不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）中酚類成分差異及其對體外抗氧化能力的影響

馬冰凇，王佳菜，徐成成，任小盈，馬存強(qiáng),3*，周斌星*

不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）中酚類成分差異及其對體外抗氧化能力的影響

馬冰凇1，王佳菜1，徐成成1，任小盈2，馬存強(qiáng)1,3*，周斌星1*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 聊城高級財(cái)經(jīng)職業(yè)學(xué)校，山東 聊城 252000；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430073

為探究普洱茶倉儲(chǔ)陳化過程中酚類物質(zhì)等品質(zhì)成分變化及其對抗氧化能力的影響，采用高效液相色譜（HPLC）等方法對6個(gè)系列3個(gè)不同倉儲(chǔ)期共18款普洱茶（生茶）中的17種酚類化合物、3種嘌呤堿等品質(zhì)成分進(jìn)行定量檢測。并對普洱茶（生茶）的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力等體外抗氧化能力進(jìn)行了測定。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，結(jié)合感官審評結(jié)果可基本實(shí)現(xiàn)倉儲(chǔ)陳化過程中普洱茶（生茶）新茶和老茶的判別。單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，普洱茶倉儲(chǔ)陳化過程中7種兒茶素含量極顯著（<0.01）降低，而鞣花酸、槲皮素、木犀草素和山奈酚等黃酮類化合物含量極顯著（<0.01）增加。與普洱茶（生茶）陳茶和老茶相比，普洱茶（生茶）新茶的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力最高，而超氧陰離子自由基清除能力最低。雙變量相關(guān)性分析揭示兒茶素（C）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等兒茶素類物質(zhì)是影響普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力的主要酚類成分。

普洱茶（生茶）；倉儲(chǔ)陳化；抗氧化；兒茶素

普洱茶是以云南大葉種（var.）曬青綠茶為原料，采用特定加工工藝制成的地理標(biāo)志性產(chǎn)品。按其加工工藝和品質(zhì)特征可分為普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）[1]。在普洱茶倉儲(chǔ)陳化過程中，受到倉儲(chǔ)環(huán)境及其分布的微生物群落等因素影響，在微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用下，普洱茶中的酚類、氨基酸、可溶性糖等品質(zhì)成分發(fā)生深刻變化[2-4]。現(xiàn)已在普洱茶倉儲(chǔ)陳化過程中檢出多種細(xì)菌、放線菌和真菌菌群[5-6]。特別是和等曲霉屬真菌，對普洱茶倉儲(chǔ)陳化和渥堆發(fā)酵中的酚類成分代謝均有一定影響[4,7]。

Zhou等[8]采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）等方法對連續(xù)0～10?a陳化期內(nèi)普洱茶（生茶）中的酚類、嘌呤堿、游離氨基酸等品質(zhì)成分進(jìn)行檢測分析，揭示了普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中品質(zhì)成分的階段性變化，并將倉儲(chǔ)陳化中的普洱茶分為新茶（2?a內(nèi)）、陳茶（3～7?a）和老茶（8?a以上）。前人研究顯示，茶葉中兒茶素類、黃酮類、酚酸類等酚類成分含量與抗氧化能力存在顯著正相關(guān)（<0.05）[9-11]。(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechingallate，EGCG）被認(rèn)為是茶葉中主要抗氧化成分之一[11]。然而，普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中酚類成分變化對其抗氧化能力的影響尚不明確。

本研究采用HPLC等方法對6個(gè)系列3個(gè)不同倉儲(chǔ)期共18款普洱茶（生茶）中的17種酚類化合物和3種嘌呤堿等活性成分，以及茶多酚總量、可溶性糖、游離氨基酸、總黃酮等品質(zhì)成分進(jìn)行定量檢測；分析檢測普洱茶（生茶）的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力等體外抗氧化能力；采用相關(guān)性分析方法探究普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中酚類等品質(zhì)成分變化對其抗氧化能力的影響。本研究旨在揭示普洱茶（生茶）新茶、陳茶和老茶的酚類成分、抗氧化能力差異和品質(zhì)特征，為倉儲(chǔ)陳化中普洱茶（生茶）的分類研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

