紫蘇球蛋白乳化性及其O/W乳液的穩(wěn)定性研究

李超，樊成*，劉寧，方晨璐

1(陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，農(nóng)副食品所，陜西 西安，710048)2(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021) 3(陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安，710021)

植物蛋白是人類不可缺少的的蛋白質(zhì)來源之一，常被作為蛋白大分子乳化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中來提高食品的營養(yǎng)價值和品質(zhì)，對產(chǎn)品的食用性能和加工性能都有一定的影響[1]。紫蘇是一種藥食兩用型植物資源，在我國種植面積廣闊，資源豐富。紫蘇籽主要被用來提取紫蘇油，提油后的紫蘇粕常被用作飼料或者肥料，紫蘇粕中含有28%～45%的蛋白質(zhì)。紫蘇蛋白是一種良好的蛋白質(zhì)資源，富含多種功能性氨基酸，必需氨基酸組成復(fù)合FAO與WHO規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[2]。目前，關(guān)于紫蘇蛋白的提取工藝及蛋白組分的功能性質(zhì)報道比較常見，而對于紫蘇蛋白的應(yīng)用以及技術(shù)開發(fā)方面的研究較少。HE等[3]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了具有功能特性的紫蘇分離蛋白的超聲輔助提取工藝參數(shù)。ZHAO等[4]分別采用熱壓、冷壓和溶劑萃取的方法提取紫蘇分離蛋白，研究其結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)以及在Pickering乳液中的應(yīng)用。王楠等[5]通過對堿溶酸沉法提取的紫蘇分離蛋白、南瓜籽分離蛋白和大豆分離蛋白對比發(fā)現(xiàn)，紫蘇分離蛋白溶解性、乳化性及泡沫穩(wěn)定性均高于其他2種蛋白。劉寧等[6]對紫蘇蛋白組分及功能性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)紫蘇分離蛋白熱變性溫度較高，球蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性較好。

本文對紫蘇脫脂粉采用osbome法提取紫蘇球蛋白，對其乳化性進(jìn)行研究后將其應(yīng)用于水包油(oil in water，O/W)乳液，研究紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度對乳液穩(wěn)定性的影響。以期為紫蘇蛋白的高附加值利用提供有價值的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽，西安風(fēng)吹麥浪農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)開發(fā)有限公司；紫蘇油，市售；鹽酸(分析純)，天津紅巖化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉(分析純)，天津大茂化學(xué)試劑廠；十二烷基磺酸鈉(分析純)，生工生物工程(上海)有限公司；硼酸、濃硫酸、1,2-丙二醇(分析純)，天津天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LE204E分析天平，奧豪斯儀器設(shè)備有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)，上海儀電儀器股份有限公司；JH-1恒溫水浴鍋、JJ-1精密増力電動攪拌器，上海浦東物理光學(xué)儀器公司；FD-1D-50冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信科技有限公司；FA25-D高速剪切分散乳化機(jī)，上海佛魯克科技有限公司；H-1850R高速離心機(jī)，長沙市離心機(jī)儀器有限公司；AH1500高壓均質(zhì)機(jī)，德祥科技有限公司；2000激光粒度分析儀、NANO-ZS90納米粒度表面電位分析儀，英國Malvern公司；K9840半自動凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫蘇球蛋白提取

利用粉碎機(jī)將紫蘇籽粉碎后過60目篩，取一定量紫蘇粉于燒杯加入3倍質(zhì)量石油醚(沸程：60～90 ℃)室溫?cái)嚢?0 min，重復(fù)數(shù)次至石油醚變?yōu)闊o色，紫蘇粉于通風(fēng)櫥揮干殘留石油醚，過80目篩即得紫蘇脫脂粉。根據(jù)GB 5009.5—2016的方法測定其蛋白質(zhì)含量。

