氧化石墨烯對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

劉 頓， 呂月玲， 駱 漢

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所， 陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

納米材料一般指結(jié)構(gòu)單元尺寸為1～100 nm的材料，由于其具有一系列新的不同于宏觀物質(zhì)的小尺寸效應(yīng)、界面效應(yīng)、量子效應(yīng)等，是材料科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。納米材料氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯的衍生物，是單層碳原子以sp2雜化方式形成的二維結(jié)構(gòu)。與石墨烯不同的是，氧化石墨烯表面含有大量羥基、羧基等含氧基團(tuán)，使得GO比石墨烯具有更大的比表面積和易修飾性。更為重要的是，氧化石墨烯的細(xì)胞親和性優(yōu)于石墨烯，從而在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用更為廣泛[5]。但是，隨著越來(lái)越多氧化石墨烯被應(yīng)用生活，氧化石墨烯對(duì)生物造成的影響引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，一些針對(duì)氧化石墨烯對(duì)植物生長(zhǎng)影響的研究已經(jīng)開(kāi)展。李婷等[6]用25～100 mg/kg氧化石墨烯處理油菜，發(fā)現(xiàn)油菜根長(zhǎng)縮短，經(jīng)過(guò)50～100 mg/kg氧化石墨烯處理的油菜鮮根重顯著下降。但氧化石墨烯對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

王偉等[7]研究指出，經(jīng)過(guò)低濃度氧化石墨烯處理的紫花苜蓿種子，相比于對(duì)照組種子萌發(fā)指數(shù)顯著提高。王曉靜等[8]認(rèn)為，經(jīng)過(guò)20%氧化石墨烯處理的高羊茅種子，其萌發(fā)率、萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)指數(shù)分別提高了6.3%、20.7%、31.6%；株高、地上干重顯著高于對(duì)照組。因此，氧化石墨烯對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響仍不明確，有待進(jìn)一步探討。

紫穗槐是豆科落葉灌木，高1～4 m，枝褐色，葉互生，原產(chǎn)于美國(guó)東部，引入我國(guó)后，中國(guó)東北、西北、華北地區(qū)均有種植。紫穗槐耐貧瘠，耐水濕和輕度鹽堿土，葉量大且營(yíng)養(yǎng)豐富，含大量粗蛋白、維生素等，是營(yíng)養(yǎng)豐富的飼料植物。此外紫穗槐郁閉度高，根系發(fā)達(dá)，側(cè)根較多，能截留大量降雨、固結(jié)土體，減少水土流失，在水土保持林草措施中被廣泛應(yīng)用。

為了進(jìn)一步明確氧化石墨烯對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，本試驗(yàn)以紫穗槐作為研究對(duì)象，對(duì)比經(jīng)過(guò)不同濃度氧化石墨烯溶液處理種子后紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)狀況，探究氧化石墨烯對(duì)紫穗槐生長(zhǎng)的影響，旨在揭示植物對(duì)納米材料的響應(yīng)以及可能存在的其他風(fēng)險(xiǎn)，為納米材料的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

氧化石墨烯為黑色粉末，平均厚度3.4～7 nm，片層直徑10～50 μm，層數(shù)5～10層，比表面積100～300 m2/g，純度>90%。供試種子為經(jīng)過(guò)挑選的籽粒飽滿的紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)種子，千粒重12 g。玻璃培養(yǎng)皿口徑為12 cm。芽苗移植后的生長(zhǎng)基質(zhì)是經(jīng)過(guò)過(guò)篩(1 mm)、消毒的河沙。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇紫穗槐種子1 000粒，放入配置好的3%H2O2溶液中浸泡48 h消毒，然后在流動(dòng)的無(wú)菌水下沖洗3次，陰干后將種子均分為6組放入蒸餾水沖洗過(guò)的干凈培養(yǎng)皿中，加入配置好的濃度分別為0、50、100、150、200、250 mg/L氧化石墨烯溶液，浸泡48 h。