6個(gè)系列3個(gè)不同倉儲(chǔ)期的18款普洱茶（生茶）樣品信息見表1。參照Zhou等[8]的研究結(jié)果，根據(jù)倉儲(chǔ)陳化期長短，將同一系列的普洱茶（生茶）分為新茶、陳茶和老茶。2019年至2020年加工生產(chǎn)的倉儲(chǔ)陳化期在2?a內(nèi)的普洱茶（生茶）為新茶，共6款，編號分別為DZ-X1、LC-X2、FP-X3、YW-X4、MZ-X5和SY-X6；2013年至2017年加工生產(chǎn)的倉儲(chǔ)期為3～7?a的普洱茶（生茶）為陳茶，共6款，編號分別為DZ-C1、LC-C2、FP-C3、YW-C4、MZ-C5和SY-C6；2006年至2011年加工生產(chǎn)的倉儲(chǔ)陳化期在8?a以上的普洱茶（生茶）為老茶，共6款，編號分別為DZ-L1、LC-L2、FP-L3、YW-L4、MZ-L5和SY-L6。茶葉樣品收集完成后，自封袋密封，–20℃環(huán)境下保存。在相同條件下，進(jìn)行茶樣的研磨、浸提、檢測等操作。

(+)-兒茶素（Catechin，C）、(+)-沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、(-)-表兒茶素（Epicatechin，EC）、(-)-表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、(-)-兒茶素沒食子酸酯（Catechin galllate，CG）、(-)-表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、EGCG、沒食子酸、鞣花酸、水解單寧（1,4,6-三--沒食子酰基---葡萄糖，1,4,6-tri--galloyl---glucose，GG）等酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），槲皮素、山奈酚、楊梅素、蘆丁、花旗松素、木犀草素等6個(gè)黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），購自成都曼斯特生物科技有限公司；咖啡堿、可可堿、茶堿等3個(gè)嘌呤堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）以及2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪（TPTZ）、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2,2'-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）、奎諾二甲基丙烯酸酯（Trolox）等試劑，購自美國Sigma-Aldrich公司；LC-MS級甲醇、乙腈，購自美國Thermo Fisher公司。

Heraeus Fresco17高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；JXFSTPRP-24研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；SCQ-Y300A超聲波恒溫水浴（上海聲彥超聲波儀器公司）；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）；1200型HPLC儀（美國Agilent公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要品質(zhì)成分分析

參照GB 5009.3—2016進(jìn)行茶葉中水分的測定。參照GB/T 8313—2018，以沒食子酸為參照，采用765?nm波長下的福林酚比色法測定普洱茶（生茶）中的茶多酚含量。以蔗糖為參照，采用蒽醌試劑在620?nm波長下進(jìn)行普洱茶（生茶）中可溶性糖總量的測定[12]。游離氨基酸總量測定采用茚三酮比色法，以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液在570?nm波長下測定[13]。總黃酮含量以蘆丁為參照，采用415?nm波長下的三氯化鋁比色法進(jìn)行測定[14]。

1.2.2 茶湯浸提

18款普洱茶（生茶）茶樣經(jīng)研磨儀研磨，40目篩網(wǎng)篩分后，–20℃保存?zhèn)溆?。稱取1.0?g茶葉研磨樣品，加入40?mL甲醇和4?mL鹽酸于圓底燒瓶85℃回流浸提90?min，冷卻過濾后，通過甲醇定容至50?mL[15]。0.45?μm尼龍濾膜過濾后用于HPLC檢測。

