玉米LEC1基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析

劉暢暢 黃敏

摘要：LEC基因家族包含LEC1和LEC2，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累。LEC1（Leafy Cotyledon 1）是NF-YB9蛋白家族的成員，編碼了CCAAT-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HAP3（Heme activated protein 3）亞單位。利用生物信息學(xué)方法，獲得了16個(gè)玉米LEC1基因。分析發(fā)現(xiàn)，ZmLEC1蛋白大部分都是酸性的不穩(wěn)定親水蛋白，含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域CBFD_NFYB_HMF及10個(gè)保守基序。通過(guò)與擬南芥LEC1基因和水稻LEC1基因的聚類分析，將玉米LEC1基因家族分為4類：ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ。經(jīng)RNA-seq等分析發(fā)現(xiàn)，玉米LEC1家族基因具有組織特異性，響應(yīng)非生物脅迫。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，玉米LEC1基因啟動(dòng)子上含有響應(yīng)激素和非生物脅迫的順式作用元件。

關(guān)鍵詞：玉米;LEC1基因家族;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S513? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2022）01-0031-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.01.007

Identification and Bioinformatics Analysis of LEC1 Gene Family in Maize

LIU Changchang 1， HUANG Min 1， 2

（College of Life Science， Yangtze University， Jingzhou Hubei 434025， China）

Abstract：The LECfamily genes， consisting of LEC1 and LEC2， are involved in the development and accumulation of storage materials in plants. LEC1（Leafy Cotyledon 1） is a member of the NF-YB9 protein family， encoding the CCAAT-box binding transcription factor HAP3 （Heme activated protein 3） subunit. In this study， we identified 16 LEC1? genes by using bioinformatics. Most of the ZmLEC1 proteins are acidic unstable hydrophilic proteins， containing a conserved domain CBFD_NFYB_HMF and 10 conserved motifs. By aligning the sequence of LEC1 genein Arabidopsis and rice， respectively， these genes were divided into four categories as ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ. According to the analysis of RNA-seq， ZmLEC1 preferentially expressed in specific tissues， responding to the abiotic stress. Promoter region analysis revealed that the promoter of ZmLEC1 contained cis-acting elements in response to hormonal and abiotic stresses.

Key words：Maize（Zea mays L.）;LEC1 gene family;Bioinformatics

植物的胚胎發(fā)育一直是人們的研究熱點(diǎn)，隨著科技水平的迅猛發(fā)展，有大量胚胎發(fā)育相關(guān)基因被克隆出來(lái)。LEC1基因最早是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，其在早期發(fā)育階段發(fā)揮作用，以維持胚胎細(xì)胞的命運(yùn)[1 ]。LEC1的異位胚后表達(dá)能夠誘導(dǎo)擬南芥葉片組織中胚狀結(jié)構(gòu)的形成、幼苗發(fā)育畸形、子葉生長(zhǎng)異常，根系生長(zhǎng)也受到了抑制[2 ]。繼擬南芥LEC1基因被克隆后，玉米、胡蘿卜、花生、棉花等作物的LEC1基因也相繼被克隆出來(lái)并進(jìn)行了初步的探索與研究[3 - 6 ]。研究發(fā)現(xiàn)，基因LEC1還參與植物脂肪酸生物合成的縮合、伸長(zhǎng)和去飽和反應(yīng)。LEC1基因的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致擬南芥脂肪酸生物合成基因的整體表達(dá)增加[7 ]，其在玉米中過(guò)量表達(dá)時(shí)提高了種子的油脂含量[8 ]。基因LEC1在油菜中的過(guò)量表達(dá)可以是其種子油脂含量增加7%～16%[9 ]。

