差示掃描量熱(DSC)圖譜匹配識別法在魚腥草產地快速鑒別中的應用

鄒 濤 陳宇迪 莫單丹 趙 瑾 和莉穎 郭 姝 歐春麗 曾智強 繆劍華*

(1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2. 廣西藥用植物園，廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，南寧 530023；3. 耐馳科學儀器商貿(上海)有限公司，上海 200131)

魚腥草屬三白草科蕺菜，是多年生草本植物蕺菜的帶根全草，性寒味辛，入肺、肝經，具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋、止血鎮(zhèn)痛、祛淤生新、增強免疫等功能[1，2]。在北方一些地區(qū)魚腥草主要作為中藥使用，在長江以南地區(qū)魚腥草還可作為野生蔬菜。魚腥草已經被國家衛(wèi)生部正式確定為“既是藥品，又是食品”的極具開發(fā)潛力的植物資源之一[3]。魚腥草廣泛種植于我國南方各省，但由于各地日照、土壤等條件的差異，已有大量研究表明不同產地魚腥草的藥效品質存在明顯的不同[4-9]。長期以來，不同產地中藥材成分和藥性的差異嚴重制約了中醫(yī)和中藥材的發(fā)展，一般只有道地性藥材才能發(fā)揮出最好的藥效。目前，中藥材的鑒別方法主要有色譜法、光譜法、分子生物學技術、指紋圖譜鑒定技術等[10-14]。通常的鑒別方法均以樣本中某些有效成分為目標物，比如測定魚腥草中的總黃酮、槲皮苷等物質，通過測量這些物質的含量進行鑒別[15，16]。然而這些方法往往預處理繁瑣，效率低，而且使用大量有機試劑，成本高，環(huán)保隱患大。更重要的是，魚腥草某些成分的含量可以作為品質檢驗的指標，但并不足以成為產地鑒別的充分必要條件,因此中藥材的道地性鑒別研究是目前的一個難點。

差示掃描量熱法(DSC)是一種常見的熱分析方法，具有操作簡單，不用溶劑，樣品用量少，具有檢測快速和圖譜簡單易懂的特點。然而多年來DSC方法并沒有被真正應用于中藥材產地鑒別，只能通過DSC曲線的特征峰溫度的位置和形狀定性判斷中藥材的真?zhèn)?，且只能對不同物種進行區(qū)分鑒別。究其原因主要有兩點：(1)對于天然植物樣品，常規(guī)的DSC測量方法并不能得到有辨識度、穩(wěn)定重復的譜圖；(2)通常的DSC譜圖解析往往著眼于譜峰歸屬，熱焓計算等，而中草藥(例如魚腥草)的DSC曲線，由于其成分復雜，其各個熱效應峰為多組分的綜合熱效應，很難歸屬到具體的物質，常規(guī)譜圖分析方法并不適用，甚至還不如成分測量簡單直觀。本研究則從這兩個方面入手，首先優(yōu)化了DSC測量方法，采用耐高壓不銹鋼坩堝有效抑制組分揮發(fā)對測量譜圖的干擾，探討了其它主要的測量參數影響，最終得到穩(wěn)定、辨識度高的魚腥草DSC圖譜，通過對不同產地魚腥草樣本的重復測試，考察了實驗方法的重復性和穩(wěn)定性。隨之，本文考察了16個不同產地的魚腥草樣本，建立魚腥草產地DSC圖譜數據庫，通過圖譜匹配識別算法，達到快速有效鑒別魚腥草產地的目的。

1 材料與儀器

1.1 魚腥草樣本

由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園提供從不同種植地區(qū)采集的魚腥草整株樣本(16種)，隨機編號為1#～16#。上述樣品經廣西壯族自治區(qū)藥用植物園繆劍華研究員鑒定。

1.2 樣本預處理

樣本經過60℃恒溫24小時烘干，粉碎處理(多功能粉碎機)，采用電動振篩機(8411型)篩分成4個顆粒度的樣本(>60目、60目～110目、110目～170目、<170目)用于測試。

