一種含有異氰酸酯功能基團(tuán)單體的生物安全性初步研究

楊振宇 段龍彥 周唯 高婧 方明 陳吉華

自1955 年Buenocore報(bào)道可以在酸蝕處理后的釉質(zhì)表面使用含丙烯酸酯基團(tuán)的樹脂材料進(jìn)行粘接以來[1]，樹脂粘接修復(fù)技術(shù)便成為牙體組織保存修復(fù)的關(guān)鍵技術(shù)[2]。為進(jìn)一步提高粘接耐久性的研究中，外源性粘接劑和牙體組織之間的額外化學(xué)結(jié)合提供了新思路[3]。本課題組近年來選用IPDI和HEMA為原料，成功合成出含有-NCO功能基團(tuán)的可聚合樹脂單體(異氰酸酯-氨基甲酸-甲基丙烯酸酯單體，isocyanate-terminated urethane methacrylate prepolymer， UMP)[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合課題組前期研究,旨在解決反應(yīng)產(chǎn)物摻雜無關(guān)化合物較多這一問題，對產(chǎn)物進(jìn)行純化，并初步評價(jià)該單體的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)(北京百靈威科技有限公司)；甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)[阿拉丁試劑(上海)有限公司]；雙酚A雙甲基丙烯酸縮水甘油酯(Bis-GMA)、雙酚A乙氧基化二甲基丙烯酸酯(Bis-EMA)、二甲基丙烯酸氨基甲酸乙酯(UDMA)、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(MilliporeSigma，美國)；CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；α-MEM培養(yǎng)基(HyCLone，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)。

1.2 主要儀器

MS-H-PRO+數(shù)控加熱型磁力攪拌器(SCILOGEX，美國)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)； LC-20AT高效液相色譜儀(島津公司，日本)。

1.3 合成路線

見圖 1。

圖 1 目的物合成路線

1.4 合成步驟

氮?dú)鈿夥障?，在裝有溫度計(jì)和攪拌磁子的圓底燒瓶里依次加入IPDI 20.0 g(89.97 mmol)、10滴催化劑(DBTBL-丙酮溶液，體積比1∶20)和200 mL無水丙酮在40 ℃恒溫油浴鍋中攪拌反應(yīng)20 min后，滴加11.7 g(89.97 mmol)HEMA，檢測反應(yīng)完全后停止。

待冷卻至室溫，硅膠制樣，柱色譜分離純化(PE/EA=5/1， v/v),溶劑旋蒸得到無色油狀物(10 g)。

1.5 純度測試和結(jié)構(gòu)表征

運(yùn)用高效液相色譜儀對UMP的純度進(jìn)行測試，用干燥丙酮將UMP稀釋至5 ppm，在室溫條件下，吸收波長為254 nm下進(jìn)行純度檢測。

使用核磁共振波譜儀對UMP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。以500 μL d-DMSO-d6為溶劑，加入20 mg UMP。待檢測液清晰透明后，在400 MHz條件下進(jìn)行氫譜(1HNMR)檢測。

1.6 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[5-6]

將Bis-GMA、Bis-EMA、TEGDMA、UDMA以及UMP分別與含雙抗的α-MEM制備濃度梯度20、40、60、80、100、120、140、160 以及180 μg/mL的單體培養(yǎng)液。將第五代人牙髓干細(xì)胞以1×104個/孔密度接種到96 孔板上，每孔加入200 μL α-MEM培養(yǎng)基(含20% FBS， 100 U/mL青霉素G， 50 mg/mL抗壞血酸)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后，更換為上述單體配制成的不同濃度的單體培養(yǎng)液，普通培養(yǎng)基組記作空白對照組。37 ℃培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8，再24 h后使用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的吸光度。

1.7 急性溶血試驗(yàn)[7]

用注射器抽取日本大耳白兔血液，制備稀釋抗凝兔全血并稀釋。將1 mg UMP加入10 mL生理鹽水記為實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組為10 mL生理鹽水，陽性對照組為10 mL蒸餾水，各組制備3 個平行樣。在上述各組均加入稀釋抗凝兔全血0.2 mL，孵育并離心后檢測于545 nm處吸光度值，計(jì)算溶血率。溶血率大于5%方可表明單體具有溶血作用。

1.8 短期全身毒性試驗(yàn)[8]

將30 只6 周齡Balb/c小鼠(體重15～18 g，雌雄各半)隨機(jī)均分為3 組。灌胃前禁食4 h。分別使用UMP(溶于玉米油)、玉米油、Bis-GMA(溶于玉米油)作為藥物，其中UMP和Bis-GMA按照與小鼠體重120 mg/kg的比例進(jìn)行配制。 3 組均按照藥品與小鼠體重比例4 μL/g對小鼠進(jìn)行灌胃，分別記作實(shí)驗(yàn)組、對照組A、對照組B。灌胃后如前正常喂養(yǎng)，每天定時(shí)觀察臨床特征，記錄體重。 7 d后過量麻醉處死,取心臟、腎臟、肝臟等，石蠟包埋，組織切片，HE染色。

1.9 口腔黏膜刺激試驗(yàn)[9]

取4 只6 周齡SD大鼠，雌雄各半。將大鼠麻醉后口腔黏膜消毒。用直徑10 mm的棉球浸濕20 mg UMP，縫在大鼠左側(cè)頰囊，同樣10 mm棉球浸濕生理鹽水后縫合固定在大鼠右側(cè)頰囊。如前正常喂養(yǎng)7 d后過量麻醉處死大鼠，取頰囊處口腔黏膜，石蠟包埋，組織切片，HE染色。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果依據(jù)ISO 10993和中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)量表進(jìn)行分析評估。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0單因素分析, α=0.05。