2020年中國(guó)玉米產(chǎn)量高達(dá)2.61億t，作為我國(guó)的高產(chǎn)糧食作物，玉米是畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等重要的飼料來(lái)源，也是許多工業(yè)用品不可缺少的原料之一，在全國(guó)31個(gè)省、市、自治區(qū)均有種植[10 ]。胚胎的發(fā)育影響了種子萌發(fā)速率和整齊度，同時(shí)也會(huì)影響后期的抗蟲害能力及產(chǎn)量[11 ]。目前，關(guān)于玉米LEC1基因組鑒定及生物信息學(xué)分析尚未見(jiàn)報(bào)道，本文利用生物信息學(xué)手段對(duì)玉米LEC1基因家族理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、啟動(dòng)子元件，基因的差異性表達(dá)等進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步探究玉米LEC1基因功能與調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?數(shù)據(jù)來(lái)源

通過(guò)MaizeGDB（https： //maizegdb.org/gene_center/gene）和NCBI獲取玉米LEC1基因家族數(shù)據(jù)，在Ensembl Plants（http：//plants.ensembl.org/index.html）上下載玉米蛋白質(zhì)的全部序列，在TAIR（https：//www.arabidopsis.org）網(wǎng)站上獲取擬南芥LEC1基因的蛋白序列。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 玉米LEC1基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過(guò)TBtools工具將獲得的玉米LEC1基因家族數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將所得玉米LEC1基因家族蛋白序列提交在線網(wǎng)站ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）上，分析各玉米LEC1蛋白的氨基酸數(shù)量，分子量，等電點(diǎn)，蛋白疏水性，不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)。

1.2.2? ? 玉米LEC1基因家族的染色體定位? ? 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取玉米LEC1基因家族各成員的在染色體上的位置信息及玉米各染色體長(zhǎng)度信息，將上述信息整理并上傳至MapGene2Chrom（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/），在線網(wǎng)站繪制出玉米LEC1基因染色體定位圖。

1.2.3? ? 玉米LEC1基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析? ? 通過(guò)TBtools工具提取玉米LEC1基因家族各成員的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)信息，并上傳至GSDS2.0（http：//gsds.cbi.p-ku.edu.cn/）。通過(guò)MEME（http：//alternate.meme-suite.org/tools/meme）在線網(wǎng)站分析玉米LEC1-1～16蛋白保守基序。利用NCBI中Batch CD-Search工具分析ZmLEC1-1～16蛋白結(jié)構(gòu)域，并通過(guò)TBtools處理得到可視化圖形。

1.2.4? ? 玉米LEC1基因啟動(dòng)子順式元件分析? ? 玉米LEC1-1～16基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列，通過(guò)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webt ools/plantcare/html/）分析順式作用元件，并利用Tbtools對(duì)順式作用元件的在基因上的位置進(jìn)行可視化處理。

1.2.5? ? 玉米LEC1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析? ? 從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)下載水稻的全部蛋白質(zhì)信息，利用從PFAM網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）得到的蛋白保守結(jié)構(gòu)域CBFD_NFYB_HM的Pfam號(hào)（PF 00808）進(jìn)行信息搜索。將得到全部9個(gè)水稻LEC1、14個(gè)擬南芥LEC1的蛋白序列和玉米的16個(gè)LEC1蛋白序列導(dǎo)入到Tbtools中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。

1.2.6? ? 玉米LEC1基因表達(dá)模式分析? ? 從MaizeGDB網(wǎng)站下載玉米根、葉、種子、胚乳的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)及玉米在冷、熱、鹽、紫外脅迫和正常生長(zhǎng)下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將玉米LEC1-1～16的數(shù)據(jù)篩選出來(lái)并上傳至TBtools進(jìn)行熱圖繪制。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?玉米LEC1基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

通過(guò)從TAIR上得到的擬南芥LEC1蛋白的氨基酸序列，在NCBI和MAIZEGDB上進(jìn)行BLAST搜索，最終篩選得到16個(gè)玉米LEC1基因。根據(jù)它們?cè)谌旧w上的排列順序，將其命名為ZmLEC1-1～16。玉米LEC1家族蛋白的氨基酸數(shù)量為91～278 aa，分子量為10 394.60～29 097.21 Kda。蛋白的等電點(diǎn)除ZmLEC1-9（7.10）和ZmLEC1-11（8.81）外，其余均在7.00以下，說(shuō)明玉米LEC1蛋白大多是呈酸性的。且蛋白疏水性均小于0，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，說(shuō)明玉米LEC1蛋白是不穩(wěn)定的親水蛋白（表1）。