1.3 DSC儀器

實驗采用DSC 204 F1差示掃描量熱儀；常壓密閉鋁坩堝(耐壓3MPa)和密閉不銹鋼坩堝(耐壓10MPa)；Proteus數據處理軟件。

2 結果與討論

2.1 DSC測試方法優(yōu)化

2.1.1坩堝類型的優(yōu)化

魚腥草樣品含有多種揮發(fā)物質，例如水分、芳香物質等，這些物質的揮發(fā)過程是吸熱的。這些吸熱效應會對其它反應(例如某些成分的氧化等)產生干擾甚至掩蓋，常規(guī)的DSC測量方法(鋁坩堝加蓋，蓋上扎孔)下，各種熱效應重疊后就使得譜圖整體上失去了辨識度，而且會導致數據不穩(wěn)定。因此我們的首要工作是抑制實驗過程中的揮發(fā)現象。本研究采用密閉坩堝實現這個目標。

任取一個魚腥草樣本(5#，約20mg，顆粒度為<170目)，分別使用常壓密閉鋁坩堝和耐高壓密閉不銹鋼坩堝進行DSC測試。溫度程序：以5℃/min的升溫速率從60℃升溫至350℃。實驗結束后取出坩堝發(fā)現常壓密閉鋁坩堝都存在鼓包爆開漏氣現象具體結果見圖1。圖1A為常壓密封鋁坩堝3次平行測試的結果，從圖中可以看出：在150℃～240℃間有一個寬的放熱峰，在250℃～265℃間有一個尖銳的吸熱峰。無論從峰的位置還是峰的面積，這3次測試結果重現性差，而且隨著溫度升高，魚腥草易揮發(fā)成分的釋放導致坩堝內壓力增大致使坩堝鼓脹爆開。為解決這個問題，本研究采用耐高壓的不銹鋼坩堝進行測試，結果如圖1B所示，從圖中可以看出：3次平行測試的DSC曲線拓撲圖形基本一致，峰位置與熱焓值也基本相同?？梢娛褂媚透邏痕釄逡种茡]發(fā)反應有效，測試重復性好，合理可行。

圖1 常壓密閉鋁坩堝3次平行測試

2.1.2升溫速率的優(yōu)化

分別稱取編號為5#，目數<170目的魚腥草樣本約20mg，裝入4只不銹鋼坩堝內，分別以2℃/min、5℃/min、10℃/min和20℃/min升溫速率從60℃升溫至350℃，考察不同升溫速率對DSC結果的影響，結果如圖2所示。

圖2 魚腥草不同升溫速率的DSC曲線圖

結果顯示，隨著升溫速率的提升，兩個放熱峰的位置均向高溫段移動，這是由于升溫速率變快導致的滯后現象，升溫速率越快這種滯后現象就越加明顯。同時隨著升溫速率的加快，峰拖尾和重合疊加的效應越明顯，會導致DSC圖譜失去很多信息。另外一方面，升溫速率過低時，靈敏度降低，DSC峰不明顯，測試耗時長。因此，綜合考慮效率和譜圖信息的情況下，實驗選擇5℃/min的升溫速率。

2.1.3樣本顆粒度的優(yōu)化

同樣以5#魚腥草樣本為例，稱取顆粒度分別為<170目、110目～170目、60目～110目之間和>60目的樣品20mg，以5℃/min升溫速率升溫至350℃，考察不同顆粒度對DSC結果的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同顆粒度的5#魚腥草樣本的DSC曲線圖

從圖中可以看出，隨著顆粒度變大，兩個放熱峰的位置均出現了滯后的情況，第1個放熱峰更加明顯一點，<170目的樣本第一個放熱峰峰值溫度為142.7℃，>60目的為151.5℃，滯后約9℃，這可能是由于顆粒越大越不利于傳熱與反應。同時組成第2個大峰的3個峰的比例出現變化，205℃左右的第1個肩峰比例降低到最后幾乎看不出來，而275℃左右的第3個肩峰逐漸變得明顯。為保留更多的峰信息，而且較細的顆粒度使在測試取樣量較小的情況下更具樣本代表性，因此本實驗最后確定<170目的樣本，稱樣量約為20mg，以5℃/min升溫速率升溫至350℃來考察魚腥草樣本的DSC曲線。

2.2 DSC測量方法的驗證

按上述方法對16個魚腥草樣本進行重復性測試，每個樣品取4平行。仍以5#魚腥草的DSC曲線為例，對得到的DSC曲線的兩個放熱峰的起始點溫度、峰值溫度及峰面積進行了標注，具體結果見表1。

表1 魚腥草5#平行實驗間的DSC曲線特征值及重復性列表

從表1的數據可以看到：第1個放熱峰的峰值溫度在142.8℃左右，焓值約為25.8 J/g。第2個放熱峰的峰值溫度在226.4℃左右，焓值約為155.4J/g，所有特征溫度的數據的標準偏差均小于0.5%，說明此方法重復性良好。

