金雀異黃酮通過抑制黃嘌呤氧化酶延緩結(jié)腸腫瘤發(fā)展

李紅領(lǐng)，李海濤

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

結(jié)腸相關(guān)癌癥(colorectal cancer，CRC)占美國癌癥致死的第3位，5年生存率大概是14%[1]。在世界范圍內(nèi)，以美國和歐洲為首的發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，從1975年開始，美國結(jié)腸癌發(fā)病率呈下降趨勢，但年輕人的發(fā)病率有所升高；非洲和亞洲國家的發(fā)病率較低，但是，隨著中國經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[2]。結(jié)腸癌主要分為兩類，第一類是散發(fā)性結(jié)腸癌(sporadic colorectal cancer，SCRC)，主要發(fā)展機(jī)制是一系列基因突變的結(jié)果，其中腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)基因失活是SCRC的起因；第二類是炎癥相關(guān)的結(jié)腸癌(colitis-associated cancer，CAC)，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，有些研究認(rèn)為，炎癥引起結(jié)腸上皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷是這類結(jié)腸癌變的起因[3-4]。癌癥化學(xué)預(yù)防的定義是通過使用天然，合成或生物化學(xué)試劑來逆轉(zhuǎn)，抑制或預(yù)防癌癥的發(fā)展[5]。結(jié)腸腫瘤發(fā)生的多步驟性為預(yù)防提供了機(jī)會(huì)[6]。環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2，COX2)是預(yù)防結(jié)腸癌最有希望的分子靶標(biāo)，但臨床試驗(yàn)表明，長期抑制COX2會(huì)引起心血管毒性[7]。治療癌癥的一些藥物，例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和他莫昔芬等，會(huì)出現(xiàn)耐藥性，高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)等副作用。因此，近年來人們開始關(guān)注有效改善化學(xué)療法，并降低不良反應(yīng)的自然療法[8]。長期攝入嘌呤含量高的食物，例如海鮮，啤酒等可以引起高尿酸血癥，進(jìn)而引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和高尿酸腎病，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)是治療這些疾病的主要靶點(diǎn)[9]。最近的研究表明，XO可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[10]，得益于XO在痛風(fēng)中的研究結(jié)果，黃酮類物質(zhì)展示出對XO抑制的巨大潛力[11]；另一方面，流行病學(xué)證據(jù)表明，大豆異黃酮可預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)展[12-14]。綜上所述，具有抑制XO作用的黃酮類化合物可能有預(yù)防結(jié)腸癌的潛力。因此，本研究首先通過HPLC的方法，體外篩選XO的抑制劑；然后建立氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌模型評價(jià)這些抑制劑的體內(nèi)效果。研究成果表明，金雀異黃酮可以通過抑制XO有效延緩結(jié)腸癌的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級C57BL/6 N雄性小鼠，5周齡(體重20～22 g)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 抗體

重組Anti-Xanthine Oxidase抗體(ab109235)、重組Anti-TNFα抗體(ab81299)，Abcam。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

還原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)、尿酸試劑盒，南京建成生物工程研究所；XO活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Mouse TNFα ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA Kit，南京福麥斯生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒，生工生物工程股份有限公司；AOM，無錫萊弗思生物有限公司；DSS，南京百思凱科技有限公司；XO、別嘌呤醇(allopurinol)、尿酸(uric acid)、黃嘌呤(xanthine)，Sigma公司;黃酮類(flavones)：芹菜素(apigenin)、白楊素/柯因(chrysin)，黃酮醇類(flavonols)：高良姜素(galangin)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、漆黃素(fisetin)、桑色素(morin)，異黃酮類(isoflavones)：金雀異黃酮(genistein)、黃豆苷元(daidxein)，黃烷酮類(flavanones)：二氫黃酮甙(hesperiden)、柚皮素(naringenin)，類黃酮醇(flavanonols)：花旗松素(taxifolin)，酚酸類(phenolic acids)：綠原酸(chlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC法篩選XO的有效抑制劑

利用XO催化黃嘌呤氧化生成尿酸這一反應(yīng)。首先在1.5 mL EP管中加入終濃度為100 μmol/L的抑制劑和20 μL、0.1 U/mg prot的XO，在PBS(PH 7.5)緩沖溶液里室溫下反應(yīng)15 min，然后加入330 μL 150 μmol/L黃嘌呤，反應(yīng)30 min后加入100 μL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng)；PBS和別嘌呤醇(10 μmol/L)分別作為空白和陽性對照。反應(yīng)后的溶液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾后，HPLC法檢測產(chǎn)物尿酸的峰面積，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需進(jìn)行3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)[15]。因有些化合物的光不穩(wěn)定性較差，整個(gè)過程需注意避光，利用公式(1)計(jì)算XO的活性。

