HO-1通路蛋白、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 取適量腸組織，剪碎后置于研缽中，加入適量RIPA裂解液研磨以提取總蛋白。提取充分后置于EP管中，靜置20 min后1 000 r/min、4℃離心10 min，吸取上清液為目的蛋白，用BCA法測(cè)定并計(jì)算其中蛋白質(zhì)濃度。取適量待測(cè)蛋白樣品，按照體積比為5∶1加入上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白變性，取20μL變性的蛋白溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白，電泳過(guò)程在冰上進(jìn)行。將分離的蛋白質(zhì)采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中封閉處理30 min，經(jīng)TBST緩沖液沖洗3次后加入兔抗鼠Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗，4℃冰箱過(guò)夜?；厥找豢?，TBST緩沖液沖洗3次，加入羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室溫下?lián)u床中搖晃1 h，棄二抗，TBST緩沖液沖洗3次，顯影、曝光后于凝膠成像儀中觀察并分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知功能比較 時(shí)間與分組因素對(duì)潛伏期的影響存在交互效應(yīng)（P＜0.05）；隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短；與對(duì)照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)減少（均P＜0.05）；與模型組相比，H2S干預(yù)組大鼠逃避潛伏期縮短，穿臺(tái)次數(shù)增多（均P＜0.05），Nrf2抑制劑組與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05），穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果 海馬HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則、著色均勻、排列整齊；模型組神經(jīng)元排列紊亂，大量神經(jīng)元核深染、固縮，部分細(xì)胞被小膠質(zhì)細(xì)胞代替；與模型組相比，H2S干預(yù)組神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)；與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元損傷加重，見(jiàn)圖1。

Tab.1 Comparison of cognitive function of rats between the five groups表1 各組大鼠認(rèn)知功能比較 （n=8，±s）

Tab.1 Comparison of cognitive function of rats between the five groups表1 各組大鼠認(rèn)知功能比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與H2S干預(yù)組比較，d與Nrf2抑制劑組比較，P＜0.05；表2~5同。

組別對(duì)照組模型組H2S干預(yù)組Nrf2抑制劑組H2S+Nrf2抑制劑組第2天59.28±6.05 81.75±7.05a 66.39±7.11ab 82.28±8.31ac 74.06±7.04abcd第3天43.19±3.99 75.57±7.77a 56.62±5.23ab 76.15±6.85ac 67.49±6.63abcd第4天29.10±2.06 60.84±6.71a 35.30±2.18ab 66.93±6.46ac 49.08±3.91abcd F（組間/時(shí)間/交互）逃避潛伏期（s）第1天64.60±7.44 88.58±7.28a 72.70±7.05ab 89.26±8.34ac 80.70±7.30abcd 170.676＊＊/120.340＊＊/2.103＊穿臺(tái)次數(shù)（次）6.68±1.39 2.20±0.42a 3.59±0.43ab 2.06±0.35ac 2.61±0.17acd 59.924＊＊

2.3 各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組相比，模型組腸黏膜細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，H2S干預(yù)組腸黏膜細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Nrf2抑制劑組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖2、3。

2.4 各組大鼠腸組織形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組回盲部腸組織形態(tài)學(xué)正常，光澤度較好，絨毛排列整齊，形態(tài)呈指狀，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腸組織損傷嚴(yán)重，可見(jiàn)絨毛生長(zhǎng)稀疏，略有水腫，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況；與模型組相比，H2S干預(yù)組大鼠腸組織損傷得到一定緩解，Nrf2抑制劑組無(wú)明顯差異；與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組大鼠腸組織損傷情況較重，見(jiàn)圖4。

Fig.1 HE staining observation of hippocampal tissue of rats in each group(×400)圖1 各組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果（×400）

2.5 各組大鼠血漿H2S、D-乳酸，腸組織腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)及應(yīng)激指標(biāo)變化 與對(duì)照組相比，模型組血漿D-乳酸及腸組織中MDA、TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.05），小腸絨毛高度、小腸隱窩深度、血漿H2S水平、腸組織中SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，H2S干預(yù)組血漿D-乳酸及腸組織中MDA、TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），小腸絨毛高度、小腸隱窩深度、血漿H2S水平、腸組織中SOD水平顯著升高（P＜0.05），Nrf2抑制劑組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組血漿D-乳酸及腸組織中MDA、TNF-α、IL-6水平顯著升高（P＜0.05），小腸絨毛高度、小腸隱窩深度、血漿H2S水平、腸組織中SOD水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表3、4。

2.6 各組大鼠腸組織Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，模型組腸組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，H2S干預(yù)組腸組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），Nrf2抑制劑組與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組大鼠腸組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表5、圖5。

Tab.2 Apoptosis of intestinal mucosa cells of rats in each group表2 各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡情況 （n=8，±s）