2.1 純度測試

如圖 2所示，HPLC譜圖顯示在吸收波長為254nm時(shí)UMP濃度為95.322%，保留時(shí)間為3.514 min。

圖 2 UMP的HPLC譜圖

2.2 核磁共振圖譜表征

見圖 3。

圖 3 UMP的 1H-NMR譜圖(DMSO-d6)

2.3 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

單體的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖 4，隨著單體濃度增大，各組細(xì)胞活性均呈現(xiàn)降低趨勢。相比較而言，UDMA與UMP的細(xì)胞毒性相似，半抑制濃度(LC50)位于140 μg/mL； Bis-GMA的細(xì)胞毒性最大，TEGDMA的毒性最低。根據(jù)細(xì)胞相對增殖率(RGR)=實(shí)驗(yàn)組平均吸光度/陰性對照組平均吸光度的公式計(jì)算，RGR數(shù)值大于75%，細(xì)胞毒性為I級。表明UMP單體細(xì)胞毒性良好。

圖 4 不同樹脂單體的細(xì)胞毒性

2.4 急性溶血試驗(yàn)

根據(jù)表 1中測得的吸光度值，按照溶血率=(試驗(yàn)組吸光度-陰性對照組吸光度)/(陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度)×100%，計(jì)算得UMP單體在兔血中溶血率為3.6%(<5%)，表明UMP單體無急性溶血作用。

表 1 各組溶血實(shí)驗(yàn)吸光度數(shù)值

2.5 短期全身毒性試驗(yàn)

經(jīng)過7 d的觀察， 3 組試驗(yàn)動物未見運(yùn)動功能減退、呼吸困難、震顫現(xiàn)象等其它臨床中毒特征，無實(shí)驗(yàn)動物死亡。處死動物后取出心、腎、肝肉眼觀察均未見明顯異常。組織切片觀察如圖 5， 實(shí)驗(yàn)組與兩個對照組相比較未見明顯異常。

圖 5 心臟、腎、肝組織學(xué)觀察(HE, ×200)

連續(xù)7 d記錄小鼠體重，取每組小鼠體重平均值數(shù)據(jù)如圖 6，雌雄分別記錄。由圖 6可得三組小鼠體重均隨觀察時(shí)間逐漸增長， 雄性小鼠體重增加普遍快于雌性小鼠。分析趨勢線斜率可見三組小鼠體重增速大致相同，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增速略快于兩個對照組。由組織學(xué)觀察和體重變化可得，UMP單體對小鼠未見短期全身毒性作用。

圖 6 小鼠7 d內(nèi)體重變化

2.6 口腔黏膜刺激試驗(yàn)

7 d觀察期內(nèi)，含藥物棉球與黏膜貼合緊密，無脫落。肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組均未見頰囊黏膜有潰瘍、糜爛、紅腫等變化。組織學(xué)觀察如圖 7，實(shí)驗(yàn)組和對照組黏膜切片情況相似，上皮和結(jié)締組織正常，無異常角化、未見棘層異常改變等其它異常病理性變化。表明UMP單體對大鼠口腔黏膜無明顯刺激作用。

3 討 論

如何改善牙本質(zhì)粘接的效果一直是口腔修復(fù)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。膠原是牙本質(zhì)粘接界面中含量較高的粘接介質(zhì)[10]，現(xiàn)有的粘接樹脂單體與膠原纖維之間幾乎不存在任何化學(xué)結(jié)合，而單體的單純物理滲透無法將粘接界面的牙源性成分和外源性樹脂有機(jī)整合[11-13]。因此，在粘接劑中加入可以和牙本質(zhì)膠原形成化學(xué)結(jié)合的功能成分，理論上可以引入額外的化學(xué)粘接力來改善牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度及穩(wěn)定性[14]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，將UMP純度提升到95%以上，這為對UMP的進(jìn)一步研究、利用提供了良好的基礎(chǔ)和極大的便利。我們在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行生物安全性研究， 為其將來的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)中研究對象Bis-GMA、Bis-EMA等[15]都是作為粘接單體已在臨床廣泛應(yīng)用，因此以此作為對照，有較強(qiáng)說服力。結(jié)果顯示UMP與UDMA細(xì)胞毒性相似，優(yōu)于Bis-GMA，半抑制濃度LC50位于140～160 μg/mL之間。可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)單體對人牙髓干細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性。

短期全身毒性試驗(yàn)表明灌胃后對小鼠未造成不良影響，可以證明實(shí)驗(yàn)單體對實(shí)驗(yàn)動物無短期全身毒性作用?？谇火つご碳ぴ囼?yàn)經(jīng)肉眼和組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組均無顯著差異。表明實(shí)驗(yàn)單體對實(shí)驗(yàn)動物口腔黏膜組織無顯著刺激性反應(yīng)，可應(yīng)用于口腔環(huán)境。溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)單體在兔血中溶血率為3.6%，符合國標(biāo)規(guī)定不大于5%的要求，表明實(shí)驗(yàn)單體無急性溶血作用。

綜上所述，分析上述四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明本課題組制備的UMP單體有良好的生物安全性，為其進(jìn)一步的性能研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本課題組將進(jìn)一步對UMP單體參與的粘接過程和效應(yīng)進(jìn)行后續(xù)探索，以期為牙本質(zhì)粘接引入化學(xué)成分帶來新曙光。