表1 18款普洱茶（生茶）信息表

注：同一系列為同一公司采用統(tǒng)一配方、產(chǎn)地曬青綠茶加工而成的不同倉儲(chǔ)期的普洱茶（生茶）

Note: Puer raw teas of the same series were provided by the same tea company with the sun-dried green tea-leaves of uniform formula/production place

1.2.3 酚類化合物和嘌呤堿的HPLC定量檢測

采用Agilent 1200型HPLC儀連接Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（100?mm×4.6?mm，2.7?μm）和Agilent C18保護(hù)柱（10?mm×4.6?mm，5?μm）對18個(gè)普洱茶（生茶）樣品中的8種兒茶素、6種黃酮類、2種酚酸、水解單寧、3種嘌呤堿等活性成分進(jìn)行定量檢測[15-16]。流動(dòng)相A為0.261%磷酸、5%乙腈，流動(dòng)相B為80%甲醇；洗脫梯度程序：0?min，A相為90%，B相為10%；10?min，A相線性減少至55%，B相線性增加至45%；22?min，A相線性減少至35%，B相線性增加至65%；25.9?min，A相線性減少至0%，B相線性增加至100%；29?min，A相保持為0%，B相保持為100%；30?min，A相線性增加至90%，B相線性減少至10%；36?min，A相保持為90%，B相保持為10%。流速為0.8?mL·min-1[16]。柱溫為30℃；0～20?min檢測波長為280?nm；20～36?min檢測波長為360?nm；進(jìn)樣體積為2?μL[16]。采用內(nèi)標(biāo)法協(xié)助普洱茶（生茶）中生物活性成分的識別，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線完成普洱茶（生茶）中酚類化合物和嘌呤堿含量的定量分析。

1.2.4體外抗氧化能力測定

鐵離子還原/抗氧化能力測定：0.05?g普洱茶（生茶）樣品與1?mL 80%乙醇混合。在60℃，200～300?W條件下，超聲波提取30?min后，12?000?r·min-1離心10?min，取上清液。以抗氧化劑Trolox為參照，在590?nm波長下采用微板法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線：1=0.097?21+0.004?2（2=0.999?7）進(jìn)行鐵離子還原/抗氧化能力的測定（1為Trolox物質(zhì)的量，nmol；1為OD590）。

DPPH自由基清除能力測定：0.05?g普洱茶（生茶）樣品與1?mL 80%甲醇提取液混合，冰浴勻漿后，12?000?r·min-1離心10?min，取上清液。以抗氧化劑Trolox為參照，采用517?nm波長下的微板法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線2=2.848?62+0.708?4（2=0.999?1）進(jìn)行DPPH自由基清除能力的測定（2為Trolox的濃度，μg·mL-1；2為DPPH自由基清除率，%）。

ABTS自由基清除能力測定：0.05?g普洱茶（生茶）樣品與1?mL 80%甲醇提取液混合，冰浴勻漿后，12?000?r·min-1離心10?min，取上清液。以抗氧化劑Trolox為參照，采用734?nm波長下的微板法，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線3=0.504?23-1.421?3（2=0.997?1）進(jìn)行ABTS自由基清除能力的檢測（3為Trolox的濃度，μg·mL-1；3為ABTS自由基清除率，%）。

羥自由基清除能力測定：取0.1?g普洱茶（生茶）樣品與1?mL蒸餾水混合，進(jìn)行冰浴勻漿。12?000?r·min-1離心10?min后，取上清液。采用微板法在510?nm下的吸光度，按照如下公式進(jìn)行羥自由基清除能力的測定：羥自由基清除率=[空白-(測定-對照)]÷空白×100%。

超氧陰離子自由基清除能力測定：取0.1?g普洱茶（生茶）樣品與1?mL提取液混合，進(jìn)行冰浴勻漿。12?000?r·min-1離心10?min后，采用微板法在570?nm波長下對普洱茶（生茶）樣上清液的超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行測定。計(jì)算公式如下：超氧陰離子清除率=(對照-測定)÷(對照-空白)×100%。