另外準(zhǔn)備6組蒸餾水沖洗干凈的培養(yǎng)皿，每組3個(gè)共18個(gè)。在培養(yǎng)皿中先鋪一層脫脂棉，上面再鋪一層濾紙，加水使濾紙和脫脂棉充分濕潤(rùn)，作為發(fā)芽床。待種子在氧化石墨烯溶液中浸泡完畢后，從每組濃度處理的種子中挑選大小一致，長(zhǎng)勢(shì)均勻的150粒種子，均分為3組并分別放置于培養(yǎng)皿發(fā)芽床上。將所有的培養(yǎng)皿放入光照強(qiáng)度為2 000 lx，溫度26 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，觀察記錄種子發(fā)芽個(gè)數(shù)。

再準(zhǔn)備6個(gè)干凈培養(yǎng)皿作為幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)培養(yǎng)皿，對(duì)采集回來(lái)的河沙過(guò)1 mm篩，然后用托盤將所有過(guò)篩河沙裝入80 ℃烘箱中消毒5 h，將消毒完畢的河沙裝入培養(yǎng)皿中至培養(yǎng)皿深度的2/3處，用噴壺噴灑蒸餾水至濕潤(rùn)。發(fā)芽試驗(yàn)完成后，從每個(gè)濃度處理組的3個(gè)發(fā)芽床中選擇20株長(zhǎng)勢(shì)均勻的芽苗移栽入新的培養(yǎng)皿中。移栽時(shí)先用牙簽在培養(yǎng)基質(zhì)上扎個(gè)小穴，然后把芽苗幼根輕輕放入穴內(nèi)，再用濕沙將幼根埋好，并用手輕輕按壓，使幼根和基質(zhì)緊密接觸即可，每個(gè)新的培養(yǎng)皿中移栽20株。培養(yǎng)完畢后，觀察并測(cè)定各濃度處理下幼苗的苗高、地徑、生物量、根長(zhǎng)和根系表面積。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

本試驗(yàn)測(cè)定的種子萌發(fā)指標(biāo)包括發(fā)芽勢(shì)(GE)、發(fā)芽率(GP)和萌發(fā)指數(shù)(GI)。

發(fā)芽勢(shì)指在發(fā)芽過(guò)程中日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到高峰時(shí)，發(fā)芽的種子數(shù)占供測(cè)樣品種子數(shù)的百分率，一般以發(fā)芽試驗(yàn)規(guī)定期限的最初1/3期間內(nèi)的種子發(fā)芽數(shù)占供試種子數(shù)的百分比為標(biāo)準(zhǔn)。

GE(%)=(N1/N)×100% (1)

式中，N1代表從發(fā)芽試驗(yàn)開(kāi)始到第3天的發(fā)芽數(shù)；N代表供試種子總數(shù)。

發(fā)芽率指測(cè)試種子發(fā)芽數(shù)占測(cè)試種子總數(shù)的百分比，是檢測(cè)種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。

GP(%)=(N2/N)×100% (2)

式中，N2表示到發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)正常發(fā)芽的種子數(shù)；N表示供試種子總數(shù)。

萌發(fā)指數(shù)是發(fā)芽終期內(nèi)每天發(fā)芽粒數(shù)除以對(duì)應(yīng)天數(shù)的總和，用以表征種子活力，發(fā)芽指數(shù)越高，種子活力越高。

GI=∑Gt/Dt(3)

式中，Gt為時(shí)間t天時(shí)的發(fā)芽種子總數(shù)數(shù)值；Dt為萌發(fā)實(shí)驗(yàn)天數(shù)。

1.3.2幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，移栽入新的裝有消毒河沙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20 d，培養(yǎng)完畢后每盆隨機(jī)選取3株長(zhǎng)勢(shì)中等，大小均勻一致的幼苗，測(cè)量其平均株高。將所選幼苗取出，在流動(dòng)的蒸餾水下沖洗干凈后，80 ℃烘干至恒重，測(cè)量幼苗干重和地徑。隨后刈割，將根系放入WinRHIZO-2013 e根系分析儀中測(cè)量根長(zhǎng)和根系表面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)和生長(zhǎng)效應(yīng)評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)法。隸屬函數(shù)是模糊集合的數(shù)學(xué)工具，表示元素屬于某模糊集合的真實(shí)程度，在本文中用來(lái)表示氧化石墨烯對(duì)紫穗槐各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)的具體效果，計(jì)算公式如下：