紫蘇球蛋白的制備參考o(jì)sborne法[7]分級提取和吳穎等[8]的方法，紫蘇籽脫脂粉中加入1∶13(g∶mL)的去離子水充分?jǐn)嚢? h，4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，棄去上清液。沉淀用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl溶液以1∶13(g∶mL)混合溶解攪拌2 h，4 ℃條件下8 000 r/min離心15 min，重復(fù)3次合并上清液，上清液流動水透析2 d，純凈水透析1 d后凍干即得紫蘇球蛋白。

1.3.2 蛋白質(zhì)溶解性測定

蛋白質(zhì)溶解性的測定參考XU等[9]的方法。取0.5 g(m1)清蛋白、球蛋白和分離蛋白分別溶解于50 mL 蒸餾水中，分別調(diào)節(jié)蛋白分散液的pH值為2～9，室溫條件下磁力攪拌1.5 h后5 000 r/min速度離心15 min，上清液定容到100 mL，采用考馬斯亮藍(lán)的方法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量(m2)，按照公式(1)計(jì)算蛋白質(zhì)的溶解度。

(1)

式中：m1，原蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；m2，上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

參考SUI等[10]的方法，配制的蛋白溶液分成8等份，每份15 mL，分別調(diào)節(jié)pH值為2～9，向每份蛋白質(zhì)分散液中加入5 mL大豆油，在20 000 r/min的均質(zhì)速度下均質(zhì)1 min，從試管底部吸取50 μL均質(zhì)完的乳液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS稀釋100倍，用分光光度儀在500 nm處比色。乳化活性(m2/g)和乳化穩(wěn)定性(min)根據(jù)公式(2)、公式(3)計(jì)算：

(2)

(3)

式中：DF表示乳狀液稀釋倍數(shù)，DF=100；C表示蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；φ表示光程，φ=0.01 m；θ=0.25；均質(zhì)后0和10 min時的吸光度值分別用A0和A10表示。

1.3.4 乳狀液制備

分別稱取一定質(zhì)量的紫蘇球蛋白溶于10 mmol/L pH 7的磷酸緩沖液中，25 ℃攪拌3 h確保蛋白質(zhì)充分溶解，水化過夜，得到蛋白質(zhì)量濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L的蛋白分散液，再次調(diào)pH值至7，向每一份蛋白濃度分散液中加入10%(體積分?jǐn)?shù))的紫蘇油，攪拌1 h，以60 MPa壓力均質(zhì)2次得到不同蛋白質(zhì)量濃度的新鮮乳狀液。

1.3.5 粒徑分布、乳狀液絮凝、凝結(jié)指數(shù)測定

參考SARKAR等[11]的方法，采用馬爾文激光粒度分析儀分析測定乳狀液的粒徑。測定參數(shù)設(shè)如下：通用模式；顆粒的折射率為1.520；分散劑折射率為1.330；泵的轉(zhuǎn)速為2 050 r/min，分別測定乳滴在去離子水和1% SDS中的粒徑分布及體積平均粒徑d4,3。絮凝指數(shù)和凝結(jié)指數(shù)的測定參考TANG等[12]的方法,計(jì)算如公式(4)、公式(5)所示：

(4)

(5)

式中：d4,3-水和d4,3-SDS分別表示乳狀液在水和1% SDS分散劑中體積平均粒徑；d4,3(24 h)和d4,3(0 h)分別表示乳液在放置0和24 h測定的體積平均粒徑(1% SDS分散劑)。

1.3.6 ζ-電位測定

采用馬爾文納米粒度表面電位測定儀對乳狀液ζ-電位進(jìn)行測定。測定前先用10 mmol/L pH 7的磷酸緩沖液將樣品稀釋100倍。測定條件如下：測量溫度為25 ℃，平衡時間為1 min，每個樣品測定3次，取平均值。

1.3.7 界面蛋白含量及濃度測定

參考鄧欣倫[13]的方法，取50 g新鮮乳狀液于離心管中，采用高速離心機(jī)以10 000 r/min速度離心30 min，離心溫度設(shè)為4 ℃，離心后樣品分離成上下2層，上層為乳析層,下層為清液層，用針管收集下層清液，采用凱氏定氮儀測定下層清液中的蛋白質(zhì)含量(N×5.3),計(jì)算過程如公式(6)、(7)所示：