Tab.2 Apoptosis of intestinal mucosa cells of rats in each group表2 各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡情況 （n=8，±s）

組別對(duì)照組模型組H2S干預(yù)組Nrf2抑制劑組H2S+Nrf2抑制劑組F凋亡率（%）4.15±0.86 19.48±5.25a 6.60±1.80b 20.46±6.82ac 13.44±3.21acd 24.555＊＊凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Caspase-3/GAPDH 0.49±0.10 1.25±0.27a 0.60±0.14b 1.27±0.31ac 0.93±0.18acd 22.428＊＊Bax/GAPDH 0.41±0.08 1.22±0.26a 0.61±0.14b 1.26±0.30ac 0.92±0.17acd 26.133＊＊Bcl-2/GAPDH 1.01±0.10 0.58±0.05a 0.93±0.09b 0.54±0.03ac 0.67±0.03acd 80.054＊＊

Fig.2 TUNEL staining was used to detect the apoptosis of intestinal mucosal cells in each group(×200)圖2 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡情況（×200）

Fig.3 Expression of apoptosis related proteins in intestinal mucosa of rats in each group圖3 各組大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討論

精神分裂癥是由一組癥狀群組成的臨床綜合征，為多因素慢性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未明了，缺乏療效確切的治療藥物及方法［14-15］。隨著精神分裂癥的不斷進(jìn)展，部分患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能退化［16］、腸道菌群失調(diào)［17］等多種不良表現(xiàn)，臨床常通過(guò)藥物和心理治療等方法控制病情，但難以改善認(rèn)知功能退化問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，MK-801可引起認(rèn)知功能障礙，是其誘導(dǎo)精神分裂癥形成的基礎(chǔ)［10］。本研究通過(guò)腹腔注射0.2 mg/kg的MK-801構(gòu)建精神分裂癥大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠潛伏期延長(zhǎng)，穿臺(tái)次數(shù)減少，提示認(rèn)知功能受到損害，精神分裂癥大鼠模型構(gòu)建成功。

Fig.4 Observation of intestinal histomorphology of rats in each group(HE,×200)圖4 各組大鼠腸組織形態(tài)學(xué)觀察（HE，×200）

Tab.3 Comparison of the related indexes of intestinal barrier function and the plasma level of H 2S between the five groups of rats表3 各組大鼠腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)、血漿H 2S水平比較 （n=8，±s）

Tab.3 Comparison of the related indexes of intestinal barrier function and the plasma level of H 2S between the five groups of rats表3 各組大鼠腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)、血漿H 2S水平比較 （n=8，±s）

組別對(duì)照組模型組H2S干預(yù)組Nrf2抑制劑組H2S+Nrf2抑制劑組F血漿D-乳酸（mg/L）4.26±0.74 15.44±1.89a 7.30±1.51ab 16.25±1.80ac 11.06±1.72abcd 84.379＊＊小腸絨毛高度（μm）250.12±16.10 188.23±7.39a 218.06±11.02ab 172.37±7.48ac 193.43±9.21acd 63.965＊＊小腸隱窩深度（μm）92.60±8.26 49.01±4.44a 75.23±6.90ab 47.18±3.07ac 60.82±5.50abcd 83.156＊＊血漿H2S（μmol/L）43.08±4.15 20.18±2.07a 34.80±3.02ab 22.49±2.69ac 28.99±2.01abcd 83.032＊＊

Tab.4 Comparison of oxidative stress and inflammatory factors between the five groups of rats表4 各組大鼠氧化應(yīng)激、炎性因子水平比較 （n=8，±s）

Tab.4 Comparison of oxidative stress and inflammatory factors between the five groups of rats表4 各組大鼠氧化應(yīng)激、炎性因子水平比較 （n=8，±s）

組別對(duì)照組模型組H2S干預(yù)組Nrf2抑制劑組H2S+Nrf2抑制劑組F SOD（U/mg）85.03±4.75 61.25±2.78a 77.48±3.28ab 60.43±2.25ac 70.46±2.83abcd 82.387＊＊MDA（nmol/mg）2.46±0.51 8.53±1.11a 3.94±0.71ab 8.60±1.18ac 6.02±1.03abcd 67.188＊＊TNF-α（ng/L）16.28±3.29 132.46±17.56a 50.06±4.36ab 134.03±16.41ac 85.82±11.37abcd 143.769＊＊IL-6（ng/L）13.15±2.47 102.18±11.31a 48.26±4.83ab 105.73±11.24ac 75.44±6.89abcd 182.417＊＊

Tab.5 Comparison of Nrf2/ARE/HO-1 pathway related protein expression in intestinal tissues between the five groups of rats表5 各組大鼠腸組織中Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （n=8，±s）

Tab.5 Comparison of Nrf2/ARE/HO-1 pathway related protein expression in intestinal tissues between the five groups of rats表5 各組大鼠腸組織中Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 （n=8，±s）