式中，R(Xj)為隸屬函數(shù)值，Xj為第j個(gè)綜合指標(biāo)(j=1,2,3…)，Xmax、Xmin分別為第j個(gè)指標(biāo)的最大值和最小值。然后用各個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加和來(lái)計(jì)算綜合評(píng)定值，計(jì)算公式如下：

R(X)=∑R(Xj) (5)

式中，R(X)為各個(gè)濃度綜合評(píng)定值，R(Xj)為每個(gè)濃度下各個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化石墨烯對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)的影響

如表1所示，隨著氧化石墨烯溶液濃度升高，紫穗槐種子的發(fā)芽勢(shì)總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)使用50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L氧化石墨烯溶液處理種子時(shí)，紫穗槐種子的發(fā)芽勢(shì)為16.67%、28.00%、47.33%，均高于對(duì)照組種子萌發(fā)勢(shì)；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度繼續(xù)增大時(shí)，紫穗槐種子的發(fā)芽勢(shì)隨著溶液濃度的升高而持續(xù)降低。在所有處理組中，當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度在50～200 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，紫穗槐種子發(fā)芽率均顯著高于對(duì)照組；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度為250 mg/L時(shí)，經(jīng)處理的紫穗槐種子發(fā)芽勢(shì)為6.00%，低于對(duì)照組但并不顯著。通過(guò)對(duì)以上數(shù)據(jù)的分析，低濃度氧化石墨烯溶液(0～200 mg/L)對(duì)紫穗槐種子的萌發(fā)有顯著促進(jìn)作用，但濃度繼續(xù)增大時(shí)，紫穗槐種子的發(fā)芽勢(shì)情況需要進(jìn)一步研究。針對(duì)紫穗槐種子發(fā)芽率來(lái)說(shuō)，當(dāng)氧化石墨烯濃度在50～150 mg/L時(shí)，經(jīng)過(guò)處理的紫穗槐種子發(fā)芽率是84.00%、92.00%、93.33%，高于對(duì)照組70%的發(fā)芽率，且差異顯著；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度為200 mg/L，處理種子的發(fā)芽率為70%，與對(duì)照組相等；繼續(xù)增大到250 mg/L時(shí)，種子發(fā)芽率為52.67%，顯著低于對(duì)照組。結(jié)果表明，氧化石墨烯溶液濃度在50～150 mg/L范圍內(nèi)，對(duì)紫穗槐種子的發(fā)芽率有顯著促進(jìn)作用，當(dāng)濃度大于200 mg/L時(shí)，對(duì)發(fā)芽率抑制效果明顯。

表1 氧化石墨烯對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)的影響

紫穗槐種子萌發(fā)指數(shù)的情況與發(fā)芽勢(shì)大致相同，對(duì)照組的萌發(fā)指數(shù)為17.56%，當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度以50 mg/L增加到200 mg/L時(shí)，紫穗槐種子萌發(fā)指數(shù)分別是27.71%、42.93%、52.16%、23.11%，均顯著高于對(duì)照組；當(dāng)繼續(xù)增大到250 mg/L時(shí)，種子萌發(fā)指數(shù)為15.45%，略小于對(duì)照組的17.56%，但沒(méi)有顯著變化。

在3個(gè)種子萌發(fā)指標(biāo)均呈先增加后減小的變化趨勢(shì)。在濃度為150 mg/L時(shí)，各個(gè)指標(biāo)達(dá)到最大值，分別為47.33%、93.33%和52.16%；當(dāng)氧化石墨烯濃度繼續(xù)增大，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)均逐漸減小。氧化石墨烯溶液濃度增加至250 mg/L時(shí)，種子發(fā)芽勢(shì)和萌發(fā)指數(shù)下降至與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p<0.05)，而發(fā)芽率則顯著低于對(duì)照組。綜合以上結(jié)論，氧化石墨烯溶液對(duì)紫穗槐種子的影響可以概括為：低濃度時(shí)對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，隨著濃度的逐漸增大，促進(jìn)作用越來(lái)越不明顯，最后逐漸抑制種子萌發(fā)。

