補(bǔ)肺活血膠囊對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道重塑的干預(yù)作用及機(jī)制研究

史良恬，晏 軍，孟玉鳳，王貴澍，馮淬靈

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)棗莊醫(yī)院，山東 棗莊 277499；3.北京大學(xué)人民醫(yī)院，北京 100044)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的、可以預(yù)防和治療的疾病，以持續(xù)呼吸癥狀和氣流受限為特征，通常是由于明顯暴露于有毒顆?；驓怏w引起的氣道和(或)肺泡異常導(dǎo)致[1]。其發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高，給患者帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。吸煙是導(dǎo)致COPD的首要致病因素。煙草中的有害顆粒進(jìn)入肺內(nèi)引起肺部炎癥反應(yīng)，刺激肺內(nèi)黏液高分泌，阻塞氣道，影響纖毛功能，引起肺組織結(jié)構(gòu)破壞，同時氣道內(nèi)的抗氧化劑、抗蛋白酶、基底細(xì)胞等表達(dá)增加，促進(jìn)受損組織修復(fù)；隨著反復(fù)的損傷與修復(fù)，小氣道狹窄、肺實質(zhì)破壞、肺結(jié)構(gòu)改變，最終引起肺彈性回縮力降低、氣流受限。氣道重塑是COPD的主要病理特征，是導(dǎo)致COPD肺功能持續(xù)性下降的主要原因，是影響COPD發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的重要因素。研究[3]表明，在香煙煙霧或有害物刺激下，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1)/Smads信號通路的激活參與并調(diào)節(jié)COPD氣道重塑的病理過程。同時，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞活化，釋放眾多蛋白酶，蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，誘導(dǎo)COPD氣道重塑及肺氣腫形成。補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、補(bǔ)骨脂、赤芍3味藥組成，具有補(bǔ)肺固腎、益氣活血、扶正祛邪之功，廣泛應(yīng)用于COPD的臨床治療[4-5]。研究[6]表明，補(bǔ)肺活血膠囊可以抑制膠原沉積，改善氣道重塑，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究從TGF-β1/Smads信號通路、蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)角度探討補(bǔ)肺活血膠囊干預(yù)COPD氣道重塑的作用機(jī)制，為COPD的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 6～8周SPF級雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2018-0006。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。本研究方案通過北京大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)，審批號：2020PHE041。

1.2 藥物及試劑 補(bǔ)肺活血膠囊(批號 20180509，每粒0.35 g)：廣東雷允上藥業(yè)有限公司；茶堿緩釋片(批號 H44023791)：廣州邁特興華制藥廠有限公司。大前門香煙(烤煙型，焦油量9 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)：上海煙草公司；脂多糖(lipopolysaccharide ， LPS；貨號L2880)：美國Sigma公司；Masson染色試劑盒(貨號BB-4422)：上海BestBio公司；TGF-β1兔單克隆抗體(貨號 ab215715)、嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)兔多克隆抗體(貨號 ab21595)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)兔單克隆抗體(貨號 ab76003)、甘油醛-3磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)小鼠單克隆抗體(貨號 ab8245)：英國Abcam公司；Smad7兔多克隆抗體(貨號 25840-1-AP)、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)小鼠單克隆抗體(貨號 66135-1-Ig)：美國Proteintech公司；Smad2/3兔單克隆抗體(貨號 8858)、Smad4兔單克隆抗體(貨號 46535)：美國CST公司；TGF-β1(貨號 AF1027)：美國Affinity公司；金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)小鼠單克隆抗體(貨號 NB100-74551)：美國Novus公司。

