呼倫貝爾地區(qū)牛體表寄生蜱中羊種布魯氏菌的分離與鑒定

黃天鵬，郭旭，孫長云，陳經(jīng)雕，朝木麗格，武婕，格日勒?qǐng)D?

1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2額爾古納市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古額爾古納市 022250；3廣東省疾病預(yù)防與控制中心，廣州 511430

0 引言

【研究意義】布魯氏菌病（Brucellosis）是由布魯氏桿菌感染而引起的人畜共患傳染病。布魯氏菌病的影響及危害較為嚴(yán)重，據(jù)報(bào)道世界上每年大約新增布魯氏菌病患者達(dá)50萬人，被WHO稱之為“再度肆虐”的傳染病之一[1-2]。目前，全國有23個(gè)省份（自治區(qū)）均都有人間布魯氏菌病陽性病例的發(fā)生，特別是近期甘肅省蘭州市發(fā)生了一起大規(guī)模人感染布魯氏菌的事件，內(nèi)蒙古地區(qū)是我國布魯氏菌病發(fā)病流行最為嚴(yán)重的疫區(qū)之一[3-5]。隨著內(nèi)蒙古畜牧養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的形成，促使牛羊養(yǎng)殖模式發(fā)生改變，市場上畜產(chǎn)品加工和流通都發(fā)生了變化。其中值得一提的是，布魯氏菌病的宿主范圍較為廣泛，除了家畜牛、羊以外還包括野生動(dòng)物、鳥類、魚類、兩棲類甚至人類等[6-9]。更為有趣的是據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一些吸血節(jié)肢動(dòng)物如蜱蟲等也可能成為布魯氏菌的適宜宿主，增加了布魯氏菌病在不同動(dòng)物之間的傳播風(fēng)險(xiǎn)[10]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】布魯氏菌病的持續(xù)存在和死灰復(fù)燃的流行態(tài)勢可能與儲(chǔ)存宿主的數(shù)量有關(guān)，在多種儲(chǔ)存宿主中蜱蟲也是重要的組成部分。1943年，ZOTOVA等[11]通過體外試驗(yàn)證實(shí)，邊緣璃眼蜱（Hyalomma marginatum）屬于布魯氏菌病的傳播媒介，其可以儲(chǔ)存并傳播該病原給健康動(dòng)物。1951年，ZOTOVA等[12]再次通過實(shí)驗(yàn)室的檢測證實(shí)，邊緣璃眼蜱（Hyalomma marginatum）可以作為布魯氏菌的寄生宿主?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】將采集的蜱蟲放置在患有布魯氏菌病的豚鼠體表進(jìn)行吸血，隨后取下飽血蜱蟲進(jìn)行研磨，并將研磨后的組織液注入豚鼠體內(nèi)，而培養(yǎng)一段時(shí)間后的蜱蟲研磨成乳濁液，將乳濁液注射給健康的豚鼠，一段時(shí)間后檢測豚鼠血清學(xué)顯示布魯氏菌陽性。該結(jié)果表明邊緣璃眼蜱和薩氏璃眼蜱可以作為布魯氏菌的貯存媒介，并存在傳播布魯氏菌病的潛在風(fēng)險(xiǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文為了確定呼倫貝爾地區(qū)主要分布的蜱蟲種型以及闡明牛體表寄生草原革蜱與牛羊布魯氏菌病的相關(guān)性。通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定出該地區(qū)的優(yōu)勢蜱種。同時(shí)，首次在呼倫貝爾地區(qū)蜱體內(nèi)成功分離到4株布魯氏菌，其中2株菌為羊種2型，2株菌為羊種3型布魯氏菌。本試驗(yàn)為內(nèi)蒙古地區(qū)布魯氏菌的溯源和有效防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲樣本的采集

2020年4至5月，在內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟的新巴爾虎右旗選擇兩個(gè)牧區(qū)點(diǎn)（包括貝爾蘇木和克爾倫蘇木）進(jìn)行蜱蟲的采集工作。從40只自然放牧的牛體表共采集191只蜱蟲，每頭牛體表采集寄生蜱蟲3—5只。

1.2 蜱蟲傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察

應(yīng)用解剖顯微鏡對(duì)采集的蜱蟲分別進(jìn)行形態(tài)觀察與記錄。觀察部位主要包括假頭基、盾板、須肢、生殖孔、足轉(zhuǎn)節(jié)、肛溝和氣門板等。參照鄧國藩等[13]、HORAK等[14]和巴音查汗等[15]的方法，完成蜱蟲的初步鑒定。