1.2.5 感官審評方法

參照GB/T 18797—2012、GB/T 23776—2018和GB/T 14487—2017對18款普洱茶（生茶）緊壓茶進(jìn)行感官審評，依次評判茶葉的外形、湯色、香氣、滋味和葉底，分析總結(jié)新茶、陳茶、老茶等3組不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的品質(zhì)特征。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果分析

2.1 倉儲(chǔ)陳化中普洱茶（生茶）的分組比較

如圖1所示，在18款普洱茶（生茶）中均能檢出8種兒茶素、2種酚酸、水解單寧、4種黃酮類（蘆丁、花旗松素、楊梅素和木犀草素）以及2種嘌呤堿（咖啡堿和可可堿）。由于茶堿和山奈酚含量較低，受檢測技術(shù)條件限制，在部分茶樣中未能檢出。此外，受茶樹品種、加工工藝、倉儲(chǔ)陳化時(shí)間等因素的影響，不同普洱茶（生茶）中槲皮素含量存在較大差異，在部分茶樣中未能檢出，而某些茶樣中槲皮素含量高達(dá)0.43?mg·g-1。基于20種活性成分和4種主要品質(zhì)成分的PCA（圖2-A）和OPLS-DA（圖2-B）均能用于不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）分組的判別分析。在PCA中，PC1和PC2分別解釋了總方差的35.2%和15.7%，將倉儲(chǔ)陳化中的普洱茶（生茶）基本分為新茶、陳茶和老茶3組；由于原料以及倉儲(chǔ)環(huán)境的差異，部分陳茶茶樣與新茶或老茶有所重疊（圖2-A）。OPLS-DA顯示，普洱茶（生茶）陳茶在品質(zhì)成分上更接近于普洱茶（生茶）老茶，與普洱茶（生茶）新茶存在顯著差異。OPLS-DA（2=0.690，2=0.549，<0.001）模型能較好地應(yīng)用于倉儲(chǔ)陳化中普洱茶（生茶）分組的判別分析。

圖1 20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品以及18個(gè)茶樣的高效液相色譜圖

感官審評結(jié)果如表2所示，顯示了普洱茶（生茶）新茶、陳茶、老茶的品質(zhì)特征。不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）在湯色、香氣、滋味、葉底等方面存在顯著差異。普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中茶葉色澤由墨綠色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?；湯色由黃綠、綠黃向橙紅、棕黃和栗紅轉(zhuǎn)變；清香逐漸消退，陳香逐漸顯露；苦澀鮮醇味減退，向甜醇轉(zhuǎn)變；葉底也由新茶的肥厚黃綠轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗪帧ⅫS褐，在老茶中部分茶梗出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象。通過感官審評的品質(zhì)特征基本可區(qū)分新茶和老茶。高溫高濕的倉儲(chǔ)環(huán)境在一定程度上促進(jìn)普洱茶（生茶）的陳化[4,8]，廣州等地倉儲(chǔ)的普洱茶（生茶）陳茶外形、湯色、葉底更接近于老茶，然而在香氣和滋味上與昆明等地倉儲(chǔ)的普洱茶（生茶）老茶有一定差異。因此，根據(jù)不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的品質(zhì)特征可將倉儲(chǔ)陳化中的普洱茶（生茶）分為新茶、陳茶和老茶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)倉儲(chǔ)環(huán)境等因素對普洱茶陳化品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生影響。