2 方法

2.1 動物分組與模型復(fù)制 使用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組、模型組、補(bǔ)肺活血組、茶堿組。使用香煙煙霧暴露復(fù)合氣道滴入LPS的方法復(fù)制COPD大鼠模型，時間為28 d。使用自制煙熏箱，點(diǎn)燃8支大前門香煙，煙熏10只大鼠，每日1次，每次30 min，連續(xù)28 d。將LPS粉末與生理鹽水溶解成濃度為1 mg/mL的LPS溶液，于第1、11、21天將LPS溶液200 μL從大鼠氣道內(nèi)滴入，滴藥日不熏煙。實驗第21天起，模型組及正常對照組每日以10 mL/kg生理鹽水灌胃1次。按成人臨床劑量計算補(bǔ)肺活血組每日給藥量為0.42 g/kg，茶堿組每日給藥量為0.02 g/kg，蒸餾水稀釋，按照每日10 mL/kg的藥量進(jìn)行灌胃。連續(xù)給藥40 d。

2.2 標(biāo)本采集 實驗第61天取材。最后一次給藥后24 h，于大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉50 mg/kg，使其進(jìn)入麻醉狀態(tài)，腹主動脈取血，4 ℃保存；結(jié)扎右肺肺門，分離右肺放入凍存管，液氮保存；夾取心臟，于右心室輸注生理鹽水，夾破左心耳，肺組織逐漸變白后，改為4%多聚甲醛輸注灌流，分離左肺，放入4%多聚甲醛固定，48 h后脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟組織備用。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測方法

2.3.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察肺組織的形態(tài)變化 將包埋好的石蠟組織切成3 μm切片，經(jīng)烤片、脫蠟、水化后，依次進(jìn)行蘇木素染色、分化液分化、返藍(lán)液返藍(lán)、伊紅染色、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織氣道及肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)、炎癥細(xì)胞浸潤等。

2.3.2 Masson染色觀察氣道中膠原纖維沉積程度 將組織切片、烤片、脫蠟、水化后， Weigert鐵蘇木素染色，酸性乙醇分化液分化，Masson藍(lán)化液返藍(lán)，自來水、蒸餾水水洗，麗春紅染色，弱酸工作液、磷鉬酸溶液、弱酸工作液依次水洗，苯胺蘭染色液染色，弱酸工作液水洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算膠原纖維與氣道的面積，以膠原纖維面積與氣道面積之比代表膠原沉積程度。

2.3.3 免疫組織化學(xué)染色觀察肺組織中TGF-β1、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平 將組織切片、烤片、脫蠟、水化，95 ℃ 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修復(fù)液修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline ，PBS)水洗，3%過氧化氫封閉，PBS水洗，山羊血清封閉，一抗(TGF-β1、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1的比例分別為1∶250、1∶1 000、1∶1 000、1∶500、1∶500)孵育，PBS水洗，二抗室溫孵育，PBS水洗，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidin，DAB)顯色，自來水水洗，復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。

2.3.4 Western blot法檢測肺組織TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Smad7、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平 取30 mg大鼠肺組織，加入RIPA蛋白酶抑制劑混合液，冰上研磨，4 ℃離心機(jī)離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度，按比例稀釋蛋白樣本，95 ℃變性，配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)凝膠，按順序上樣10 μL蛋白樣品，90 V電泳90 min，200 mA電轉(zhuǎn)印膜90 min左右，5% 脫脂奶粉/TBST緩沖鹽溶液(non-fat dry milk/Tris buffered saline tween，NFDM/TBST)封閉1 h，根據(jù)目的蛋白分子量大小依序裁減轉(zhuǎn)印膜，一抗(TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Smad7、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1比例分別為1∶500、1∶5 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000)孵育，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，增強(qiáng)型化學(xué)(enhanced chemiluminescence，ECL)超敏發(fā)光液浸潤，凝膠成像系統(tǒng)曝光、拍照。使用Image J圖像分析軟件分析圖像的平均光密度，目的條帶光密度值/內(nèi)參條帶光密度值為目的蛋白的表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 4組大鼠氣道和肺組織形態(tài)變化比較 正常對照組大鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛少量粘連、無脫落，氣道平滑肌薄而均勻，無炎癥細(xì)胞浸潤，無腺體增生，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔均勻，無增厚，無肺泡融合。與正常對照組比較，模型組大鼠氣道上皮增厚，柱狀上皮細(xì)胞腫脹肥厚，纖毛粘連、倒伏、脫落，氣道平滑肌增厚，部分平滑肌被炎癥細(xì)胞破壞，黏膜下層炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁斷裂，肺泡塌陷、融合，肺泡間隔增厚，大量炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤。與模型組比較，補(bǔ)肺活血組與茶堿組氣道上皮完整，柱狀上皮排列規(guī)則，纖毛粘連、倒伏、脫落減輕，肺泡相對完整，肺泡壁變薄，肺泡間隔變小，肺泡融合減少，炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤減輕。見圖1。

