縮泉丸藥效部位GC-MS分析*

謝 娟，何席呈,2，吳珊珊,2，李 瑋,2

(1 貴州中醫(yī)藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2 貴州中醫(yī)藥大學中藥新型飲片研究中心，貴州 貴陽 550025)

“縮泉丸”出自《婦人良方》，由鹽益智仁、烏藥、山藥組成，其中鹽益智仁溫補脾腎、澀精縮尿；烏藥溫膀胱助氣化止小便頻數(shù)；山藥健脾補腎；中醫(yī)藥理論認為腎氣健，則寒邪去，膀胱功能才能復常；因此其能補腎縮尿。臨床應用廣泛，目前SFDA已經(jīng)批準9個藥企生產(chǎn)不同規(guī)格的縮泉丸主治膀胱虛寒證，癥見尿量增多，小便頻數(shù)或遺尿[1-6]。但縮泉丸用藥劑量較大，給患者服用帶來了不便。課題組前期通過在體和離體實驗研究表明縮泉丸“縮尿”藥效物質(zhì)基礎為石油醚提取物，能夠有效的提高給藥濃度，減少藥物的服用[5-6]。本文為了保證藥效部位質(zhì)量穩(wěn)定性，利用GC-MS建立縮泉丸藥效部位指紋圖譜，并進行了益智仁和山藥的峰的歸屬，從而保障縮泉丸石油醚提取物質(zhì)量的穩(wěn)定性。

1 儀器與試藥

Agilent7890A/5977A GC-MS聯(lián)用儀，HP-5 ms ULTRA Inert毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，Database/NIST11.L數(shù)據(jù)庫。

益智仁飲片購自海南，烏藥和山藥飲片均購自貴陽，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學標本館劉曉龍老師鑒定均為正品藥材。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 試液的制備

分別按藥典規(guī)定處方比例1:1:1的益智仁、烏藥和山藥混合的縮泉丸，再分別用8 倍量乙醇回流提取2 次，每次提取1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮，至0.5 g生藥/mL，用3倍石油醚(60～90 ℃)萃取4次，即得石油醚部位，所得石油醚部位再減壓回收，加入乙酸乙酯5 mL溶解，備用。

2.2 GC-MS分析條件

色譜條件：升溫程序為80 ℃保持4 min，以10 ℃/min 的速率升溫至120 ℃，以4 ℃/min 的速率升溫至150 ℃，以1 ℃/min 的速率升溫至160 ℃，以2 ℃/min 的速率升溫至170 ℃，以 4 ℃/min的速率升溫至220 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至 280 ℃，保持10 min。進樣口溫度為250 ℃；恒定流量 1.0 mL·min-1；載氣為氦氣，純度為99.999%；進樣體積 0.2 μL，后進樣口，不分流進樣，溶劑延遲4 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀Agilent 5977A，EI離子源，碰撞能量 70 eV，溫度230 ℃；接口溫度260 ℃，四級桿溫度150 ℃；正離子模式；掃描范圍為m/z 50～500。數(shù)據(jù)庫Database/Nist 11.L。

2.3 方法學驗證

2.3.1 精密度試驗

取同一批樣品，按“2.2”項色譜條件，連續(xù)進樣5次，記錄各共有峰的峰面積和色譜峰的保留值。結(jié)果各共有峰相對峰面積RSD為2.46%，相對保留時間RSD為4.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取同一批樣品，按“2.2”項色譜條件，按“2.1”項下方法平行制備5份供試品溶液，進樣測定，記錄各共有峰的峰面積和色譜峰的保留值。結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD為3.55%，相對峰面積RSD為3.71%，說明方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取同一批樣品，按“2.2”項色譜條件，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，分別于0，2，4，8，12，24，48 h進行測定，記錄各共有峰的峰面積和色譜峰的保留值。結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD為3.28%，相對峰面積RSD為3.19%。說明被分析的各成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 共有模式的建立

數(shù)據(jù)處理參考前期發(fā)表的文獻方法[7]，數(shù)據(jù)格式首先通過DataAnalysis進行轉(zhuǎn)化，利用軟件進行數(shù)據(jù)解析，提取各峰的保留時間、響應值和質(zhì)荷比。通過自編程序計算相對標準時間和相對峰面積，再用Origin軟件生成GC-MS指紋圖譜共有模式，見圖1。

圖1 縮泉丸石油醚提取物指紋圖譜共有模式(標準指紋圖譜)

2.5 相似度分析

采用相關系數(shù)(rcor)和夾角余弦(rcon)進行相似度評價。結(jié)果各批次樣品指紋圖譜與共有模式指紋圖譜峰面積相似度皆大于0.90，表明相似度良好，結(jié)果見表1。

表1 相似度分析結(jié)果

2.6 峰的歸屬和指認

2.6.1 峰的歸屬

通過烏藥石油醚部位和益智仁石油醚部位圖譜進行峰的歸屬，結(jié)果生成縮泉丸指紋圖譜共有模式中標定37個峰，其中1、11、12、25、31、32、34、35、36、37共10個峰為烏藥中的成分，其余27個為益智仁中的成分，見圖2、圖3。

圖2 烏藥石油醚提取物指紋圖譜

圖3 鹽益智仁石油醚提取物指紋圖譜

2.6.2 峰的指認

使用Nist 11.L標準質(zhì)譜譜庫進行檢索，并結(jié)合查閱相關的文獻資料，通過標準圖譜的對比進行共有峰鑒定，以28號峰為內(nèi)參通過峰面積歸一化法計算各組成的平均相對百分含量，結(jié)果見表2。

表2 縮泉丸石油醚部位中的共有成分及其相對質(zhì)量分數(shù)

續(xù)表2

3 結(jié) 論

目前GC-MS發(fā)展成熟，技術運用廣泛，中藥中也常運用GC-MS對揮發(fā)油或其他極性較小的成分進行檢測[8-11]。因縮泉丸縮尿有效部位為石油醚提取物，多為沸點較低的成分，故實驗選擇GC-MS技術進行檢測，并通過數(shù)據(jù)庫和參考文獻進行比對分析，對共有峰進行鑒定，完善對縮泉丸藥效部位的質(zhì)量控制。

經(jīng)GC-MS分析，揮發(fā)性成分共有模式共鑒定37個成分，其中28號內(nèi)參峰為圓柚酮，主要還包括α-菖蒲醇(65%)、長葉松香芹酮(28.53%)、γ-石竹烯(28.2 %)、α-人參烯(13.68%)等。縮泉丸縮尿部位37個成分中10個來自烏藥，27個來自益智仁，從物質(zhì)基礎方面一定程度上解釋了益智仁作為君藥的科學性。