2.2 氧化石墨烯對(duì)紫穗槐幼苗株高、地徑和干重的影響

經(jīng)過(guò)100 mg/L、150 mg/L氧化石墨烯溶液處理過(guò)的紫穗槐幼苗的地徑分別為2.54 mm、2.20 mm，均高于對(duì)照組的幼苗地徑1.48 mm，并且差異顯著(圖1)；其余處理組的幼苗地徑與對(duì)照組差異不明顯，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，氧化石墨烯溶液在100～150 mg/L濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)紫穗槐幼苗地徑的增長(zhǎng)，隨著濃度的增加抑制效果并不明顯。

注：同列不同字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

對(duì)于紫穗槐幼苗干重來(lái)說(shuō)，當(dāng)氧化石墨烯濃度是50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L時(shí)，經(jīng)過(guò)處理的幼苗干重分別是0.363 g、0.539 g、0.407 g，均顯著高于對(duì)照組幼苗干重(0.311 g)，這說(shuō)明氧化石墨烯溶液濃度在50～150 mg/L之間時(shí)，氧化石墨烯可以促進(jìn)紫穗槐幼苗干重增加；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度為200 mg/L時(shí)，經(jīng)處理幼苗干重為0.294 g、與對(duì)照組差異不明顯；當(dāng)氧化石墨烯溶液濃度繼續(xù)增大到250 mg/L時(shí)，經(jīng)處理的紫穗槐幼苗干重為0.223 g，相比對(duì)照組顯著下降。

紫穗槐幼苗苗高隨氧化石墨烯溶液濃度增加而發(fā)生變化的情況與地徑基本一致，經(jīng)過(guò)50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L處理的紫穗槐幼苗苗高顯著高于對(duì)照組，分別是5.19 cm、6.23 cm、5.17 cm；當(dāng)溶液濃度進(jìn)一步增大為200 mg/L、250 mg/L時(shí)，幼苗苗高分別為4.33 cm、3.61 cm，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，用濃度為50～100 mg/L的氧化石墨烯溶液處理紫穗槐種子，種子發(fā)育成幼苗的苗高會(huì)有顯著增加。

幼苗的苗高、干重、地徑均隨著氧化石墨烯濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖2)。在氧化石墨烯濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)到峰值，分別為6.23 cm、5.39 cm、2.54 cm，比對(duì)照組分別提高了50.48%、73.31%和71.62%。經(jīng)過(guò)50 mg/L、100 mg/L和150 mg/L氧化石墨烯處理過(guò)的幼苗苗高、干重、地徑均顯著大于對(duì)照組(p<0.05)；當(dāng)氧化石墨烯濃度>150 mg/L時(shí)，幼苗的苗高、干重、地徑減小，與對(duì)照組差異不大(p>0.05)。其中當(dāng)氧化石墨烯濃度為250 mg/L時(shí)，幼苗干重顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。

2.3 氧化石墨烯對(duì)紫穗槐幼苗根長(zhǎng)、根系表面積的影響

由表2可以看出，根長(zhǎng)和根系表面積均隨氧化石墨烯濃度的增加呈先增加后減小的變化趨勢(shì)，均在濃度為100 mg/L時(shí)達(dá)到最大，分別為37.73 cm、3.59 cm。當(dāng)氧化石墨烯濃度大于100 mg/L時(shí)，其對(duì)根長(zhǎng)的促生長(zhǎng)作用逐漸減小，200 mg/L濃度時(shí)根長(zhǎng)已降至與對(duì)照組相似(p>0.05)。而當(dāng)濃度達(dá)到250mg/L時(shí)，氧化石墨烯表現(xiàn)出對(duì)根系生長(zhǎng)的抑制作用，根長(zhǎng)比對(duì)照組減小了6.2%(p<0.05)。對(duì)于根系表面積，氧化石墨烯濃度在200 mg/L時(shí)體現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)，根系表面積比對(duì)照組減小了11.0%。氧化石墨烯處理有明顯的低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