圖1 4組大鼠氣道和肺組織病理變化比較(HE染色，10×40倍，標(biāo)尺示100 μm)

3.2 4組大鼠氣道膠原纖維沉積情況比較 對肺組織切片進(jìn)行Masson染色，膠原纖維著藍(lán)色，肌纖維、細(xì)胞漿、紅細(xì)胞著紅色。正常對照組氣道上皮與黏膜下層之間可見少量藍(lán)色膠原纖維、薄而均勻的肌纖維。與正常對照組比較，模型組可見大量藍(lán)色膠原纖維，著色明顯加深，部分紅色平滑肌被炎癥細(xì)胞破壞。與模型組比較，補(bǔ)肺活血組與茶堿組藍(lán)色膠原纖維明顯減少，紅色平滑肌薄而均勻。與正常對照組比較，模型組膠原沉積明顯增加；與模型組比較，補(bǔ)肺活血組與茶堿組膠原沉積明顯下降。見圖2、表1。

表1 4組大鼠氣道中膠原纖維沉積程度比較

注：A.正常對照組；B.模型組；C.補(bǔ)肺活血組；D.茶堿組

3.3 4組大鼠肺組織TGF-β1、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，TGF-β1、NE、α1-AT陽性產(chǎn)物在氣道上皮及肺間質(zhì)表達(dá)顯著，分布在細(xì)胞漿，呈棕黃色；MMP-9、TIMP-1陽性產(chǎn)物在肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞漿表達(dá)顯著，呈棕黃色。與正常對照組比較，模型組TGF-β1、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1陽性表達(dá)顯著增多；與模型組比較，補(bǔ)肺活血組與茶堿組TGF-β1、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1陽性表達(dá)明顯減少。見圖3。

圖3 4組大鼠肺組織TIMP-1、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍，標(biāo)尺示100 μm)

3.4 4組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2/3、Smad4、Smad7、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較 采用Western blot方法，以TGF-β1/GAPDH、Smad2/3/GAPDH、Smad4/GAPDH、Smad7/GAPDH作為TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)量化指標(biāo)，以NE/β-actin、α1-AT/GAPDH、MMP-9/GAPDH、TIMP-1/β-actin作為蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)相關(guān)量化指標(biāo)。與正常對照組比較，模型組TGF-β1、Smad2/3、Smad4、NE、α1-AT、MMP-9表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Smad7表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；TIMP-1表達(dá)水平呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，補(bǔ)肺活血組與茶堿組TGF-β1、Smad2/3、Smad4、NE、α1-AT、MMP-9表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Smad7表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；TIMP-1表達(dá)水平呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表2。

表2 各組大鼠肺組織氣道重塑相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

圖4 Western blot法檢測肺組織TGF-β1/Smad信號通路及蛋白酶與抗蛋白酶相關(guān)蛋白表達(dá)水平

4 討論

COPD氣道重塑主要發(fā)生在直徑小于2 mm的支氣管和細(xì)支氣管。其重要病理表現(xiàn)包括氣道黏膜上皮細(xì)胞增生肥厚、鱗狀細(xì)胞化生、杯狀細(xì)胞增生、纖毛異常、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基底膜增厚、黏液腺增生、氣道平滑肌增生肥大、氣道壁增厚、血管壁增厚，肺實質(zhì)可見肺泡壁破壞、肺泡腔擴(kuò)大、肺泡融合、呼吸性細(xì)支氣管破壞，小葉中央型肺氣腫形成等[7-8]。課題組前期研究使用香煙煙霧暴露復(fù)合氣道內(nèi)LPS滴注的聯(lián)合復(fù)制模型方式，經(jīng)肺功能測定及病理觀察，證實該方法復(fù)制的COPD大鼠模型符合人類COPD病理生理改變[9-10]。本研究采用課題組既往模型復(fù)制方式，通過病理染色發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織病理表現(xiàn)符合COPD氣道重塑病理改變。