(6)

(7)

式中：Γ表示界面蛋白濃度，mg/m2；Ctotal表示初始乳狀液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/L；Cserum表示下層清液層中蛋白質(zhì)量質(zhì)濃度，g/L；A表示液滴的比表面積，m2/g。

1.3.8 脂肪上浮率測定

取一定量的乳狀液于試管中，加入3滴2%的疊氮鈉，樣品于室溫下貯藏14 d，靜置的條件下定期觀察乳狀液總高度(cm)和清液層的高度(cm)，根據(jù)如下公式計(jì)算脂肪上浮率,計(jì)算過程如公式(8)所示：

(8)

1.3.9 貯存穩(wěn)定性測定

對方法1.2.8中貯存的乳液定期進(jìn)行拍照，記錄乳液的宏觀變化。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次測量平均值，采用Excel處理數(shù)據(jù)，SPSS statistics 26軟件比較結(jié)果平均值之間的顯著性差異，Origin 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇蛋白各組分含量

對紫蘇脫脂粉進(jìn)行蛋白含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其蛋白含量較高，為32.5%。對紫蘇脫脂粉分級提取得到紫蘇球蛋白含量為13.9%。課題組前期在對紫蘇籽不同蛋白組分功能性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)紫蘇球蛋白熱變性溫度為104.58 ℃，分別由5～10、20、25和45 kDa 的4種組分組成，其含有人體所需的8種必需氨基酸和其他多種氨基酸。

2.2 蛋白質(zhì)溶解性

蛋白質(zhì)的溶解度對其功能性質(zhì)有很大影響，主要受pH、離子強(qiáng)度、溫度和溶劑類型等因素影響[14]。圖1為紫蘇球蛋白的溶解性-pH曲線，可以看出紫蘇球蛋白溶解性隨pH變化呈現(xiàn)U型曲線。當(dāng)pH偏離等電點(diǎn)時，球蛋白溶解性逐漸增大；當(dāng)pH在等電點(diǎn)附近時，溶解性都比較低。球蛋白在pH 4時的溶解性低于pH值為5時的溶解性，這可能與球蛋白酸性亞基和堿性亞基的比例不同有關(guān)[15]。

圖1 紫蘇球蛋白質(zhì)溶解性-pH曲線Fig.1 Solubility pH curve of Perilla frutescens

2.3 蛋白質(zhì)乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化活性是蛋白質(zhì)乳化特性評定的重要指標(biāo)，通過單位質(zhì)量所能穩(wěn)定的油水界面面積來表征蛋白質(zhì)促進(jìn)油水混合形成乳狀液的能力。乳化穩(wěn)定性表示乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài)而不發(fā)生相分層或分離現(xiàn)象的特征[16]。紫蘇球蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性結(jié)果如圖2所示，乳化活性-pH結(jié)果與乳化穩(wěn)定性-pH結(jié)果均表現(xiàn)出相似的U型曲線。當(dāng)pH為4時，球蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性最低，為 25.2 m2/g和16.5 min。當(dāng)pH偏離等電點(diǎn)時，紫蘇球蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性迅速增加。

A-乳化活性；B-乳化穩(wěn)定性圖2 紫蘇球蛋白乳化活性-pH和乳化穩(wěn)定性-pH結(jié)果Fig.2 Emulsifying activity pH and emulsifying stability pH results of Perilla globulin

