酸棗仁凍干粉對大鼠睡眠覺醒狀態(tài)及能量代謝率的干預作用研究

徐文祥，阮養(yǎng)春，卞宏生，王艷艷，于 爽，李廷利，黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

睡眠是人體重要的生理活動，也是人體恢復精力所必需的條件。近年來，隨著互聯(lián)網(wǎng)的普及，電子產(chǎn)品的使用占據(jù)了人們大量的睡眠時間，年輕人睡眠不足的情況越發(fā)嚴重。睡眠不足可引起機體反應(yīng)下降，記憶力減退。長時間睡眠不足會導致高血壓、糖尿病、冠心病等疾病，甚至可以增加死亡率[1]。睡眠不足引起的能量代謝紊亂是誘導肥胖產(chǎn)生的重要因素。2004年，哥倫比亞大學開展了一項睡眠時間調(diào)查研究，該研究項目隨機抽取18 000名受試者，受試者年齡均在32～59歲之間。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與每天睡7 h的人相比，睡6 h的人肥胖的幾率要高23%，睡5 h的人肥胖的幾率要高50%，睡眠時間少于4 h的人肥胖的幾率要高73%[2]。由此可見，睡眠不足引起的肥胖正受到廣泛的關(guān)注，更多的學者投入其中，旨在闡明睡眠不足與能量代謝的交互影響及相關(guān)機制。

掩蔽(masking)是光照中最普遍的參數(shù)。正性掩蔽為白天活動的物種在白天接受光照時，其活動性增強。夜間活動的物種在夜間接受黑暗時其活動性增強，該結(jié)論已被廣泛認可[3-4]。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)：24 h持續(xù)黑暗可以很好的影響大鼠的睡眠-覺醒節(jié)律，對于探討大鼠的睡眠-覺醒狀態(tài)及能量代謝率的變化提供了一個方便可靠的造模方法。

酸棗仁系鼠李科植被酸棗的干燥成熟種子，性平，味酸甘，廣泛分布于我國東北、西北、華北及南方等地。酸棗果肉中含有豐富的維生素 C 及多種人體所需氨基酸[5]，為國家衛(wèi)生部頒布的首批藥食兩用品。研究表明，酸棗仁具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗驚厥等作用[6]。長期的臨床應(yīng)用與大量的實驗研究均證明，酸棗仁具有改善睡眠的功效[7]。但是，迄今為止，關(guān)于酸棗仁對睡眠-覺醒狀態(tài)中大鼠的睡眠覺醒狀態(tài)變化及能量代謝率的相關(guān)研究未見報道，相關(guān)機制并不明確。

針對以上問題，本實驗采用皮層腦電描記聯(lián)合實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)，觀察酸棗仁對持續(xù)黑暗條件下，大鼠睡眠覺醒狀態(tài)及能量代謝率的影響。同時，利用酶聯(lián)免疫試劑盒，檢測在酸棗仁的干預作用下，參與下丘腦內(nèi)能量調(diào)控的瘦素(lepin，LEP)、阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)、阿神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)的含量變化。以此闡明酸棗仁對睡眠覺醒狀態(tài)紊亂及能量代謝異常的調(diào)控作用，為酸棗仁的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量220～260 g，實驗動物許可證號：SCXK(黑)2013-004，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。常規(guī)飼養(yǎng)于SPF級動物飼養(yǎng)室中，室溫22～26 ℃，濕度40～70%，12 h明暗交替光照。動物可自由獲取水和食物。

1.2 藥品及試劑炒酸棗仁凍干粉(經(jīng)HPLC測定炒酸棗仁總黃酮含量為0.913 8%，總皂苷含量為3.503%。取炒酸棗仁粗粉230 g(由生酸棗仁置炒鍋內(nèi)在130 ℃炒制4 min制得)，加入8倍量的蒸餾水煎煮，過濾藥液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥量2 kg·L-1，濃縮液進行冷凍干燥得23 g凍干粉末(生藥量10 g·g-1)。由山西大學秦雪梅教授鑒定并提供，由黑龍江中醫(yī)藥大學中藥藥理教研室制備。)。水合氯醛(天津市巴斯夫化工有限公司，批號：津Q/HG 3-371-2001)；義齒基托樹脂(上海新世紀齒科材料有限公司，批號：20141105)；義齒基托聚合物(哈爾濱市齒科器材廠有限公司，批號：130829)；LEP酶聯(lián)免疫試劑盒、POMC酶聯(lián)免疫試劑盒、NPY酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：04/2017)。

