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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討二妙散治療濕疹的作用機(jī)制※

    2022-02-22 12:07:26徐小港王鈺徐義峰章德林
    中醫(yī)藥通報(bào) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:蒼術(shù)濕疹靶點(diǎn)

    徐小港 王鈺 徐義峰 章德林

    濕疹(eczema)是一種臨床常見的炎癥性皮膚病,可侵及人體真皮淺層及表皮[1-2],以丘疹、糜爛、滲出及瘙癢為主要癥狀,具有對(duì)稱性、反復(fù)發(fā)作性、多形損害等特點(diǎn),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本病好發(fā)于嬰幼兒和青少年,調(diào)查顯示,1~7歲兒童濕疹的粗患病率為12.94%,與早產(chǎn)、被動(dòng)吸煙、營養(yǎng)不均衡等因素密切相關(guān)[3]。目前,西醫(yī)主要采用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、免疫調(diào)節(jié)劑等對(duì)癥治療,短期收效顯著,長期使用則易產(chǎn)生不良反應(yīng)和依賴性[4]。中醫(yī)藥則通過辨病、辨證、辨體結(jié)合的診療模式,以較好的臨床療效與安全性,為本病改善癥狀、預(yù)防復(fù)發(fā)提供了有益的參考[5]。

    二妙散由蒼術(shù)、黃柏組成,首載于元代旴江醫(yī)家危亦林所著的《世醫(yī)得效方》,原方名為蒼術(shù)散,后朱丹溪稱之為二妙散。其中,蒼術(shù)辛烈溫燥,可升可降,長于祛風(fēng)勝濕;黃柏苦寒沉降,善清下焦?jié)駸帷6幒嫌?,一溫一寒,并走于下,主治濕熱流注之筋骨疼痛、下部濕瘡、腳氣赤腫等。蒼術(shù)、黃柏配伍精良,方簡(jiǎn)效宏,是古今眾多醫(yī)家治療濕熱類疾病的核心藥組,被廣泛運(yùn)用于臨床各科。姚高升[6]以二妙散為基礎(chǔ)方隨證加減治療濕疹,收效顯著。王振剛等[7]運(yùn)用二妙散加味治療陰囊濕疹165例,總有效率達(dá)97.54%。可見,二妙散治療濕疹效果確切,但多集中于臨床研究,相關(guān)藥效成分及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明[8]。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)軟件等相融合的新興學(xué)科,其通過可視化技術(shù)、組學(xué)方法等展示疾病-靶點(diǎn)-藥物的多層次網(wǎng)絡(luò),尤其適合揭示中藥及復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的機(jī)理[9]。本文采用生物信息學(xué)分析方法,結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)[10],以二妙散入血活性成分為研究對(duì)象,分析其治療濕疹的作用靶點(diǎn)與信號(hào)通路,進(jìn)一步闡釋其臨床應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 二妙散藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/)收集并篩選二妙散中蒼術(shù)和黃柏的有效成分,設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%與類藥性(DL)≥0.18的2個(gè)藥物代謝動(dòng)力學(xué)(ADME)屬性值為篩選條件,獲取有效入血成分及其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn),并利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)的蛋白名統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為基因名。

    1.2 濕疹相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及共同靶點(diǎn)的Venny分析以“eczema”為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)和Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)檢索濕疹相關(guān)靶點(diǎn),運(yùn)用Excel去除重復(fù)靶基因。將藥物和疾病靶點(diǎn)上傳至Venny作圖平臺(tái)(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html),得到疾病與藥物的共同靶點(diǎn),即二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)。

    1.3 二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治鰧?.2所得的潛在作用靶點(diǎn)在EXCEL中進(jìn)行反向篩選,獲得相應(yīng)的活性化合物,采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò),并運(yùn)用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析,以度(Degree)值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出重要的成分,Degree值越大,則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。

    1.4 二妙散成分-濕疹靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鰧?.2所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/),得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù),將PPI數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行圖像優(yōu)化,并運(yùn)用其中Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),以Degree值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出重要的靶點(diǎn),Degree值越大,則該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中就越重要。

    1.5 二妙散成分-濕疹功能富集分析和KEGG通路富集分析將1.2所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://www.david.ncifcrf.gov/),“Select Identifier”設(shè)置為“OFFICIAL GENE SYMBOL”,“Select species”設(shè)置為“Homo sapiens”,設(shè)定P<0.05,實(shí)現(xiàn)功能富集分析和KEGG通路富集分析。