(1)

HPLC的檢測方法：流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸二氫鈉水溶液，流速為0.8 mL/min，室溫，ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，檢測波長為290 nm，液相色譜儀為Q Exactive LC (Thermo Fisher)。

1.2.2 利用AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型實(shí)驗(yàn)

5周齡SPF級C57BL/6 N雄性小鼠，飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF屏障環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)編號(hào)為：JN.No20181230c1250401 [279]。小鼠在屏障環(huán)境中適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為空白組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組包括低劑量金雀異黃酮組(20 mg/kg)和高劑量金雀異黃酮組(40 mg/kg)。分組后，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射AOM(10 mg/kg，200 μL)，空白組注射相同體積的9 g/L NaCl溶液。1周后，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠接受含有3% DSS飲用水[16]，持續(xù)1周，同時(shí)開始給與實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃低劑量和高劑量金雀異黃酮，空白組和模型組灌胃相同體積的NaCl溶液。模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠停止給與DSS后，用普通的飲用水繼續(xù)喂養(yǎng)6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集血清，結(jié)腸，肝脾等組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中每組6只小鼠的結(jié)腸放于液氮中保存，用于測量生化指標(biāo)，其余6只小鼠的結(jié)腸，用4%多聚甲醛固定，用于蘇木精- 伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法和免疫組化(immunohistochemistry，IHC)分析。

1.2.3 小鼠結(jié)腸組織固定和HE染色

用于HE和IHC分析的結(jié)腸組織，用冷的PBS沖洗干凈后，縱切后平鋪在試驗(yàn)臺(tái)上，從遠(yuǎn)端結(jié)腸開始卷起，直到盲腸，“瑞士卷”做好后，放入4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋后，制成5 μm的切片，經(jīng)HE染色，于顯微鏡下觀察拍照，對異常隱窩病灶和腫瘤計(jì)數(shù)。

1.2.4 IHC分析

結(jié)腸組織切片經(jīng)過烤片、脫蠟、復(fù)水后，經(jīng)3%體積分?jǐn)?shù)的過氧化氫溶液中浸泡10 min滅酶，檸檬酸鈉溶液中微波加熱6 min完成抗原修復(fù)，冷卻至室溫，使用5% BSA溶液室溫封閉1 h，切片放入恒濕盒內(nèi)，并在4 ℃層析柜內(nèi)孵育一抗(XO、TNFα抗體，1∶200稀釋)，過夜，然后按IHC試劑盒說明書完成染色和蘇木精復(fù)染等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并在掃描顯微鏡下拍照分析XO和TNFα的表達(dá)水平和定位。

1.2.5 小鼠結(jié)腸部位TNFα,IL-6和GSH含量測定

液氮保存的結(jié)腸樣品，加入20倍體積PBS，組織研磨后，12 000 r/min，30 min，4 ℃離心收集上清液，如果上清液脂肪過多，需再次離心，重新收集上清液，避免上清液脂肪影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。取部分上清液經(jīng)5倍稀釋后，用BCA法測蛋白濃度；取另外一部分上清液，檢測結(jié)腸部位IL-6，TNFα和GSH含量，IL-6和TNFα的含量嚴(yán)格按照說明書所提供的酶聯(lián)免疫方法進(jìn)行檢測，GSH含量嚴(yán)格按照說明書所提供的生化微板法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)定。其余上清液放入-80 ℃冰箱備用。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Turkey′st-test 檢驗(yàn)用于比較2組之間的數(shù)據(jù)；One-way ANOVA和Bonferroni校正用于比較3個(gè)或更多組之間的數(shù)據(jù)。對于P<0.05 的分析結(jié)果，認(rèn)為具有顯著性差異，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 金雀異黃酮體外抑制XO的活性

通過HPLC篩選的方法，分別評價(jià)了12種黃酮類化合物和2種酚酸類化合物對XO活性的影響，結(jié)果見圖1，陽性對照別嘌呤醇組XO活性為(1.5±0.7)%，芹菜素和金雀異黃酮對XO活性抑制顯著，XO的活性分別為(26.3±3.3)%(P<0.01)和(9.8±0.3)%(P<0.001)；進(jìn)一步考察了金雀異黃酮對XO活性抑制的劑量依賴效應(yīng)，結(jié)果見圖2，10、30、100 μmol/L金雀異黃酮組的XO活性分別為(82.2±3.1)%(P>0.05)，(61.2±1.1)%(P<0.05)和(10.9±1.5)%(P<0.001)，金雀異黃酮表現(xiàn)出對XO活性抑制的劑量依賴效應(yīng)。