2.4 乳狀液粒徑分布

乳液液滴在分散液介質(zhì)中的分布情況如圖3所示，圖3-A和圖3-B分別為0和24 h時紫蘇球蛋白乳液在水介質(zhì)中的粒徑分布；圖3-C和圖3-D分別0和24 h時紫蘇球蛋白乳液在1% SDS中的粒徑分布。隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，乳狀液的粒徑分布趨向于更小的粒徑分布。乳液在1%SDS中的粒徑表示乳化劑幫助油滴在水中的分散能力，乳液液滴的體積平均粒徑越小說明蛋白質(zhì)乳化能力越好[17]。隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大，乳液液滴粒徑分布圖均有向更小粒徑方向遷移的趨勢。乳液在水中的粒徑分布能夠反映乳液油滴絮凝體的粒徑大小分布情況，不同紫蘇球蛋白濃度的乳液液滴均出現(xiàn)不同程度的絮凝。

A-0 h;B-24 h水介質(zhì)；C-0 h,1%SDS;D-24 h,1%SDS圖3 不同紫蘇球蛋白濃度的O/W乳液的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of O/W emulsion with different Perilla globulin concentration

2.5 乳狀液的粒徑大小、絮凝指數(shù)和凝結(jié)指數(shù)

乳液的穩(wěn)定性可以用0和24 h的絮凝指數(shù)和24 h的凝結(jié)指數(shù)表征。表1為不同紫蘇球蛋白濃度的O/W乳液的粒徑大小、絮凝指數(shù)和凝結(jié)指數(shù)結(jié)果(P<0.05)。乳狀液在水中的粒徑為液滴絮凝體的大小，蛋白質(zhì)量濃度為2.5 g/L時，乳液絮凝體粒徑和液滴粒徑最大，隨著蛋白質(zhì)量濃度增大，乳液液滴粒徑逐漸減小；乳液在1%SDS中的粒徑小于在水中的粒徑，這是因?yàn)镾DS為抗絮凝劑，能夠阻止乳狀液油滴的絮凝[18]。24 h乳液液滴較0 h時均發(fā)生不同程度增大，說明乳液在貯存過程中發(fā)生了一定程度的聚結(jié)；隨著蛋白，濃度的增大，乳液的絮凝指數(shù)(0、24 h)和凝結(jié)指數(shù)都呈現(xiàn)減小的趨勢，絮凝指數(shù)變化較大，0 h時從82.8%下降到10%，24 h時從81.5%下降到7.6%；凝結(jié)指數(shù)變化較小，從103%下降到99%，乳狀液在貯存過程中，液滴的絮凝現(xiàn)象和凝結(jié)現(xiàn)象一般同步發(fā)生。

表1 不同紫蘇球蛋白濃度的O/W乳液乳化特性：液滴粒徑，絮凝指數(shù)，凝結(jié)指數(shù)，界面吸附蛋白含量和界面蛋白濃度Table 1 Emulsification properties of different Perilla globulin O/W emulsions:droplet size, flocculation index and coagulation index, content and concentration of interfacial protein

2.6 乳狀液的ζ-電位分析

乳液液滴表面的電荷量用ζ-電位表征，ζ-電位絕對值大小決定乳狀液的液滴間的排斥力強(qiáng)弱，ζ-電位對乳狀液的物理穩(wěn)定性具有非常重要的作用[19]。不同紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度的O/W乳液的ζ-電位如圖4所示(P<0.05)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度為2.5～12.5 g/L時，乳狀液的ζ-電位為-25.9～33.9 mV。隨紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度增大，乳液ζ-電位值逐漸減小，絕對值逐漸增大。

圖4 不同紫蘇球蛋白濃度的O/W乳液ζ-電位測定結(jié)果Fig.4 Determination of zeta potential of O/W emulsion with different Perilla globulin concentratio注：不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

2.7 乳狀液界面蛋白含量和濃度分析

乳液界面蛋白含量和界面蛋白濃度是反映乳狀液穩(wěn)定性的一個重要參數(shù)指標(biāo)[11]。不同紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度O/W乳液界面蛋白含量和界面蛋白濃度如表2所示(P<0.05)，隨著蛋白質(zhì)量濃度增大，界面蛋白含量和濃度隨之增大，在蛋白質(zhì)量濃度為2.5～12.5 g/L時，乳液界面蛋白含量從19.2%增加到37.5%，界面蛋白濃度從0.71 mg/m2增加到1.98 mg/m2。一般情況下，界面蛋白濃度越高，乳液的抗凝結(jié)性就越好，紫蘇球蛋白濃度從2.5 g/L增大到 12.5 g/L時，有更多的蛋白質(zhì)吸附到油水界面，增加了乳狀液液滴界面的黏彈特性[20]。這與粒徑、絮凝及凝結(jié)指數(shù)結(jié)果相印證。