    1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證為驗(yàn)證篩選出的二妙散治療濕疹潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性,將1.3所得Degree值前10的核心活性成分與1.4所得的6個(gè)度值較高的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性成分的3D分子結(jié)構(gòu),從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)。采用PyMOL、Autoduck軟件對(duì)活性成分與靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行脫水(輸出pdb格式)、預(yù)處理(輸出pdbqt格式),最后進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接的最低標(biāo)準(zhǔn)為結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol。對(duì)接完成后,將對(duì)接結(jié)果用熱圖展示,對(duì)接圖像運(yùn)用Pymol、Discovery Studio 2016軟件進(jìn)行輸出優(yōu)化。

    2 結(jié)果

    2.1 二妙散的活性成分及其靶點(diǎn)TCMSP數(shù)據(jù)庫得到蒼術(shù)、黃柏的活性成分共189個(gè),篩選后共確定46個(gè),去除無相關(guān)靶點(diǎn)的活性成分,最終保留29個(gè)活性成分,其中,蒼術(shù)4個(gè),黃柏25個(gè),見圖1、表1。收集活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn),其中蒼術(shù)93個(gè),黃柏287個(gè),去除重復(fù)靶點(diǎn)后,二妙散活性成分潛在作用靶點(diǎn)為290個(gè)。

    圖1 二妙散活性成分分布圖

    表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中保留的藥物活性成分信息表

    2.2 二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)通過Disgenet、Gencards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行濕疹疾病靶點(diǎn)篩選,去除重復(fù)靶點(diǎn),得到相關(guān)靶點(diǎn)3481個(gè)。運(yùn)用Venny作圖平臺(tái)獲得二妙散活性成分與濕疹共同靶點(diǎn)(潛在作用靶點(diǎn))141個(gè),見圖2。

    圖2 二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)

    2.3 二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1構(gòu)建二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”可視化網(wǎng)絡(luò),見圖3。通過Cytoscape 3.7.1內(nèi)置Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),得到度值前10的核心作用成分,見表2。結(jié)果顯示:主要的活性成分為槲皮素(MOL000098)、漢黃芩素(MOL000173)等。由圖3可知,二妙散存在一個(gè)化合物作用于多個(gè)靶點(diǎn)及不同化合物作用于一個(gè)靶點(diǎn)的情況,可見二妙散可通過多種有效成分作用于多個(gè)靶基因治療濕疹。

    圖3 二妙散“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)圖

    表2 二妙散治療濕疹核心成分信息表

    2.4 二妙散治療濕疹潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫,得到PPI網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)信息,并將PPI信息文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4),通過Network Analysis分析有效成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),發(fā)現(xiàn)INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53等節(jié)點(diǎn)度值較高,提示這些靶基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中較重要,其可能是二妙散發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

    圖4 二妙散與濕疹共同基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

    2.5 富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)二妙散治療濕疹的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,均保留P<0.05的結(jié)果,得到GO條目651條,包括:藥物應(yīng)答(response to drug)、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)(cellular response to lipopolysaccharide)等生物過程(BP)條目507條;細(xì)胞外空間(extracellular space)、質(zhì)膜的組成部分(integral component of plasma membrane)等細(xì)胞組成(CC)條目49條;藥物結(jié)合(drug binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)等分子功能(MF)條目95條。對(duì)較重要條目運(yùn)用Origin 2018繪制柱狀圖進(jìn)行可視化,見圖5。

    圖5 二妙散GO功能富集分析圖

    KEGG通路富集分析顯示,濕疹可能與TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、利什曼病信號(hào)通路(Leishmaniasis)、癌癥信號(hào)通路(Pathways in cancer),Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)等120條通路有關(guān)。對(duì)前20條通路運(yùn)用Origin 2018進(jìn)行可視化,見圖6。其中,橫坐標(biāo)為通路名稱(Term);縱坐標(biāo)為Gene Ratio值,表示富集在信號(hào)通路上的靶點(diǎn)占該通路靶點(diǎn)數(shù)的比例;氣泡大小表示富集靶點(diǎn)數(shù)目(Count);氣泡顏色用于表示LgP,LgP越小,代表富集程度越顯著。

    圖6 二妙散KEGG通路富集分析圖

    2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證為明確靶點(diǎn)蛋白與所對(duì)應(yīng)的成分之間的結(jié)合活性,本研究選取度值前10的核心活性成分作為配體,以INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53共6個(gè)度值較高的基因作為受體,進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。配體具有的潛在作用活性越強(qiáng),與受體結(jié)合能量越低,對(duì)接打分則越高。分子對(duì)接所得結(jié)果顯示Docking Score均大于5,且形成范德華力、氫鍵、Pi-Sigma作用等,提示核心活性成分與靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性,分子對(duì)接結(jié)果見圖7,部分分子對(duì)接見圖8。