在香煙煙霧及其他有害物刺激下，TGF-β1由氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等合成、釋放，進(jìn)而激活TGF-β1/Smads信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化、組織損傷與修復(fù)[11]。TGF-β1與Ⅱ型受體(TβRⅡ)結(jié)合，促進(jìn)Ⅰ型受體(TβRⅠ)磷酸化及活化，進(jìn)而活化、磷酸化下游Smad2、Smad3蛋白，再與Smad4結(jié)合形成Smad2/3/4蛋白復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核。復(fù)合物在核內(nèi)通過轉(zhuǎn)錄因子作用，參與靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Smad7可通過競爭性地與活化的TβR結(jié)合，阻斷Smad2活化、磷酸化，逆向調(diào)控TGF-β1信號。此外，在香煙煙霧刺激下，肺內(nèi)的炎癥細(xì)胞活化、聚集，誘導(dǎo)NE、基質(zhì)金屬蛋白酶釋放[12-13]，同時，α1-AT、TIMP-1等蛋白酶抑制劑分泌，抑制蛋白酶水解，促進(jìn)組織重塑。當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿o法抵制蛋白酶水解時，細(xì)胞外基質(zhì)過度水解，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔擴(kuò)大，肺泡消融，肺氣腫形成[14]。研究[15-16]表明，NE與α1-AT、MMP-9與TIMP-1導(dǎo)致的蛋白酶與抗蛋白酶失衡，是調(diào)控COPD模型大鼠氣道重塑的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2/3、Smad4、NE、α1-AT、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)水平升高，Smad7表達(dá)水平降低，表明香煙煙霧通過激活TGF-β1/Smads信號通路，誘導(dǎo)NE與α1-AT、MMP-9與TIMP-1失衡，從而導(dǎo)致COPD氣道重塑。

COPD屬于中醫(yī)“肺脹”范疇[17]，病位首先在肺，日久延及脾腎。肺主氣，司呼吸；脾主運(yùn)化，主統(tǒng)血；腎主水，主納氣。肺脾腎三臟虧虛，則氣血運(yùn)行失常?！皻獠恍袆t血?！保把焕麆t為水”，氣血運(yùn)行障礙，則津液代謝失常。COPD以肺脾腎臟虧虛為本，以氣滯、痰濁、血瘀為標(biāo)，痰瘀互結(jié)、閉郁肺絡(luò)為疾病難愈的關(guān)鍵[18-19]。補(bǔ)肺活血膠囊由黃芪、補(bǔ)骨脂、赤芍3味中藥組成。其中，黃芪補(bǔ)脾肺氣、固表；補(bǔ)骨脂補(bǔ)脾固腎，脾為肺之母，腎為肺之子，脾腎得固，則肺氣充盛，宣降有權(quán)，腎氣充實，攝納、蒸化復(fù)常；赤芍活血祛瘀，行血中之滯，促進(jìn)血脈通調(diào)。三藥配伍，標(biāo)本兼顧，共奏補(bǔ)肺健脾固腎、益氣活血、扶正祛邪之功[20]。補(bǔ)肺活血膠囊通過調(diào)節(jié)肺脾腎三臟功能，促進(jìn)氣血運(yùn)行，改善津液代謝，恢復(fù)氣機(jī)升降，臟虛得補(bǔ)、痰瘀得化、宣降復(fù)常，疾病乃愈。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)肺活血膠囊能夠抑制氣道膠原沉積，改善COPD模型大鼠氣道重塑，其作用可能是通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平及調(diào)節(jié)蛋白酶與抗蛋白酶平衡實現(xiàn)的。