2.2? ?玉米LEC1基因家族染色體定位

為了進(jìn)一步了解ZmLEC1基因家族在染色體上的具體分布，通過(guò)MG2C在線網(wǎng)站對(duì)ZmLEC1-1～16的注釋信息進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，除了第10條染色體無(wú)基因分布外，其余染色體上均有分布，其中第2條染色體上有3個(gè)基因，第3條染色體上有5個(gè)基因，第8條染色體上有2個(gè)基因，其余每條染色體上均有1個(gè)基因（圖1）。

2.3? ?玉米LEC1基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域

通過(guò)GSDS2.0在線網(wǎng)站分析得到玉米LEC1基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)為1～3個(gè)，其中ZmLEC1-8、ZMLEC1-14沒(méi)有5′UTR和3′UTR，ZmLEC1-2，ZMLEC1-5沒(méi)有3′UTR（圖2）。利用MEME在線工具對(duì)LEC1基因家族的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，得到10個(gè)保守的motif（圖3），命名為motif1-motif10，但每個(gè)ZmLEC1-1～16蛋白的motif排列順序并不完全相同，其中ZmLEC1-3包含7個(gè)motif，ZmLEC1-1、ZmLEC1-4、ZmLEC1-6、ZmLEC1-7、ZmLEC1-12、ZmLEC1-15、ZmLEC1-16包含4個(gè)motif，ZmLEC1-5、ZmLEC1-8、ZmLEC1-9、ZmLEC1-11、ZmLEC1-13、ZmLEC1-14包含3個(gè)motif，ZmLEC1-2包含2個(gè)motif（圖4）。通過(guò)TBtools對(duì)LEC蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因ZmLEC1-1～16蛋白擁有保守的蛋白結(jié)構(gòu)域CBFD_NFYB_HMF（圖5）。

2.4? ?玉米LEC1家族基因啟動(dòng)子特異順式作用元件

選取玉米ZmLEC1-1～16碼子上游2 000 bp的序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件的分析。Plant CARE在線分析結(jié)果表明（圖6），玉米ZmLEC1-1～16區(qū)域含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif，CGTCA-motif）、生長(zhǎng)素反應(yīng)元件（TGA-element，Aux RR-core）、水楊酸反應(yīng)元件（TCA-element）、赤霉素反應(yīng)元件（GARE-motif，TATC-box，P-box）、脫落酸反應(yīng)元件（ABRE，SARE）、光響應(yīng)元件（G- box，Sp1，GATA-motif，Box 4，AE-box，I-box）、干旱響應(yīng)元件（MBS）、低溫調(diào)控元件（LTR）、防御及應(yīng)激響應(yīng)元件（TC-rich repeats）、種子特異性調(diào)控元件（RY-element）。

2.5? ?玉米LEC1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

在Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到9個(gè)水稻LEC1和14個(gè)擬南芥LEC1的蛋白序列，將獲得的擬南芥、水稻和玉米的蛋白序列導(dǎo)入到TBtools中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。結(jié)果顯示（圖7），39個(gè)LEC1基因可分為4個(gè)亞家族（ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ），其中ClassⅠ中包含了4個(gè)玉米基因（ZmLEC1-6，ZmLEC1-7，ZmLEC1-8，ZmLEC1-11）、2個(gè)水稻基因（Os01t0935200，Os08t017450），6個(gè)擬南芥基因（AT1G19890，AT5G10980，AT5G 43250，AT1G09030，AT2G47810，AT2G13570）;ClassⅡ包含了4個(gè)玉米基因（ZmLEC1-3，ZmLEC 1-10，ZmLEC1-13，ZmLEC1-16）、2個(gè)水稻基因（Os02t0725700，Os06t0285200）、2個(gè)擬南芥基因（AT1G21970，AT5G47670）;ClassⅢ中包含了2個(gè)玉米基因（ZmLEC1-1，ZmLEC1-4）、2個(gè)水稻基因（Os03t0413000，Os07t0606600）、3個(gè)擬南芥基因（AT4G14540，AT5G47640，AT1G07980）;ClassⅣ包含了6個(gè)玉米基因（ZmLEC1-2，ZmLEC1-5，ZmLEC1-9，ZmLEC1-12，ZmLEC1-14，ZmLEC1- 15）、3個(gè)水稻基因（Os05t0573500，Os01t 0834400，Os05t0463800）、3個(gè)擬南芥基因（AT2G37060，AT3G53340，AT2G38880）。