2.2 不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的單因素方差分析

單因素方差分析顯示（表3），除CG、蘆丁、水解單寧、咖啡堿和可可堿在<0.05水平無顯著差異，可溶性糖、楊梅素和木犀草素在<0.01水平無顯著差異外，不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）中的其他7種兒茶素、黃酮類、酚酸、氨基酸等品質(zhì)成分均存在極顯著差異（<0.01）。與普洱茶（生茶）新茶相比，普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中茶多酚、游離氨基酸均極顯著降低（<0.01），而黃酮總量和沒食子酸含量極顯著增加（<0.01），這在一定程度上與Zhou等[8]和Xu等[4]研究結(jié)果相符。相對而言，咖啡堿、可可堿等嘌呤堿含量保持穩(wěn)定，在<0.01水平無顯著差異，這與Xu等[4]發(fā)現(xiàn)普洱茶倉儲(chǔ)陳化中咖啡堿呈降低趨勢不符。與普洱茶（生茶）新茶相比，普洱茶（生茶）老茶中酯型、非酯型兒茶素的降幅分別為31.56%和49.00%，而普洱茶渥堆發(fā)酵中酯型、非酯型兒茶素降幅均在75%以上，這主要與倉儲(chǔ)陳化過程中微生物代謝強(qiáng)度較弱有關(guān)。

圖2 不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的主成分分析（A）和正交偏最小二乘法-判別分析（B）

表2 不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的品質(zhì)特征

表3 不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）中的酚類、嘌呤堿等品質(zhì)成分含量及其差異

注：兒茶素總量為C、EC、GC、EGC、ECG、GCG、EGCG和CG等8種兒茶素含量的總和；酯型兒茶素含量為ECG、GCG、EGCG和CG等4種酯型兒茶素含量的總和；非酯型兒茶素含量為C、EC、GC和EGC等4種非酯型兒茶素含量的總和。下同。采用Tukey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析。同一行不同小寫字母表示在<0.05水平存在顯著性差異；不同大寫字母表示在<0.01水平存在極顯著性差異

Note: The total catechins were the summation of C, EC, EGC, GC, ECG, GCG, EGCG and CG contents. The total ester catechins were the summation of ECG, GCG, EGCG and CG contents. The total non-ester catechins were the summation of C, EC, GC and EGC contents. The same below. One way ANOVA was carried out by Tukey HSD test. The different lowercase letters in the same line represent significant differences at<0.05 level, while the different uppercase letters in same line represent highly significant differences at<0.01 level

本研究發(fā)現(xiàn)2種酚酸和6種黃酮類化合物在普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中或保持穩(wěn)定（>0.01），或呈極顯著（<0.01）增加趨勢。在一定倉儲(chǔ)陳化期內(nèi)，普洱茶（生茶）中GCG、沒食子酸、花旗松素和茶堿均呈先增加后減少的變化趨勢，而鞣花酸、槲皮素、木犀草素和山奈酚含量在倉儲(chǔ)陳化過程中呈增加趨勢，在老茶中含量最高。這與普洱茶渥堆發(fā)酵中酚酸、黃酮類等酚類成分變化趨勢存在一定差異。在普洱茶渥堆發(fā)酵中，EGCG等兒茶素顯著降低[17-18]，酚酸[19]和黃酮類[20]等酚類化合物均呈先增加后減少的變化趨勢[21]。相反，作為主要的8-C N-乙基-2吡咯烷酮取代的黃烷-3-醇類，普洱茶素在普洱茶渥堆發(fā)酵初期顯著增加[20-22]。單菌株真菌發(fā)酵揭示兒茶素和茶氨酸為普洱茶素（Puerins Ⅰ-Ⅷ）生物合成的前體物質(zhì)[23]。普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中，C、EC、GC、EGC、ECG、GCG和EGCG等7種兒茶素以及游離氨基酸和可溶性糖含量顯著（<0.05）或極顯著（<0.01）降低，這與普洱茶渥堆發(fā)酵過程中的變化趨勢基本一致[17-18]。在普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中普洱茶素的變化趨勢尚不明確，值得借助靶標(biāo)、非靶標(biāo)代謝組學(xué)等現(xiàn)代研究手段進(jìn)一步探究。