    圖7 二妙散核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接打分熱圖

    圖8 二妙散中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的部分分子對(duì)接圖(左側(cè)為3D,右側(cè)為2D)

    3 討論

    濕疹是一種由內(nèi)外多種因素引起的過敏性皮膚病,病因尚未明確,且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,導(dǎo)致其治療缺乏針對(duì)性和特異性。研究[11-12]表明,濕疹的發(fā)病主要與遺傳、免疫紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)及外界不良刺激等諸多因素有關(guān)。其中,由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在本病的發(fā)展中起到了重要作用,其通過分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子,并與各種炎癥細(xì)胞共同作用,引起皮膚血管壁通透性增加、血管擴(kuò)張而形成濕疹樣病變[13]。

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,濕疹可緣于腠理不密,外感毒邪,雖發(fā)于表,但亦與內(nèi)在臟腑功能失調(diào)有關(guān),尤其與心火、脾濕關(guān)系甚為密切[14]。對(duì)本病的治療,歷代醫(yī)家重視從風(fēng)、濕、熱論治。據(jù)報(bào)道,在治療濕疹的常用藥物中,清熱藥與利水滲濕藥占比最高,其中蒼術(shù)與黃柏均為使用頻率排名前十的中藥[15]。相關(guān)研究顯示,蒼術(shù)具有顯著的抗炎作用,可抑制TNF、IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并且其化合物還具有多種抗菌活性[16-19];黃柏可通過降低毛細(xì)血管通透性,有效緩解濕疹炎癥的滲出度,其有效成分小檗堿對(duì)濕疹的主要致病菌金黃色葡萄球菌還具有較強(qiáng)的抑制作用[20-21]。

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示,槲皮素、漢黃芩素、豆甾醇等29個(gè)成分為治療濕疹的潛在活性成分。其中,槲皮素已被證實(shí)能夠抑制組胺的釋放,有助于緩解皮膚病的過敏性炎癥[22]。研究[23]表明,漢黃芩素可通過誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡,從而有效降低其數(shù)量,具有治療過敏性炎癥的作用。根據(jù)PPI分析,結(jié)合“中藥-化合物-靶點(diǎn)-濕疹”網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)AKT1、IL6、TNF等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1是表皮末端分化的重要信號(hào)分子,可影響角質(zhì)層的脆性及屏障功能,其活性的降低會(huì)引起角質(zhì)形成細(xì)胞分化樣改變,導(dǎo)致濕疹皮炎中的角化不全[24]。研究表明,金黃色葡萄球菌感染是濕疹發(fā)病的重要原因,同時(shí)還可加重病情,在相關(guān)動(dòng)物模型中IL6等促炎性細(xì)胞因子水平顯著升高[25]。TNF細(xì)胞因子的部分家族成員及其受體的表達(dá)水平與濕疹病變呈正相關(guān),具有潛在的致病性[26]。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),二妙散調(diào)治濕疹主要涉及TNF信號(hào)通路、利什曼病信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。利什曼病是由利什曼原蟲感染所致,其可通過在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏性肉芽腫反應(yīng),加重局部組織損傷,從而引發(fā)皮膚或皮膚黏膜疾病[27]。濕疹的發(fā)病還與Toll樣受體的多態(tài)性有關(guān),其可通過細(xì)菌定植或阻礙Th1反應(yīng)/Th2轉(zhuǎn)移,誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)性疾病[28]。分子對(duì)接結(jié)果表明,槲皮素、谷甾醇、豆甾醇等活性成分與靶蛋白AKT1、IL6、TNF具有良好的對(duì)接活性,提示二妙散活性成分與靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定,以此發(fā)揮治療濕疹的作用。

    旴江醫(yī)學(xué),名方璀璨,其中二妙散以其藥簡(jiǎn)效宏著稱,后世多有依此化裁者,流傳古今,具有較強(qiáng)的生命力。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步分析了二妙散治療濕疹的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及生物學(xué)過程等,得出TNF信號(hào)通路、利什曼病信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等可能是其治療濕疹的主要途徑。綜上,本研究可為旴江古方科學(xué)內(nèi)涵的現(xiàn)代化詮釋提供參考借鑒。

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