1.3 儀器與設(shè)備實驗動物監(jiān)測系統(tǒng)：型號CLAMS，美國COLUMBUS公司(系統(tǒng)是由活動評價模組及睡眠探測分析模組構(gòu)成，組成系統(tǒng)的睡眠高通量篩選功能)，大鼠腦立體定位儀(51600型，美國Stoelting公司)，十六通道生理記錄儀(MP150，美國Biopac公司，SleepSign動物睡眠分析軟件)，多功能微孔板檢測儀(SynergyMx，美國BioTek公司)，分析天平(MS204S，美國Mettler Toledo公司)，低溫高速離心機[3-18R(3006004)，美國TOMOS公司]。

1.4 動物分組及模型復制將SD大鼠在實驗室飼養(yǎng)環(huán)境條件下飼養(yǎng)7 d，適應(yīng)環(huán)境，自由飲食飲水。7 d后，將實驗動物隨機分為兩組，睡眠-覺醒狀態(tài)能量代謝組、機制研究組，每組18只。第一組進行腦皮層電極埋置手術(shù)，實驗前將SD大鼠禁食24 h，正常飲水。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后置于大鼠腦立體定位儀上，夾住雙耳固定，剃除大鼠腦部毛發(fā)并剪開皮膚，暴露出顱骨，用酸蝕劑酸蝕顱骨骨膜，露出白色顱骨，期間用生理鹽水不斷沖洗血漬，并用棉球進行相應(yīng)止血，擦干血漬后可見清晰的顱骨縫隙紋路，在人字縫前1 mm及冠狀縫前1 mm與顱骨中線右側(cè)旁開1 mm交點處鉆孔，露出硬腦膜，埋置腦電電極(electroencephalogram，EEG)，顱骨中點左側(cè)旁開2 mm鉆孔，露出硬腦膜，埋置固定螺絲。在頸部肌肉下埋置肌電電極(electroyography，EMG)，將EEG，EMG電極導線連接于微型插座，纏繞導線，涂抹義齒基托聚合物和義齒基托樹脂使微型插座固定于大鼠腦部，待義齒基托樹脂風干固定后將大鼠隨機分為12 h明暗交替組(L/D:12 h/12 h，LD)、持續(xù)黑暗組(DD：24 h，DD)和給藥組(medication administration Team，MAT)，每組6只。置于相應(yīng)條件的能量代謝籠中，恢復7 d?；謴秃笥? d早7:00進行EEG，EMG的描記，連續(xù)描記24 h。

機制研究組大鼠隨機分為LD組、DD組和MAT組(24 h持續(xù)黑暗)，每組6只。置于相應(yīng)條件的能量代謝籠中，單籠飼養(yǎng)7 d，適應(yīng)環(huán)境。于8 d早7：00進行給藥處理。

1.5 給藥方法取制得的酸棗仁凍干粉5.6 g定容至10 mL，每天按大鼠體質(zhì)量10 mL·kg-1灌胃一次，劑量為56 g·kg-1·d-1(生藥量)。(經(jīng)本實驗室前期預實驗研究表明，該給藥量及給藥天數(shù)可以有效拮抗焦慮)。睡眠-覺醒狀態(tài)能量代謝組中，MAT組每日早7:00灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，LD組與DD組給予相同體積的蒸餾水。機制研究組中MAT組每日早7:00灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，LD組與DD組給予相同體積的蒸餾水。

1.6 指標檢測

1.6.1大腦皮層腦電描記與分析聯(lián)合CLAMS系統(tǒng)判斷大鼠睡眠-覺醒狀態(tài) 睡眠-覺醒狀態(tài)能量代謝組大鼠大腦皮層腦電埋置手術(shù)結(jié)束后，在不同實驗條件下的能量代謝籠中恢復7 d，恢復后于8 d早7：00開始描記，連續(xù)描記24 h。應(yīng)用SleepSign分析軟件，每30 s一幀采集數(shù)據(jù)，對大鼠睡眠-覺醒時間圖譜進行分析，記錄大鼠在不同光照條件下的睡眠時相及睡眠時間，同時依據(jù)CMAMS監(jiān)測系統(tǒng)的睡眠檢測分析模組、活動評估模組、根據(jù)大鼠腦電圖及肌電圖將大鼠睡眠-覺醒周期分為三種時相，即覺醒(waken，W)、非快速動眼睡眠(non-rapid eye movement sleep，NREM)及快速動眼睡眠(rapid eye movement sleep，REM)。

