黃芪根瘤象取食脅迫對(duì)黃芪3種防御酶活性的影響

張大為 惠娜娜 袁偉寧 余海濤 魏玉紅

摘要：為明確黃芪根瘤象取食脅迫對(duì)黃芪葉片主要防御酶活性的影響及對(duì)黃芪藥效物質(zhì)的可能影響，以黃芪根瘤象及其寄主膜莢黃芪為試驗(yàn)材料，測(cè)定了不同取食誘導(dǎo)時(shí)間的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性變化。結(jié)果表明，取食24、48、72 h后，葉片PAL和POD的活性均顯著增加;取食24 h后PPO活性達(dá)到峰值，然后有所下降。表明黃芪根瘤象的取食脅迫激活了黃芪的化學(xué)防御，對(duì)黃芪的誘導(dǎo)抗性及次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，現(xiàn)有的黃芪根瘤象防治策略有待于更加科學(xué)的評(píng)估。

關(guān)鍵詞：黃芪;黃芪根瘤象;取食脅迫;防御酶

中圖分類號(hào)：S567? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2022）01-0059-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.01.014

Effects of Sitona Simillimus Korotyaev Feeding Stress on the Activities of Three Defense Enzymes of Astragalus Membranaceus

ZHANG Dawei， HUI Nana， YUAN Weining， YU Haitao， WEI Yuhong

（Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to clarify the effects of Sitonasimillimus feeding stress on the activities of main defense enzymes in leaves and the possible effects on the active substances of Astragalus membranaceus， the activities of phenylalanine ammonia-lyase （PAL）， peroxidase（POD）， and polyphenol oxidase（PPO） were measured at different feeding induction timesin the laboratory， by using Sitonasimillimus and its host Astragalus membranaceus as experimental materials. Theresults showed that the activities of PAL and POD in leaves increased significantly after 24， 48， and 72 hours， and the activity of PPO increased to the peak after 24 hours of feeding and then decreased. This study shows that the feeding stress of Sitonasimillimus activates the chemical defense of Astragalus membranaceus and triggers a certain effect on the induced resistance and secondary metabolites of Astragalus membranaceus. The existing prevention and control strategies of Sitonasimillimus need to be evaluated more scientifically.

Key words：Astragalus membranaceus;Sitonasimillimus;Feeding stress;Defense enzymes

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科多年生草本植物，以根入藥，是藥用價(jià)值很高的中藥材[1 ]。黃芪是甘肅省大宗中藥材品種之一，主要在甘肅省高寒陰濕區(qū)大面積種植，所產(chǎn)黃芪產(chǎn)量高、品質(zhì)好，因而經(jīng)濟(jì)效益顯著[2 - 3 ]。黃芪根瘤象（Sitona simillimus Korotyaev）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的主要為害黃芪的專食性害蟲(chóng)[4 - 6 ]，在甘肅省隴西縣、臨洮縣、岷縣等黃芪道地產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。黃芪根瘤象以成蟲(chóng)取食地上葉片，大幅削弱地上部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及光合作用能力;幼蟲(chóng)在地下取食根系，造成的傷口還會(huì)導(dǎo)致病原菌及線蟲(chóng)的侵染[7 - 8 ]，嚴(yán)重影響黃芪的產(chǎn)量及商品價(jià)值。由于生產(chǎn)中缺乏有效的防治手段，藥農(nóng)往往采用高毒農(nóng)藥拌毒土的方式進(jìn)行該蟲(chóng)的治理，其中不乏國(guó)家命令禁止使用的農(nóng)藥。

植物由于自身不能移動(dòng)，在與植食性昆蟲(chóng)漫長(zhǎng)的協(xié)同進(jìn)化進(jìn)程中形成了一系列的防御措施，以保證植物自身的正常生長(zhǎng)發(fā)育[9 ]，最直接的體現(xiàn)方式是產(chǎn)生有毒的次生代謝產(chǎn)物，以抵御昆蟲(chóng)的進(jìn)一步侵害。次生代謝不直接參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，但在抵御不良環(huán)境特別是植食性昆蟲(chóng)的取食脅迫中發(fā)揮重要的作用[10 ]。因此，植物體內(nèi)強(qiáng)大的防御酶系是植物應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)取食的防御開(kāi)關(guān)，它們調(diào)控次生代謝物質(zhì)的迅速合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)有毒物質(zhì)或消化酶抑制劑等方式抵御植食性昆蟲(chóng)的進(jìn)一步取食。其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過(guò)氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）是植物響應(yīng)昆蟲(chóng)取食脅迫的3種關(guān)鍵酶，也是被研究較為廣泛的3種酶，但相關(guān)研究多集中在經(jīng)濟(jì)植物應(yīng)對(duì)刺吸式口器害的取食脅迫方面[11 - 14 ]，對(duì)藥用植物對(duì)害蟲(chóng)取食脅迫響應(yīng)等的研究較少。