表2 氧化石墨烯對(duì)紫穗槐根系生長(zhǎng)的影響

2.4 氧化石墨烯對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)影響的評(píng)定

采用隸屬函數(shù)法就氧化石墨烯溶液對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響進(jìn)行評(píng)定。最終0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L氧化石墨烯溶液所得分?jǐn)?shù)分別為1.88、4.02、7.25、6.02、2.25、0，氧化石墨烯的影響排序?yàn)?00 mg/L>150 mg/L>50 mg/L>200 mg/L>250 mg/L(表3)。100 mg/L氧化石墨烯溶液對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)促進(jìn)效果最明顯，并且濃度范圍在50～200 mg/L時(shí)均有促進(jìn)作用，當(dāng)濃度增大到250 mg/L時(shí)，對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)會(huì)有抑制作用。

表3 隸屬函數(shù)分析

3 討 論

種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和萌發(fā)指數(shù)都具有隨著氧化石墨烯濃度增加，指標(biāo)數(shù)值呈先增大后減小的趨勢(shì)(表1)，均在150 mg/L時(shí)達(dá)到峰值。氧化石墨烯濃度在50～200 mg/L范圍內(nèi)時(shí)，有明顯的促進(jìn)作用。這與Zhang等[9]針對(duì)石墨烯對(duì)番茄種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)情況的研究結(jié)果相一致，石墨烯可以破壞種子表皮，加快種胚吸水，從而使其發(fā)芽速度加快。氧化石墨烯與石墨烯具有同樣鋒利的片層，可以破壞紫穗槐種子表皮的鞣質(zhì)，加快紫穗槐種子的吸水，從而提高紫穗槐種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)。

氧化石墨烯也可以顯著增加紫穗槐幼苗苗高、地徑和干重，并且出現(xiàn)低濃度氧化石墨烯促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象，指標(biāo)數(shù)值呈先增加后降低的現(xiàn)象(圖2)，這與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)納米材料處理的大豆、水稻、小麥、苜蓿和黃瓜均存在這一現(xiàn)象[10-13]，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是納米材料暴露可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞中活性氧化簇的產(chǎn)生，進(jìn)而引起一系列植物防御反應(yīng)，這些防御反應(yīng)主要表現(xiàn)為丙二醛含量升高，抗氧化酶活性改變，葉綠素水平降低和氧化應(yīng)激損傷等現(xiàn)象[14-17]。當(dāng)氧化石墨烯濃度超過(guò)某一閾值時(shí)，氧化脅迫加劇，對(duì)紫穗槐種子細(xì)胞造成不可逆的損傷，從而對(duì)以后的生長(zhǎng)造成負(fù)面影響。

本試驗(yàn)中，氧化石墨烯是通過(guò)浸泡種子的方式作用于植物，沒(méi)有直接接觸植物根系，對(duì)于經(jīng)過(guò)處理的種子發(fā)育成幼苗后依然出現(xiàn)低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)這一現(xiàn)象的原因，可能與種子細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)素有關(guān)。氧化石墨烯促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)制是其通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素和脫落酸的合成來(lái)影響植物的生長(zhǎng)[18-21]。本試驗(yàn)初期用氧化石墨烯溶液浸種時(shí)，滲透進(jìn)紫穗槐種子內(nèi)部的氧化石墨烯分子引起種子中植物激素的有機(jī)酸的含量變化，從而影響根系生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

氧化石墨烯溶液濃度在50～200 mg/L之間對(duì)紫穗槐種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)均起到促進(jìn)作用，且低濃度溶液的促進(jìn)作用更加顯著。隨著濃度的增高，促進(jìn)作用越來(lái)越弱，直至抑制生長(zhǎng)。隸屬函數(shù)分析結(jié)果表明，種子萌發(fā)最適宜的濃度為150 mg/L，幼苗生長(zhǎng)最適濃度為100 mg/L。綜合比較隸屬函數(shù)值R(100mg/L)>R(150 mg/L)后認(rèn)為，紫穗槐種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)最適濃度為100 mg/L。