2.6? ?玉米LEC1基因表達(dá)模式分析

為研究玉米LEC1基因在不同組織和不同脅迫下的特異性表達(dá)情況，對(duì)玉米轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖8），基因ZmLEC1-12在根中的表達(dá)量均高于其他組織，ZmLEC1-15在葉中表達(dá)量最高，ZmLEC1-7在種子和胚乳中表達(dá)量最高。環(huán)境對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著很大的影響，其中鹽害，高溫，低溫等都可能會(huì)導(dǎo)致玉米生長(zhǎng)發(fā)育受到損傷。由分析結(jié)果可看出，玉米ZmLEC1-1、ZmLEC1-7、ZmLEC1-12、ZmLEC1-15這4個(gè)基因比較容易受到脅迫影響，其中ZmLEC1-12在鹽害脅迫下轉(zhuǎn)錄水平增高了9倍。

3? ?結(jié)論與討論

通過(guò)生物信息學(xué)分析共得到玉米ZmLEC1-1～16，其不均勻分布在9條染色體上。玉米LEC家族具有保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，除ZmLEC1～9以外，ZmLEC1蛋白均為酸性的不穩(wěn)定親水蛋白，含有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域CBFD_NFYB_HMF及10個(gè)保守基序。通過(guò)與擬南芥LEC1基因和水稻LEC1基因的聚類分析，將玉米LEC1基因家族分為4類：ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ。RNA-seq等分析發(fā)現(xiàn)，玉米LEC1家族基因具有組織特異性，響應(yīng)非生物脅迫。啟動(dòng)分析發(fā)現(xiàn)，玉米LEC1基因啟動(dòng)因子上含有響應(yīng)激素和非生物脅迫的順式作用元件。玉米LEC1基因在種子、葉片、根、胚乳中均有不同的表達(dá)水平，且基因ZmLEC1～12在鹽害脅迫下表達(dá)量有明顯的提高。本研究為玉米基因LEC1的功能研究提供依據(jù)，也為ZmLEC1基因的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

LEC1基因參與調(diào)控非生物脅迫。劉豪等[12 ]通過(guò)熒光定量PCR對(duì)小麥LEC1基因在ABA、干旱、高溫脅迫處理后的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ABA處理后的小麥TaLEC1基因表達(dá)量上升，干旱和高溫脅迫下小麥TaLEC1基因在脅迫初期急劇上調(diào)表達(dá)，原因很有可能是在小麥?zhǔn)艿礁邷睾透珊涤绊憰r(shí)，ABA發(fā)揮作用使小麥脫水率降低。同樣通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)花生LEC1基因?qū)Ω珊?、鹽害、低溫脅迫有明顯的響應(yīng)[13 ]。通過(guò)生物信息學(xué)分析啟動(dòng)子作用元件發(fā)現(xiàn)，LEC1基因還可能參與茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素、水楊酸、赤霉素等依賴的脅迫響應(yīng)。人們通過(guò)不同耕作方式和研究響應(yīng)機(jī)理來(lái)豐富玉米品種資源[14 ]。