1.6.2CLAMS系統(tǒng)監(jiān)測大鼠能量代謝率 在大鼠進行腦電描記實驗時，同時利用CLAMS系統(tǒng)的睡眠檢測分析模組、活動評估模組、攝食檢測評估模組、間接測熱裝置對大鼠進行監(jiān)測，監(jiān)測時間為早7:00至次日早7:00，連續(xù)記錄24 h。監(jiān)測大鼠的自主活動次數(shù)、攝食量、產(chǎn)熱量。系統(tǒng)設(shè)定每10 s采集一次數(shù)據(jù)，采集參數(shù)為：1 sample/10 s。

1.6.3酶聯(lián)免疫法檢測下丘腦中POMC、LEP、NPY含量變化 機制研究組灌胃給藥7 d后，于8 d早7:00進行麻醉處理，麻醉后將大鼠斷頭取腦，小心剝離出大鼠下丘腦部位，在經(jīng)過分析天平精密稱定后，加入9倍量的生理鹽水，置于冰水浴中充分勻漿，設(shè)定離心轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1，離心10 min后取上清液，置于冰箱冷藏室保存。取出冷藏的試劑盒，在室溫下放置30 min充分復溫平衡，根據(jù)試劑盒說明進行相關(guān)操作。應(yīng)用微孔檢測儀在450 nm處測定其OD值，并依此計算出標準曲線的回歸方程，最終確定樣品中POMC、LEP、NPY含量。

2 結(jié)果

2.1 大腦皮層腦電描記與分析聯(lián)合CLAMS系統(tǒng)判斷睡眠覺醒狀態(tài)及能量代謝率的影響

2.1.1大腦皮層腦電描記大鼠睡眠-覺醒狀態(tài)(24 h)中W、NREM、REM百分比的變化 結(jié)果見Tab 1。與LD組比較，DD組白天W增多(P<0.01)，NREM減少(P<0.01)，REM減少(P<0.01)。夜晚W差異無顯著性，NREM減少(P<0.01)，REM差異無顯著性。與DD組比較，MAT組白天W減少(P<0.05)，NREM增多(P<0.05)，REM增多(P<0.05)。夜晚W差異無顯著性，NREM差異無顯著性，REM增多(P<0.05)。

Tab 1 Percentage change of W，NREM，REM under conditions of LD，DD，MAT in sleep-arousal cycle (24 h)in

2.1.2CLAMS系統(tǒng)監(jiān)測大鼠睡眠-覺醒狀態(tài)(24 h)中睡眠和覺醒時間百分比的變化 結(jié)果見Fig 1。與LD組比較，DD組白天覺醒時間增多(P<0.01)，白天睡眠時間減少(P<0.01)，夜晚覺醒時間差異無顯著性，夜晚睡眠時間差異無顯著性。全天覺醒時間增多(P<0.01)，全天睡眠時間減少(P<0.01)。與DD組比較，MAT組白天覺醒時間減少(P<0.05)，白天睡眠時間增多(P<0.05)，夜晚覺醒時間差異無顯著性，夜晚睡眠時間差異無顯著性，全天總覺醒時間減少(P<0.05)，全天總睡眠時間增多(P<0.05)。

Fig 1 Percentage change in wakefulness and sleep duration under conditions of LD，DD，MAT in rats during wakefulness-sleep cycle (24 h)1:daytime waking time;2:daytime sleep time;3:night waking time;4:night sleep time;5:all day waking time;6:all day sleep time. ##P<0.01 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group

2.1.3大鼠睡眠-覺醒狀態(tài)(24 h)中能量代謝率的變化 結(jié)果見Fig 2-5。與LD組比較，DD組白天自主活動次數(shù)增多(P<0.01),白天攝食量差異無顯著性、白天產(chǎn)熱量差異無顯著性。夜晚自主活動次數(shù)差異無顯著性、夜晚攝食量增多(P<0.05)、夜晚產(chǎn)熱量減少(P<0.05)。全天自主活動次數(shù)增多(P<0.01)、全天總攝食量增多(P<0.05)、全天產(chǎn)熱量減少(P<0.05)，實驗動物體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)。與DD組比較，MAT組實驗動物白天自主活動次數(shù)減少(P<0.05)、攝食量差異無顯著性、產(chǎn)熱量增多(P<0.05)。夜晚自主活動次數(shù)差異無顯著性、攝食量減少(P<0.05)、產(chǎn)熱量增多(P<0.05)。全天總自主活動次數(shù)減少(P<0.05)、總攝食量減少(P<0.05)、產(chǎn)熱量增多(P<0.05)，動物體質(zhì)量增加量減少(P<0.05)。