1.3 蜱蟲的分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 蜱蟲線粒體16S rRNA基因和CO ?基因引物的設(shè)計(jì) 在Genbank數(shù)據(jù)庫中下載不同蜱種類（主要包括草原革蜱、森林革蜱和全溝硬蜱等）的線粒體 16S rRNA基因序列，經(jīng)過Genetyx生物軟件對(duì)下載序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，確定16S rRNA基因序列中相對(duì)保守的區(qū)域。借助Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)16Sf和16Sr引物對(duì)。針對(duì)蜱蟲的CO ?基因，參考FOLMER等[16]報(bào)道的引物對(duì)（包括LCO1490和HCO2198）。上述兩對(duì)引物委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所示（表1）。

表1 蜱線粒體PCR引物設(shè)計(jì)序列Table 1 Primers sequences for PCR of mitochondria

1.3.2 蜱蟲線粒體16S rRNA基因和CO I基因的克隆設(shè)定 PCR 反應(yīng)體系為 50 μL：2×Taq PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，剩下用雙蒸水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行基因測序，并將測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行對(duì)比分析，用MEGA 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 布魯氏菌分離培養(yǎng)與鑒定

1.4.1 布魯氏菌分離培養(yǎng) 收集蟲卵和消毒的蜱蟲，放于1.5 mL無菌EP管中，用滅菌研磨棒進(jìn)行研磨，加200 μL生理鹽水進(jìn)行混勻，將混合液加入到布氏肉湯培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)物劃線于布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基中，并放入37℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日觀察，持續(xù)培養(yǎng)30 d以上。對(duì)分離的菌落進(jìn)行觀察，并對(duì)該菌落進(jìn)行革蘭氏染色和柯氏染色。

1.4.2 布魯氏菌Bcsp31和Omp22檢測及序列分析參考QUEIPOORTUNO等[17]針對(duì)布魯氏菌Bcsp31序列設(shè)計(jì)的特異性引物，和參考TANG等[18]針對(duì)布魯氏菌Omp22序列設(shè)計(jì)的特異性引物，委托上海桑尼生物科技有限公司合成。引物序列如表2所示。

表2 引物序列Table 2 The primer sequence

1.5 布魯氏菌分型鑒定

1.5.1 布魯氏菌常規(guī)分型鑒定 布魯氏菌血清凝集、染料抑菌以及噬菌體裂解試驗(yàn)屬于布魯氏菌常規(guī)鑒定內(nèi)容。其中血清凝集試驗(yàn)包括布病陽性血清凝集和A、M和R單因子血清凝集；染料抑菌試驗(yàn)包括堿性復(fù)紅和硫瑾抑菌試驗(yàn)；噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)包括 BK2、104Tb 和 Tb 3種噬菌體裂解試驗(yàn)。另外，還有硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、CO2需要。試驗(yàn)采用雙層瓊脂平板法，具體操作按照布魯氏菌常規(guī)鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行。

1.5.2 AMOS-PCR布魯氏菌分型鑒定 AMOS-PCR引物參照參考文獻(xiàn)[19]，委托上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如表3所示；擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性96 ℃ 5 min，變性96 ℃ 50 s，退火60 ℃ 50 s，延伸72 ℃ 90 s；35個(gè)循環(huán)；終末延伸72 ℃ 7 min，產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 AMOS-PCR引物序列Table 3 The primer sequence of AMOS-PCR

2 結(jié)果

2.1 蜱蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)解剖顯微鏡（OLYMPUS SZ51）觀察，雄性草原革蜱：蟲體為卵圓形、假頭短且呈矩形、須肢外緣呈弧形、盾板有較淡的琺瑯彩、有緣垛且緣垛上有琺瑯斑，還有混雜不均一的銀白色花斑、雄蜱腹面無幾丁質(zhì)板、各足基節(jié)順序增大，4對(duì)足粗短，第1對(duì)足基節(jié)內(nèi)外距近相等，第4對(duì)足基節(jié)最大且其外距不超過該節(jié)后側(cè)緣，肛門后部有明顯的肛溝圍繞。雌性草原革蜱：蟲體為卵圓形、孔區(qū)較大、有濃厚的琺瑯彩、背緣無幾丁質(zhì)增厚部、其它形狀與雄性蜱蟲一樣（圖1）。

圖1 草原革蜱的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphology of identification D.nuttalli specimens

2.2 草原革蜱的分子生物學(xué)鑒定

草原革蜱的 16S rRNA基因序列遺傳進(jìn)化樹結(jié)果利用 MEGA 7.0軟件成功構(gòu)建了草原革蜱 16S rRNA基因和CO ?基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)草原革蜱16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，呼倫貝爾地區(qū)采集的蜱蟲與 NCBI中已注冊(cè)的俄羅斯地區(qū)、新疆地區(qū)和河北地區(qū)草原革蜱在同一個(gè)進(jìn)化分支上（圖2）。根據(jù)草原革蜱CO ?基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，呼倫貝爾地區(qū)采集的蜱蟲與NCBI中已注冊(cè)的內(nèi)蒙古、新疆、吉林、河北和甘肅地區(qū)的草原革蜱在同一進(jìn)化分支上，且與內(nèi)蒙古地區(qū)草原革蜱進(jìn)化關(guān)系最近，而與其他種屬的蜱蟲形成分支（圖3）。上述結(jié)果也表明，本試驗(yàn)采集的蜱蟲種型為草原革蜱。