與其他經(jīng)濟(jì)作物不同，藥用植物的次生代謝物質(zhì)往往是其發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)。黃芪根瘤象是為害黃芪的重要害蟲(chóng)，其取食脅迫對(duì)黃芪次生代謝的影響及機(jī)制尚不清晰。我們通過(guò)研究黃芪根瘤象成蟲(chóng)取食誘導(dǎo)后黃芪葉片內(nèi)PAL、POD和PPO活性的動(dòng)態(tài)變化，以探明黃芪應(yīng)對(duì)黃芪根瘤象取食脅迫的防御反應(yīng)，分析取食誘導(dǎo)對(duì)黃芪次生代謝物質(zhì)的影響的可能效應(yīng)，為黃芪根瘤象的綜合治理提供更為科學(xué)的理論依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試黃芪種苗為膜莢黃芪種苗，購(gòu)自定西市渭源縣會(huì)川鎮(zhèn)，移栽至甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所日光溫室內(nèi)，所有種苗均罩尼龍紗網(wǎng)以防昆蟲(chóng)取食，管理措施一致，定苗后21 d，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用于試驗(yàn)。

黃芪根瘤象采自定西市隴西縣首陽(yáng)鎮(zhèn)黃芪地，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入人工氣候箱，用新鮮黃芪葉片飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃，濕度50%±10%，光周期12∶12（L∶D），用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2? ?試驗(yàn)方法

將黃芪苗用直徑10 cm的玻璃筒罩住，每株接入3頭黃芪根瘤象成蟲(chóng)，分別在取食0、24、48、72 h后收獲植物材料，測(cè)定黃芪葉片內(nèi)防御酶PAL、POD和PPO的活力變化，每處理均重復(fù)3次。

采用試劑盒法測(cè)定黃芪葉片的PAL、POD和PPO酶活，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。PAL活力以1 g鮮樣在反應(yīng)體系中1 min使290 nm 吸光度變化0.1 OD290值為1個(gè)酶活力單位;在37 ℃條件下，1 mg鮮樣中蛋白1 min催化1 μg 底物的酶量為1個(gè)POD酶活力單位;PPO活力以1 g鮮樣組織在1 mL反應(yīng)體系中1 min使在420 nm處吸光度值變化0.01為1個(gè)酶活力單位。

1.3? ?數(shù)據(jù)分析

防御酶活力數(shù)據(jù)分析利用SPSS 21 軟件和Excel 2019軟件進(jìn)行。采用單因素ANOVA進(jìn)行方差分析，LSD多重比較法比較不同處理間的差異顯著性。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?黃芪根瘤象取食對(duì)黃芪葉片PAL活性的影響

通過(guò)對(duì)葉片PAL活性的測(cè)定結(jié)果（圖1）可以看出，隨著取食時(shí)間的增加PAL活性呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。由于黃芪根瘤象的取食誘導(dǎo)，黃芪葉片中PAL的活性迅速增加，取食48 h后達(dá)到峰值52.62 U/g，取食24 h（50.74 U/g）和48 h的葉片內(nèi)PAL活力值顯著高于未取食前的29.99 U/g（P < 0.05）。取食72 h時(shí)PAL活性（40.95 U/g）仍高于取食前，但差異不顯著（P < 0.05）。

2.2? ?黃芪根瘤象取食對(duì)黃芪葉片POD活性的影響

對(duì)葉片POD活性的測(cè)定結(jié)果（圖2）顯示，黃芪根瘤象取食誘導(dǎo)對(duì)黃芪葉片的POD活性具有顯著的影響。未取食前葉片POD活力為8.78 U/（g·min），取食24 h后為41.07 U/（g·min），48 h后為44.38 U/（g·min），72 h后為41.72 U/（g·min），均比未取食時(shí)增加了5倍以上。取食24、48、72 h后，葉片的POD活性均顯著高于未接蟲(chóng)取食前，取食脅迫對(duì)葉片POD的活性的影響顯著 （P < 0.05）。

2.3? ?黃芪根瘤象取食對(duì)黃芪葉片PPO活性的影響

由圖3可以看出，黃芪應(yīng)對(duì)黃芪根瘤象的取食脅迫，迅速提升體內(nèi)PPO的活性，24 h達(dá)到峰值30.22 U/（g·min），其后PPO活性有所回落，取食48 h[16.44U/（g·min）]和取食72 h[19.11U/（g·min）]時(shí)的葉片PPO活性雖高于未接蟲(chóng)取食處理，但三者之間差異不顯著（P < 0.05）。