2.3 不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的體外抗氧化能力差異

如圖3所示，本研究分別測定了不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力。結(jié)果表明，不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力存在極顯著差異（<0.01），而羥基自由基清除能力保持相對穩(wěn)定，無顯著變化（>0.05）。單因素方差分析顯示，普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中，鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力極顯著降低（<0.01），而超氧陰離子自由基清除能力極顯著增加（<0.01）。相對而言，普洱茶（生茶）新茶的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力最強(qiáng)，而老茶的超氧陰離子自由基清除能力較強(qiáng)。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力與兒茶素、黃酮類等酚類成分含量呈正相關(guān)。倉儲(chǔ)陳化中酚類成分變化在一定程度上影響了普洱茶（生茶）的鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力。而羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力受倉儲(chǔ)陳化過程中酚類成分變化的影響較小。

注：DPPH表示DPPH自由基清除能力測定法；ABTS表示ABTS自由基清除能力測定法；HSA表示羥基自由基清除能力測定法；SSA表示超氧陰離子自由基清除能力測定法。不同小寫字母表示在P<0.05水平存在顯著性差異；不同大寫字母表示在P<0.01水平存在極顯著性差異

2.4 酚類成分對普洱茶（生茶）抗氧化能力的影響

研究表明，茶葉微生物發(fā)酵過程中沒食子酸和山奈酚含量的累積有助于其抗氧化能力的提升[22-23,25-26]。本研究結(jié)果顯示（圖4），鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力之間存在極顯著（<0.01）正相關(guān)，而鐵離子還原/抗氧化能力與超氧陰離子自由基清除能力存在顯著（<0.05）負(fù)相關(guān)。C、GC、EGC、ECG和EGCG等兒茶素與鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力等抗氧化能力存在顯著（<0.05）或極顯著（<0.01）正相關(guān)，而槲皮素、木犀草素和山奈酚等黃酮類化合物與鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力存在顯著（<0.05）或極顯著（<0.01）負(fù)相關(guān)。由此可知，兒茶素類、黃酮類等酚類化合物對倉儲(chǔ)陳化過程中普洱茶（生茶）抗氧化能力的影響存在一定差異。沒食子酸在一定程度上能顯著（<0.05）提高倉儲(chǔ)陳化中普洱茶（生茶）的羥基自由基清除能力，而對鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力無顯著（>0.05）影響。整體來說，C、GC、EGC、ECG和EGCG等兒茶素為影響倉儲(chǔ)陳化過程中普洱茶（生茶）鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力的主要酚類成分。本研究僅發(fā)現(xiàn)GCG、沒食子酸、GC、可可堿和茶堿對普洱茶（生茶）的羥基自由基清除能力或超氧陰離子自由基清除能力存在一定影響。

注：FRAP，鐵離子還原/抗氧化能力；DPPH，DPPH自由基清除能力；ABTS，ABTS自由基清除能力；HSA，羥自由基清除能力；SSA，超氧陰離子自由基清除能力。*表明在P<0.05水平存在顯著相關(guān)性；**表明在P<0.01水平存在極顯著相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

普洱茶的倉儲(chǔ)陳化受溫度、濕度、氧氣、光照等環(huán)境因素以及微生物代謝強(qiáng)度的綜合影響[27-28]，很難根據(jù)香氣組分[29-30]或品質(zhì)成分[3]完成倉儲(chǔ)陳化時(shí)間的判定。本課題組前期提出的倉儲(chǔ)陳化中普洱茶（生茶）新茶、陳茶、老茶的分類法同樣受到茶葉原料和倉儲(chǔ)環(huán)境等因素的影響[8]。本研究采用HPLC和紫外-可見分光光度計(jì)法，對6個(gè)系列3個(gè)不同倉儲(chǔ)期的18款普洱茶（生茶）樣品中的兒茶素、黃酮類、酚酸和嘌呤堿等活性成分以及茶多酚總量、可溶性糖、游離氨基酸和黃酮總量等主要品質(zhì)成分進(jìn)行定量測定。PCA和OPLS-DA可實(shí)現(xiàn)倉儲(chǔ)陳化過程中普洱茶（生茶）分組的判別分析，感官審評揭示了普洱茶（生茶）新茶、陳茶和老茶的品質(zhì)特征，基于普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中酚類成分變化與滋味差異，普洱茶（生茶）可按照倉儲(chǔ)時(shí)間分為新茶、陳茶和老茶3組。