圖2 基于16S rRNA 基因序列NJ法種系發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Evolutionary relationships by NJ methods analysis in 16S rRNA gene sequences

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

成功在飽血蜱蟲中分離4株布魯氏菌，分別命名為 B.melitensis IMHT5、B.melitensis IMHT6、B.melitensis IMHT7、B.melitensis IMHT8。經(jīng)血平板培養(yǎng)基和布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)出針尖狀小菌落，菌落呈無色半透明，邊緣濕潤光滑（圖 4）。經(jīng)革蘭氏染色，細(xì)菌呈革蘭氏陰性短桿菌。經(jīng)柯氏染色后菌體呈紅色（圖5）。

圖4 分離菌的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of isolated bacteria

圖5 分離菌革蘭氏染色及柯氏染色鏡檢Fig.5 Gram staining and Kirschner staining microscopic examination of isolated bacteria（×100）

2.4 分離菌株的Omp22序列遺傳進(jìn)化樹結(jié)果

根據(jù)布魯氏菌的Omp22構(gòu)建的進(jìn)化樹可見，此次分離的4株布魯氏菌株聚集在同一末端分支上，與新疆的分離菌聚類在同一分支上，而與西班牙、德國和印度的分離株相對(duì)距離較遠(yuǎn)（圖6）。

圖6 基于布魯氏菌Omp22構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 phylogenetic tree based on Omp22 of Brucella

2.5 牛種布魯氏菌的AMOS-PCR分型

經(jīng)AMOS-PCR方法鑒定后發(fā)現(xiàn)，分離的4株布魯氏菌與羊種布魯氏菌處于同一預(yù)期大小，條帶大小為731 bp。而且電泳檢測結(jié)果顯示牛種和豬種布魯氏菌分別在498 bp和285 bp處擴(kuò)增出預(yù)期條帶，陰性對(duì)照未見擴(kuò)增結(jié)果（圖7）。該結(jié)果表明分離的4株菌均屬于羊種布魯氏菌。

圖7 布魯氏菌 AMOS-PCR鑒定Fig.7 Identificated of Brucella by AMOS-PCR

2.6 布魯氏菌常規(guī)分型試驗(yàn)

經(jīng)常規(guī)分型試驗(yàn)證實(shí)2株分離布魯氏菌為羊種3型菌株（表4），具有以下特征：CO2（-）、H2S（-）；單項(xiàng)特異性血清凝集A（+）、M（+）、R（-）；染料抑菌硫堇和堿性品紅（+）、噬菌體裂解BK2（+）、Tb（-）、104Tb（-）。而其它2株菌為羊種2型布魯氏菌，具有以下特征：CO2（-）、H2S（-）；單項(xiàng)特異性血清凝集 A（+）、M（-）、R（-）；染料抑菌硫堇和堿性復(fù)紅（+）、噬菌體裂解BK2（+）、Tb（-）、104Tb（-）。

表4 布魯氏菌分型鑒定Table 4 The results of classification and identification of Brucella

3 討論

近十年以來，隨著氣候變化內(nèi)蒙古各個(gè)地區(qū)的家畜嚴(yán)重遭受蜱蟲攻擊。不僅給家畜帶來皮膚等組織的直接損傷，而且增加了蜱傳疾病發(fā)病流行的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)王建軍等報(bào)道[20]，認(rèn)為呼倫貝爾地區(qū)僅存在長角血蜱（Haemaphysalis Iongicornis）和全溝硬蜱（Ixodes persuleatus）。在近幾年調(diào)研結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，呼倫貝爾地區(qū)蜱蟲種類的變化相當(dāng)突出，不只存在上述兩種硬蜱。2020年4—5月，筆者選擇內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟的新巴爾虎右旗兩個(gè)牧區(qū)點(diǎn)進(jìn)行蜱蟲的采集工作。在40只自然放牧的牛體表共采集191只蜱蟲，每頭牛體表采集寄生蜱蟲3—5只。借助解剖鏡對(duì)采集蜱蟲的特殊器官進(jìn)行觀察和圖像采集，根據(jù)鄧國藩等[13]對(duì)蜱蟲的形態(tài)學(xué)描述方法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)季節(jié)呼倫貝爾地區(qū)活躍的優(yōu)勢蜱種為草原革蜱（D.nuttalli）。這結(jié)論與筆者 2015年以來所得到的蜱蟲種型信息相吻合[21]。雖然傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法一直是研究者們對(duì)蜱蟲種型鑒定工作中采取的主要手段之一，但這種鑒定方法不僅容易受到主觀因素的影響，而且對(duì)蜱蟲的多樣性和遺傳進(jìn)化研究存在局限性[22]?；谏鲜鲆蛩乜紤]，本研究選擇了蜱蟲遺傳保守性基因16S rDNA和CO I基因，進(jìn)行種型和遺傳進(jìn)化分析[23]。2種靶基因序列經(jīng)過克隆和測序后再與GenBank上注冊(cè)的參考序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，與已知的草原革蜱相同序列同源性均達(dá)到99%以上。用Mega 7.0軟件分析根據(jù)2種基因繪制出的遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，我們鑒定的草原蜱蟲種與俄羅斯地區(qū)、新疆地區(qū)和河北地區(qū)草原革蜱的參考序列處在同一個(gè)進(jìn)化分支上，而與其他種屬的蜱蟲相距甚遠(yuǎn)。該結(jié)果可能提示，上述3個(gè)地區(qū)存在同一種草原革蜱來源的祖先蜱蟲，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)蜱傳疾病的溯源具有重要的意義。