2.8 脂肪上浮率

水相和油相的密度差異會導(dǎo)致乳液出現(xiàn)脂肪上浮現(xiàn)象，脂肪上浮率是乳液油相與連續(xù)相所達(dá)到的一種平衡比例的穩(wěn)定性指標(biāo)[21]。圖5為不同紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度O/W乳液在貯存14 d內(nèi)的脂肪上浮率結(jié)果。紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度為2.5～7.5 g/L的乳狀液在貯存1 d時就發(fā)生了明顯的脂肪上浮現(xiàn)象，蛋白質(zhì)量濃度為2.5 g/L的乳狀液在貯存4 d時脂肪上浮率達(dá)到最大值，蛋白質(zhì)量濃度為5.0和7.5 g/L的乳狀液均在貯存8 d時乳狀液脂肪上浮率達(dá)到最大值，蛋白質(zhì)量濃度為10.0和12.5 g/L的乳狀液在整個14 d的貯存過程中幾乎未發(fā)生脂肪上浮現(xiàn)象。這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)量濃度較高條件下，蛋白質(zhì)具有更好的乳化能力，更多的蛋白質(zhì)吸附到乳狀液油滴界面，形成的乳狀液的液滴就越小，對乳狀液的貯存過程中的脂肪上浮具有抑制作用[22]。

圖5 不同紫蘇球蛋白濃度的O/W乳液的脂肪上浮率結(jié)果Fig.5 Results of fat floating rate of O/W emulsion with different Perilla globulin concentration

2.9 貯存穩(wěn)定性

不同紫蘇球蛋白濃度O/W乳液的貯存穩(wěn)定性結(jié)果如圖6所示。圖6-A為乳液貯存0 d時的結(jié)果；圖6-B為乳液貯存14 d的結(jié)果。當(dāng)乳液貯存14 d時，蛋白質(zhì)量濃度為2.5、5.0、7.5 g/L的乳液發(fā)生了明顯的分層現(xiàn)象，蛋白質(zhì)量濃度為10.0和12.5 g/L的乳液未發(fā)生分層，這可能是因?yàn)榈鞍缀康陀?0 g/L時，較大乳液液滴由于發(fā)生重力分層或者聚結(jié)現(xiàn)象失穩(wěn)。界面蛋白含量較低，形成的蛋白界面膜界面張力較大，容易發(fā)生破裂，液滴之間相互結(jié)合形成更大的乳狀液液滴，最終不斷聚集結(jié)合使乳液失穩(wěn)發(fā)生脂肪上浮[23]。

A-0 d；B-14 d圖6 不同紫蘇球蛋白濃度的O/W乳液的貯存穩(wěn)定性結(jié)果Fig.6 Storage stability of O/W emulsion with different Perilla globulin concentration

3 結(jié)論

紫蘇脫脂粉中球蛋白質(zhì)含量較高，其溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性隨pH變化均呈現(xiàn)U型曲線；對紫蘇秋蛋白質(zhì)量濃度為2.5～12.5 g/L的O/W乳液研究發(fā)現(xiàn)，隨紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度增大，乳液粒徑、絮凝指數(shù)、凝結(jié)指數(shù)均逐漸減小，界面蛋白含量和濃度增加；在14 d貯存過程中，低于7.5 g/L球蛋白質(zhì)量濃度的乳液均發(fā)生脂肪上浮現(xiàn)象，10.0 g/L以上紫蘇球蛋白質(zhì)量濃度的乳液貯存穩(wěn)定性良好。