生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育有很大的影響，鹽害是影響我國(guó)玉米產(chǎn)量的主要因素之一。鹽害是指土壤含鹽過(guò)多，土壤溶液滲透壓過(guò)高引起植物生長(zhǎng)發(fā)育不良的現(xiàn)象。玉米對(duì)鹽的承受量最高在0.0017 mol/L左右，土壤鹽害高度影響玉米的生長(zhǎng)、發(fā)育及產(chǎn)量[15 ]。玉米遭受到鹽害影響時(shí)會(huì)使胞內(nèi)滲透壓失衡，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)壁分離[16 ]、離子失衡、植株失水[17 ]、細(xì)胞器的功能喪失[18 ]，導(dǎo)致玉米植株死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，基因ZmLEC1-7在受到鹽害脅迫時(shí)高度表達(dá)，表明ZmLEC1-7基因可能在鹽害脅迫方面起著重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] LOTAN T，OHTO M A，YEE K M，et al.? Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells[J].? Cell，1998，93（7）：1195-1205.

[2] WEST，MAL.? LEAFY COTYLEDON1 is an essential regulator of late embryogenesis and cotyledon Identity in Arabidopsis[J].? The Plant Cell，1994，6（12）：1731-1745.

[3] ZHANG S，WONG L，LING M，et al.? Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize（Zea mays L.）[J].? Planta，2002，215（2）：191-194.

[4] YAZAWA K， TAKAHATA K， KAMADA H.? Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledon1 and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis[J].? Plant Physiology and Biochemistry，2004，42（3）：215-223.

[5] 李愛(ài)芹，夏? ?晗，王興軍，等.? 花生LEC1基因的克隆及表達(dá)研究[J].? 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（9）：1730-1735.

[6] 樊可心，曹愛(ài)萍，張文婷，等.? 棉花G. LEC1A基因的克隆和鑒定[J].? 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，33（5）：535-540.

[7] MU J，TAN H，ZHENG Q，et al.? LEAFY COTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis[J].? Plant physiology，2008，148（2）：1042-1054.

[8] BO SHEN，WILLIAM B ALLEN，PEIZHONG ZHENG，et al.? Expression of ZmLEC1 and ZmWRI1 Increases Seed Oil Production in Maize[J].? Plant Physiology， 2010，153（3）：980-987.

[9] ELAHI N，DUNCAN R W，STASOLLA C.? Modification of oil and glucosinolate content in canola seeds with altered expression of Brassica napus LEAFY COTYLEDON1[J].? Plant Physiology and Biochemistry，2016，

100：52-63.

[10] 南彩霞，張南冰，鄧喆元.? 玉米新品種強(qiáng)碩168選育報(bào)告[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（4）：1-4.

[11] 連彩云，馬忠明.? 玉米種子活力研究綜述[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（5）：64-68.

[12] 劉? ?豪，王艷麗，孟曉丹，等.? 小麥TaLEC1基因的克隆及其表達(dá)特性分析[J].? 西北植物學(xué)報(bào)，2019，

39（5）：904-910.

[13] 席旭東，常? ?宏，車? ?卓，等.? 6個(gè)玉米新品種在定西旱作農(nóng)業(yè)區(qū)的引種初報(bào)[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（7）：61-65.

[14] 潘麗娟，王? ?冕，蘇茂文，等.? 花生轉(zhuǎn)錄因子LEC1的表達(dá)特性分析[J].? 花生學(xué)報(bào)，2021，50（2）：15-20.

[15] 李? ?明，冷冰瑩，張晗菡，等.? 鹽脅迫下調(diào)控玉米胞內(nèi)Na+/K+比穩(wěn)定的主要機(jī)制與措施[J].? 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，53（6）：133-138.

[16] RANA，MUNNS，MARK，et al.? Mechanisms of salinity tolerance[J].? Annual Review of Plant Biology，2008，

59：651-681.

[17] ZHAO Y，LIU M，HE L，et al.? A cytosolic NAD+-dependent GPDH from maize （ZmGPDH1） is involved in conferring salt and osmotic stress tolerance[J].? BMC Plant Biology，2019，19（1）：16. https：//doi.org/10.118 6/s12870-018-1597-6.

[18] 武? ?燕，解丹丹，馬小亭，等.? 外源Ca2+對(duì)鹽脅迫下玉米幼苗生理指標(biāo)的影響[J].? 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，

42（12）：3471-2472.