組別對(duì)照組模型組H2S干預(yù)組Nrf2抑制劑組H2S+Nrf2抑制劑組F Nrf2/GAPDH 0.08±0.01 0.28±0.04a 1.25±0.21ab 0.16±0.03c 0.73±0.14abcd 144.163＊＊HO-1/GAPDH 0.15±0.03 0.37±0.06a 1.38±0.18ab 0.29±0.06c 0.85±0.15abcd 162.235＊＊

Fig.5 Expression levels of Nrf2/ARE/HO-1 pathway relatedproteins in intestinal tissues of rats in each group圖5 各組大鼠腸組織中Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

腸道屏障中的腸黏膜是與內(nèi)環(huán)境、外環(huán)境相互作用的主要媒介之一，可維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而腸道屏障的顯著改變會(huì)增加腸道的通透性，繼而大量炎性因子及外界病原體侵入人體，引起機(jī)體各種病變［18］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與胃腸道之間存在一定的聯(lián)系，生理、心理壓力等引起的大腦功能障礙性疾?。ㄈ缇穹至寻Y、自閉癥）會(huì)影響腸道功能，胃腸道微環(huán)境的改變也會(huì)引起行為及神經(jīng)功能的變化，TNF-α、IL-6等促炎因子的增加可通過(guò)改變神經(jīng)元神經(jīng)酰胺的合成而導(dǎo)致患者認(rèn)知功能損傷［19-20］。因此，探究具有保護(hù)腸道功能的治療方法對(duì)于改善精神分裂癥患者的認(rèn)知功能具有重要意義。H2S是一種重要的氣體信號(hào)分子，廣泛存在于各個(gè)組織器官中，參與機(jī)體的各種生理病理過(guò)程，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病中發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用［21-22］。盧根林等［22］研究發(fā)現(xiàn)H2S能顯著減少回腸上皮細(xì)胞凋亡，并改善腸缺血再灌注損傷大鼠腸上皮細(xì)胞功能。Berry等［23］研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者血漿中H2S含量低于健康人群，增加機(jī)體內(nèi)H2S含量可能具有抗精神疾病作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織、腸組織損傷嚴(yán)重，腸絨毛生長(zhǎng)稀疏，略有水腫，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等情況，腸黏膜細(xì)胞凋亡率、血漿D-乳酸以及腸組織中MDA、TNF-α、IL-6水平顯著高于對(duì)照組，小腸絨毛高度、小腸隱窩深度、血漿H2S水平、腸組織中SOD水平顯著低于對(duì)照組，提示精神分裂癥可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)海馬受損、腸道炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大鼠腸道屏障功能障礙。經(jīng)過(guò)外源性H2S干預(yù)的大鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)均得到抑制，大鼠海馬功能、認(rèn)知功能、腸道屏障功能均得到改善，提示給機(jī)體補(bǔ)充H2S，可顯著改善精神分裂癥引起的認(rèn)知功能、腸道屏障功能障礙。

Nrf2/ARE通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗氧化損傷通路，HO-1是Nrf2/ARE通路下游關(guān)鍵因子之一，激活的HO-1可將血紅蛋白分解代謝成膽紅素、膽綠素、鐵離子等，進(jìn)而減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，發(fā)揮抗氧化作用［24-25］。Nrf2/ARE/HO-1通路在阿爾茨海默病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，激活Nrf2/ARE/HO-1通路可顯著改善東莨菪堿引起的小鼠記憶缺陷［26-27］。Liu等［28］研究發(fā)現(xiàn)激活Nrf2/ARE/HO-1通路可提高小鼠機(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而減輕小鼠腸缺血再灌注損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組腸組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示Nrf2/ARE/HO-1通路與MK-801誘導(dǎo)的精神分裂癥大鼠認(rèn)知功能及腸道屏障功能障礙有關(guān)；與模型組相比，H2S干預(yù)組腸組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著增加，推測(cè)H2S可能通過(guò)激活Nrf2/ARE/HO-1通路改善精神分裂癥大鼠的認(rèn)知功能和腸道屏障功能，為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究利用Nrf2/ARE/HO-1通路抑制劑ATRA進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H2S干預(yù)組相比，H2S+Nrf2抑制劑組大鼠腸組織中Nrf2/ARE/HO-1通路相關(guān)蛋白表達(dá)顯著降低，大鼠認(rèn)知功能及腸道屏障功能障礙嚴(yán)重，證明了H2S對(duì)認(rèn)知功能和腸道屏障功能的保護(hù)作用是通過(guò)促進(jìn)Nrf2/ARE/HO-1通路的激活實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，外源性H2S可能通過(guò)激活Nrf2/ARE/HO-1通路顯著改善精神分裂癥大鼠的認(rèn)知功能和腸道屏障功能，但H2S作用機(jī)制復(fù)雜，也可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮作用，仍需深入研究。