按2.1方法對16個樣品分別進行測試，其DSC曲線如圖4所示。從圖上可以明顯看出不同產地魚腥草的DSC曲線及其特征峰都有差異，有的差異明顯，有的差異較小，這些差異反映了不同產地魚腥草在化學成分和理化性質上存在差異，而本研究改進的DSC測量方法能夠清晰地展示這些差異，說明此方法特異性良好。

圖4 16個魚腥草樣本的DSC曲線

由于樣品的“微環(huán)境”(密閉坩堝內)是空氣氣氛，這些放熱峰對應于組分的氧化和熱裂解。雖然放熱反應的詳細機理尚待進一步研究，但是上述的實驗方法與參數，可以得到穩(wěn)定可靠的魚腥草DSC譜圖。

2.3 魚腥草DSC譜圖相似度計算與識別

2.3.1魚腥草DSC譜圖相似度計算

優(yōu)化的DSC測量方法為本研究對魚腥草DSC圖譜進行“宏觀”比對建立了基礎。所謂宏觀比對，指的是不再采用常規(guī)的DSC解析方法，不以具體峰值和峰面積為參數，而是計算兩條DSC曲線的相似度，通過相似度匹配達到產地鑒別的目標。這個方法類似于人臉識別技術。

對于本實驗研究的魚腥草DSC圖形識別方法的原理和流程如下：(1)通過DSC測試得到DSC曲線圖像；(2)對測得的DSC曲線圖像二值化處理；通?？梢詫SC曲線定義為一個像素點的集合，對于一幅大小為m×n的譜圖圖像s,可將其定義為點集：

s={pi,j}i=1,2,…,m;j=1,2,…,n

(1)

根據式(1)，點集s滿足下述條件：i的取值范圍為整數1～m，j的取值范圍為整數1～n，且i，j的取值涵蓋了其各自取值范圍內的所有可能組合；同時像素點pi,j在曲線中對應的位置為(x,y),x的取值范圍為溫度范圍60℃～350℃，y的取值范圍為熱流信號強度范圍；(3)獲取圖像識別所需的特征點，如峰起始溫度點，峰值溫度點，焓值面積等特征信息，將所得的信息保存成數據庫；(4)對新測試的DSC曲線與數據庫中的曲線逐一匹配，計算相似度，輸出識別結果。

依然以5#樣本為例，如表2所示，研究發(fā)現平行測試曲線之間的相似度均超過99%，這說明該方法是合理的。其余樣品通過類似處理，同一產地魚腥草樣品平行測試的DSC曲線間的相似度也均超過99%，說明該方法重復性好可靠性高。

表2 魚腥草5#平行實驗間的DSC曲線特征值及圖形識別相似度列表

2.3.2魚腥草DSC譜圖相似度識別

如上所述，可以事先采集不同產地魚腥草樣本建立DSC曲線數據庫，對未知樣品的DSC曲線進行相似度匹配，從而實現不同產地魚腥草的快速分類鑒別。本研究將16種魚腥草樣本的DSC圖譜建立數據庫，然后在這16種樣本中分別重新取樣，按照2.1方法測試，將測得的DSC譜圖與數據庫進行逐一匹配識別，最終的識別驗證結果如表3所示。

表3 16個魚腥草樣本的相似度識別列表

表3數據結合圖4可見，對于DSC圖譜比較接近的樣本，本研究算法可以得到較高的相似度，反之則計算得到較低的相似度。而且對于本類樣本，相似度數值均達到99%以上,識別準確率達到100%，說明本研究采用的相似度算法穩(wěn)定可靠。

3 結論

本研究首次將DSC圖譜相似度識別匹配技術應用到魚腥草產地的鑒別研究中，結果表明該方法識別度好，準確率高，操作簡單方便，能夠實現魚腥草樣品產地的高效、準確鑒別，為DSC法用于中藥材產地鑒別提供了定量化基礎，也為魚腥草及其他中藥材的道地性鑒別研究和質量控制提供了新的研究方法和思路。此外，中藥材的藥效一般與藥材的土壤、環(huán)境、氣候水文條件等息息相關，通過不同產地魚腥草的藥性、環(huán)境條件與DSC圖譜特征的相關性研究，也可能為道地性藥材基地的選址建立提供科學的參考依據，這也將是我們需要深入研究的一個方向。