2.2 酸棗仁凍干粉對DD條件下大鼠下丘腦能量調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的LEP、POMC、NPY影響結(jié)果見Fig 6。與LD組比較，DD組下丘腦內(nèi)LEP含量降低(P<0.01)，POMC含量降低(P<0.01)，NPY含量升高(P<0.05)。與DD組比較，MAT組下丘腦內(nèi)LEP含量升高(P<0.01)，POMC含量升高(P<0.01)，NPY降低(P<0.01)。

Fig 2 Changes of autonomic activity in wake-sleep ##P<0.01 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group

Fig 3 Changes of food intake in sleep-wake #P<0.05 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group

Fig 4 Changes of middle- calories during sleep-wake cycle (24 h)in #P<0.05 vs LD Group;**P<0.01，*P<0.05 vs DD Group

Fig 5 Changes of body weight gain during sleep-wake cycle (24 h)in #P<0.05 vs LD Group;*P<0.05 vs DD Group Fig 6 Effect of freeze-dried powder of jujube kernel on LEP， #P<0.05,##P<0.01 vs LD Group;**P<0.01 DD Group

3 討論

晝夜節(jié)律系統(tǒng)也叫做生物鐘系統(tǒng)，是自然界中生物日夜活動的基本規(guī)律。晝夜節(jié)律周期由生物的基因決定，每一個生物節(jié)律周期基本等于24 h，動物的睡眠、覺醒、狩獵、繁衍等活動都具有顯著的晝夜節(jié)律特征[8]。國內(nèi)外相關(guān)調(diào)查及實驗研究均表明，缺乏睡眠導致的晝夜節(jié)律紊亂會使機體能量代謝出現(xiàn)異常，這也是誘導肥胖形成的重要因素[9]。

下丘腦是機體的能量代謝控制中心，下丘腦中含有多種抑食因子及增食因子，它們相互干預，互相調(diào)控使機體處于能量穩(wěn)定狀態(tài)，瘦素及阿黑皮素原都是重要的抑食因子。瘦素主要與位于下丘腦弓狀核的瘦素受體結(jié)合，通過激活阿黑皮素原(POMC)，達到抑制神經(jīng)肽 Y的作用[10]。瘦素由白色脂肪細胞分泌，是一種多肽類激素[11]?？梢哉{(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)對糖脂代謝、能量代謝的平衡。

阿黑皮素原是一類神經(jīng)肽，經(jīng)水解后形成多種肽，包括促黑激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、β-內(nèi)啡肽等，在垂體、弓狀核、胰腺、皮膚、睪丸等均發(fā)現(xiàn)其表達[11-12]。瘦素可以影響阿黑皮素原在弓狀核的表達，當瘦素濃度低時，阿黑皮素原表達減少，升高瘦素濃度，阿黑皮素原表達隨之增加，在血液中兩者濃度成正比關(guān)系。實驗表明，在給大鼠注射瘦素時，阿黑皮素原表達增加，動物表現(xiàn)出攝食量的下降，表明瘦素部分依賴于阿黑皮素原的變化從而發(fā)揮其生物學作用[13]。

神經(jīng)肽Y是一種由36 個氨基酸組成的生物活性多肽,其在下丘腦的濃度很高,主要分布于下丘腦弓狀核神經(jīng)元。目前已知神經(jīng)肽Y是最強的中樞食欲促進因子,可促進食欲、增加進食,促進攝入高糖、高脂的食物，神經(jīng)肽Y的增加是肥胖產(chǎn)生的重要因素。神經(jīng)肽Y是瘦素作用的介質(zhì),研究發(fā)現(xiàn)腦室內(nèi)注射瘦素可以顯著降低神經(jīng)肽Y mRNA的表達，表明瘦素與神經(jīng)肽Y存在負向調(diào)節(jié)機制[14]。

現(xiàn)代藥理學表明，酸棗仁具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用。長期實驗研究和大量的臨床實踐均表明，酸棗仁具有改善睡眠的作用。但是，到目前為止，尚未見到有關(guān)酸棗仁對睡眠-覺醒狀態(tài)中能量代謝率影響的研究。