單因素方差分析顯示，普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中除CG、蘆丁、水解單寧、咖啡堿和可可堿無顯著變化外，其他7種兒茶素含量均極顯著降低（<0.01），沒食子酸、花旗松素和茶堿呈先增加后減少的變化趨勢，而鞣花酸、槲皮素、木犀草素和山奈酚等黃酮類化合物含量極顯著增加（<0.01）。體外抗氧化能力分析顯示，普洱茶（生茶）倉儲(chǔ)陳化過程中，鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力極顯著降低（<0.01），超氧陰離子自由基清除能力極顯著增加（<0.01），而羥自由基清除能力保持基本穩(wěn)定（>0.05）。雙變量相關(guān)性分析揭示C、GC、EGC、ECG和EGCG等兒茶素為影響倉儲(chǔ)陳化中普洱茶（生茶）鐵離子還原/抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力等抗氧化能力的主要酚類成分。

本研究借助HPLC等方法初步探明了不同倉儲(chǔ)期普洱茶（生茶）中的酚類成分和抗氧化能力差異，以及酚類成分變化對體外抗氧化能力的影響，為倉儲(chǔ)陳化過程中普洱茶（生茶）的分類比較提供了科學(xué)依據(jù)。

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Differences of Phenolic Components in Puer Raw Tea with Various Storage Periods and Their Effects on theAntioxidant Capacities

MA Bingsong1, WANG Jiacai1, XU Chengcheng1, REN Xiaoying2, A Cunqiang1,3*, ZHOU Binxing1*

1. Longrun Pu-erh Tea College, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Liaocheng Senior Financial Vocational School, Liaocheng 252000, China; 3. College of Horticulture and Forestry, Huazhong Agricutural University, Wuhan 430073, China

To explore the changes of phenolic compounds and other quality components and their influences on antioxidant abilities during the storage and aging of puer tea, contents of 17 phenolic compounds, 3 purine alkaloids and other quality components in 18 puer tea samples of 6 series with 3 different storage periods were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and other methods. Additionally,antioxidant abilities including ferric ion reducing antioxidant power (FRAP), DPPH scavenging ability (DPPH), ABTS free radical scavenging capacity (ABTS), hydroxyl radical scavenging ability (HSA) and superoxide anion radical scavenging ability (SSA) were determined in all puer raw teas. Combined with sensory evaluation results, multivariate statistical analyses includingprincipal component analysis (PCA) and orthogonal partial least square-discriminate analysis (OPLS-DA) were used to realize the discrimination between new and aged tea during the storage.One-way analysis of variance (ANOVA) showed 7 catechins were highly significantly (<0.01) decreased, while ellagic acid and flavonoids like quercetin, luteolin and kaempferol levels were also highly significantly (<0.01) increased during the storage and aging. And, new puer tea had the highest FRAP, DPPH, ABTS, but the lowest SSA compared with the aging and aged puer teas. Bivariate correlation analysis revealed that the catechins including catechin (C), gallocatechin (GC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG) and epigallocatechin gallate (EGCG) impacted FRAP, DPPH and ABTS of puer raw tea during the storage and aging.

puer raw tea, storage and aging, antioxidants, catechins

S571.1

A

1000-369X(2022)01-051-12

2021-06-04

2021-09-29

國家自然科學(xué)基金（31960617）

馬冰凇，男，碩士研究生，主要從事普洱茶加工與微生物發(fā)酵研究。*通信作者：macunqiang1208@aliyun.com；bxzhou01@126.com

（責(zé)任編輯：黃晨）