3? ?結(jié)論與討論

次生代謝是植物抵御病蟲(chóng)害等外界不良條件的重要生命活動(dòng)[15 ]，控制次生代謝活動(dòng)的酶是植物應(yīng)對(duì)昆蟲(chóng)取食脅迫的關(guān)鍵單元，也是藥用植物活性物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究顯示，黃芪根瘤象取食脅迫誘導(dǎo)了黃芪的化學(xué)防御，黃芪體內(nèi)PAL、POD和PPO 3種重要的防御酶活性均相應(yīng)的發(fā)生了變化。

PAL是植物初生代謝和次生代謝轉(zhuǎn)化的樞? ? 紐[16 ]，是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在調(diào)控植物體內(nèi)黃酮類、類黃酮及木質(zhì)素合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17 ]，而黃酮類物質(zhì)也是黃芪的藥效物質(zhì)主要成分。此外，木質(zhì)素的合成對(duì)于黃芪根系的生長(zhǎng)及增加細(xì)胞壁厚度提升抗性也有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪根瘤象取食脅迫24 、48 、72 h后的葉片PAL活性較未取食時(shí)葉片顯著提升，表明適當(dāng)?shù)娜∈趁{迫可能更利于黃芪藥效物質(zhì)的積累及品質(zhì)形成。

POD是植物體內(nèi)與活性氧代謝有關(guān)的酶，是維持植物體內(nèi)自由基在正常水平的重要保護(hù)酶，還可參與木質(zhì)素的合成，提升作物的抗性[18 ]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，植物在應(yīng)對(duì)病原菌及刺吸式害蟲(chóng)取食脅迫后，會(huì)顯著提升體內(nèi)POD的活性以增加對(duì)害蟲(chóng)的抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，被咀嚼式口器害蟲(chóng)黃芪根瘤象取食脅迫后，黃芪葉片POD活性也大幅提升，表明黃芪在受到外來(lái)侵害時(shí)做出及時(shí)而積極的響應(yīng)，且這種響應(yīng)是持續(xù)的。

PPO廣泛存在于植物體內(nèi)，是可將酚類物質(zhì)氧化成毒性更強(qiáng)的醌類或其衍生物的抗?fàn)I養(yǎng)酶? ? 類[19 ]，常見(jiàn)于植物應(yīng)對(duì)廣食性害蟲(chóng)采取的質(zhì)量防御策略[20 ]。本研究中，被黃芪根瘤象取食脅迫后，黃芪葉片內(nèi)PPO活性急速增加，24 h即達(dá)峰值，表明黃芪對(duì)昆蟲(chóng)取食脅迫的快速響應(yīng)。同時(shí)，PPO的增加意味著體內(nèi)酚類物質(zhì)合成增多，而黃芪的藥效物質(zhì)毛蕊異黃酮和黃芪皂苷均屬于酚類物質(zhì)，因此，黃芪根瘤象的取食脅迫也能相應(yīng)的增加黃芪體內(nèi)藥效物質(zhì)的含量。

前期田間調(diào)查顯示，黃芪根瘤象為害的地塊其他害蟲(chóng)發(fā)生量較少，可能與黃芪根瘤象取食誘導(dǎo)的植物抗性相關(guān)。而作為專食性害蟲(chóng)，黃芪根瘤象在與寄主黃芪的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中也形成了相應(yīng)的對(duì)策適應(yīng)植物的化學(xué)防御。本研究表明，黃芪根瘤象的取食脅迫全面激活了黃芪的化學(xué)防御，而且適度的取食脅迫有可能促進(jìn)黃芪藥效物質(zhì)的積累。本研究?jī)H設(shè)置了3頭/株的接蟲(chóng)密度，其他取食壓力對(duì)黃芪防御酶活的影響有待進(jìn)一步研究。黃芪根瘤象取食脅迫對(duì)黃芪次生代謝物質(zhì)含量的影響，有待于結(jié)合多組學(xué)技術(shù)進(jìn)行定性定量分析，以期全面評(píng)估黃芪根瘤象與黃芪的互作關(guān)系，為黃芪根瘤象的科學(xué)治理提供可靠的理論依據(jù)。針對(duì)黃芪根瘤象應(yīng)改變現(xiàn)有的害蟲(chóng)治理策略，因地因時(shí)制定科學(xué)的害蟲(chóng)管理對(duì)策，本研究也可為藥用植物的害蟲(chóng)治理策略提供新的視角及思考。

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