基于上述問題，本課題開展了酸棗仁對持續(xù)黑暗條件下睡眠-覺醒狀態(tài)及能量代謝率的影響和其變化機制的研究，并討論。

3.1 正常光照條件下大鼠在24 h周期中能量代謝率的改變本實驗采用SD雄性大鼠為研究對象，首先進行腦部電極及肌肉電極埋置手術(shù)，后置于LD條件中進行單籠飼養(yǎng)。同時利用腦電描記系統(tǒng)聯(lián)合CLAMS系統(tǒng)，對大鼠睡眠-覺醒時間，自主活動次數(shù)，攝食量，產(chǎn)熱量進行實時監(jiān)測。結(jié)果表明與白天相比，夜晚大鼠的機體活性明顯增強，其表現(xiàn)在夜晚覺醒時間延長、活動次數(shù)、攝食量、產(chǎn)熱量均增加，該實驗結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致[15]。由此可以看出，嚙齒類動物屬于夜型性動物，其晝夜節(jié)律與人類相反，夜晚的能量代謝率高于白天。

3.2 持續(xù)黑暗條件下大鼠在24 h周期中能量代謝率的變化將實驗大鼠置于24 h持續(xù)黑暗條件下，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與LD組大鼠相比，DD組大鼠覺醒時間、活動次數(shù)、攝食量、體質(zhì)量均顯著增加，睡眠時間、產(chǎn)熱量則明顯下降。該結(jié)果表明24 h持續(xù)黑暗條件會對大鼠的晝夜節(jié)律產(chǎn)生影響，使大鼠睡眠時間減少，從而導致大鼠機體能量代謝的紊亂，誘導肥胖的產(chǎn)生。在當今社會中，隨著城市化的發(fā)展，人們正處于這種過度光照的環(huán)境下，尤其是年輕人每天長時間接受光照，甚至處于全天光照的環(huán)境中。該現(xiàn)象與實驗中24 h持續(xù)黑暗條件相類似，會使人體處于晝夜節(jié)律紊亂的狀態(tài)，從而導致人體能量代謝紊亂，誘導肥胖的產(chǎn)生[16-17]。

3.3 酸棗仁凍干粉對大鼠在24 h周期中能量代謝率干預作用的探究對處于持續(xù)黑暗條件下的大鼠給予酸棗仁凍干粉干預后，大鼠覺醒時間、活動次數(shù)、攝食量、體質(zhì)量均顯著減少，睡眠時間、產(chǎn)熱量有明顯增加。該結(jié)果表明酸棗仁凍干粉可以延長大鼠睡眠時間，從而改善大鼠能量代謝異常形成的肥胖。

3.4 酸棗仁凍干粉對大鼠在24 h周期中能量代謝率干預作用機制的探究LEP、POMC和NPY是下丘腦中參與能量調(diào)控的重要因子。LEP對POMC有正向調(diào)控作用，LEP對NPY存在負向調(diào)控作用，當缺乏睡眠時，大鼠LEP分泌減少，抑食因子POMC含量下降，食欲促進因子NPY含量隨之升高，大鼠食物攝入量增加，導致體質(zhì)量的增加。當給予酸棗仁凍干粉干預后，睡眠時間增加，大鼠LEP分泌增加，POMC含量增加，NPY含量下降，大鼠食物攝入量減少，體質(zhì)量隨之下降。由此得出結(jié)論，酸棗仁通過改善大鼠睡眠狀態(tài)調(diào)節(jié)下丘腦內(nèi)LEP、POMC、NPY含量，起到糾正機體能量代謝紊亂的作用。

基于上述，我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，酸棗仁通過升高大鼠下丘腦內(nèi)LEP和POMC含量，降低NPY含量使得大鼠的白天覺醒時間減少，睡眠時間增多，自主活動次數(shù)減少、產(chǎn)熱量增多。夜晚攝食量減少、產(chǎn)熱量增多，最終導致實驗動物體質(zhì)量增加量的減少。從而糾正因持續(xù)黑暗條件導致的大鼠睡眠覺醒狀態(tài)紊亂及能量代謝率的異常。此外，本實驗應(yīng)用凍干粉進行研究，低溫凍干對藥物中的揮發(fā)性成分損失很小，能排除藥物中95%以上的水分，利于藥物保存，且加水后能迅速完全溶解。與水煎液，浸膏等相比，應(yīng)用低溫凍干將所需藥物一批次做完，其含量統(tǒng)一，且含量達到一定濃度，保證本次實驗藥效穩(wěn)定性。