眾所周知，布魯氏菌病是一類古老的人畜共患病。早在1943年，ZOTOVA等[11]闡述通過體外試驗(yàn)的方法證明，邊緣璃眼蜱（H.marginatum）可以儲(chǔ)存布魯氏菌并能夠?qū)⒃摬≡瓊鞑ソo健康動(dòng)物。最近，HOSSEINI等[24]應(yīng)用分子生物技術(shù)檢測到微小牛蜱（Boophilus microplus）中的布魯氏菌基因產(chǎn)物，認(rèn)為微小牛蜱在布魯氏菌病傳播過程中可能發(fā)揮媒介作用。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的PCR檢測布魯氏菌的方法很多，在布魯氏菌屬的水平檢測一般選用單對(duì)引物PCR，其中主要是以Bcsp31、Omp22和IS711等作為靶基因設(shè)計(jì)引物[17-18，25]。本試驗(yàn)在呼倫貝爾地區(qū)的牛體表上采集191只蜱蟲，以常規(guī)方法率先成功分離出4株羊型布魯氏菌。然后選擇了Bcsp31和Omp22對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，而后在種及生物型水平的鑒定則選用多對(duì)引物的多重PCR方法，比如AMOS-PCR和多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析方法（MLVA）等[26-28]。結(jié)果顯示4株分離菌與羊源、牛源和豬源布魯氏菌的Bcsp31同源性為99%以上。而且，根據(jù)布魯氏菌的Omp22構(gòu)建的進(jìn)化樹中可見，本試驗(yàn)分離的4株布魯氏菌株聚集在同一末端分支上，與新疆的分離菌聚類在相同分支，而與西班牙、德國和印度等國外的布魯氏菌分離株也不甚遠(yuǎn)。該結(jié)果表明，4株布魯氏菌分離株均屬于相同布魯氏菌屬成員，均為我國國內(nèi)主要流行菌株，但并非國外輸入菌株。

AMOS-PCR是布魯氏菌種型鑒定的常規(guī)方法之一，文獻(xiàn)報(bào)道該方法可鑒定羊種1、2、3型布魯氏菌，牛種1、2、4型布魯氏菌,豬種1型布魯氏菌和綿羊附睪種布魯氏菌[29]。本試驗(yàn)經(jīng) AMOS-PCR方法鑒定了4株分離菌的生物型，并與常規(guī)分型鑒定試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株布魯氏菌分離株分別鑒定為2株符合羊種3型布魯氏菌和2株符合羊種2型布魯氏菌特點(diǎn)，2種方法鑒定結(jié)果符合率為100%。本試驗(yàn)成功分離到的4株布魯氏菌來源于3頭牛體表的寄生蜱體內(nèi)，其中兩株布魯氏菌（B.melitensis NMT6和B.melitensis NMT7）來源于同一頭牛體表的寄生蜱體內(nèi)，其余兩株布魯氏菌（B.melitensis NMT5和 B.melitensis NMT8）分別來源于不同的牛體表的寄生蜱體內(nèi)。該試驗(yàn)結(jié)果提示，在牧區(qū)流行的羊種3型布魯氏菌和羊種2型布魯氏菌不僅可以在牛羊等家畜體內(nèi)存在[30]，而且可以在草原革蜱體內(nèi)存活。這對(duì)動(dòng)物布魯氏菌的溯源研究具有重要意義。

4 結(jié)論

通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的辦法，鑒定出呼倫貝爾地區(qū)4—5月優(yōu)勢蜱種為草原革蜱。并首次從牛體表采集的草原革蜱樣本中分離到4株羊種布魯氏菌。為內(nèi)蒙古地區(qū)布魯氏菌病傳播媒介調(diào)查以及溯源研究提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。