A-黃酮和酚酸類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式；B-黃酮和酚酸類物質(zhì)對黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸活性的影響圖1 黃酮和酚酸類化合物對 XO 活性的影響Fig.1 The effect of flavonoids and phenolic acids on the activity of xanthine oxidase注：*表示P<0.05,**P<0.01,***表示P<0.001(下同)

2.2 金雀異黃酮抑制小鼠結(jié)腸癌的發(fā)展

通過建立AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸癌腫瘤小鼠模型，評價(jià)了不同濃度金雀異黃酮對結(jié)腸腫瘤的預(yù)防作用，圖3-A為實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。圖3-B顯示各組小鼠的體重分別是，空白組(27.6±2.0)g，模型組(26.1±1.5)g，低劑量金雀異黃酮組(25.7±1.9)g，高劑量金雀異黃酮組(25.2±2.1)g。實(shí)驗(yàn)組小鼠較空白和模型組小鼠的體重有所下降，但無顯著性差異(P>0.05)，通過結(jié)腸長度和肝指數(shù)(圖3-C和圖3-D)可以看出，小鼠表現(xiàn)出對金雀異黃酮的耐受，無明顯的肝毒性。圖3-E表明模型組的脾指數(shù)顯著高于空白組(P<0.001)，高劑量的金雀異黃酮可以顯著抑制AOM/DSS引起的脾指數(shù)升高(P<0.001)。AOM/DSS模型組小鼠結(jié)腸組織中的腫瘤數(shù)目(P<0.01)，TNFα(P<0.05)和IL-6(P<0.05)水平較空白組顯著升高，高劑量的金雀異黃酮顯著降低結(jié)腸部位的腫瘤數(shù)目(P<0.05)和TNFα水平(P<0.05)(圖3-F～圖3-H)。這些結(jié)果表明高劑量金雀異黃酮可以抑制AOM/DSS引起的結(jié)腸炎癥相關(guān)癌癥的發(fā)展。

A-不同濃度的金雀異黃酮對黃嘌呤氧化酶活力的影響；B-HPLC法檢測金雀異黃酮對黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤產(chǎn)生尿酸的影響圖2 金雀異黃酮對 XO 活性抑制的劑量依賴效應(yīng)Fig.2 The dose-dependent effect of genistein on the inhibition of xanthine oxidase activity

2.3 金雀異黃酮通過抑制XO活性延緩結(jié)腸腫瘤的發(fā)展

最近的研究表明，XO可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[10]，鑒于金雀異黃酮在體外顯示出對XO的抑制作用，金雀異黃酮抑制小鼠結(jié)腸癌發(fā)展的靶點(diǎn)可能是XO。圖4中IHC結(jié)果表明小鼠結(jié)腸腫瘤部位的XO和TNFα蛋白水平升高，XO在間質(zhì)和黏膜中均有表達(dá)，TNFα主要在間質(zhì)表達(dá)。AOM/DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠結(jié)腸部位XO活性(P<0.01)和產(chǎn)物尿酸的水平(P<0.05)較空白組顯著升高，高劑量金雀異黃酮顯著抑制結(jié)腸部位XO(P<0.05)和尿酸水平(P<0.05)，并顯著提高了GSH水平(P<0.05)。這些結(jié)果表明金雀異黃酮通過抑制XO活性延緩結(jié)腸腫瘤的發(fā)展。

A-黃嘌呤氧化酶在結(jié)腸腫瘤中的定位；B-小鼠結(jié)腸黏膜中XO活性；C-結(jié)腸黏膜中尿酸含量；D-金雀異黃酮對AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸黏膜中GSH含量影響圖4 不同濃度金雀異黃酮對結(jié)腸癌模型小鼠中 XO 的影響Fig.4 The effect of different concentrations of genistein on xanthine oxidase in colon cancer mice

3 討論

別嘌呤醇可以通過竟?fàn)幮砸种芚O的活性來治療痛風(fēng)等疾病，但會(huì)出現(xiàn)過敏性皮疹、腹痛腹瀉等不良反應(yīng)，因此這種藥物在臨床上的應(yīng)用飽受非議[9]。近年來，隨著不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中一些黃酮類化合物可有效抑制XO的活性[11]。本文通過HPLC的方法評價(jià)了12種黃酮類和2種酚酸類對XO活性的影響，發(fā)現(xiàn)金雀異黃酮可以顯著抑制XO活性，并具有明顯的劑量依賴，這可能與金雀異黃酮A環(huán)上5和7位的羥基和C環(huán)上3位的苯酚基團(tuán)有關(guān)，但是金雀異黃酮是如何抑制XO及抑制類型需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

在體內(nèi)，金雀異黃酮也可以抑制AOM/DSS小鼠結(jié)腸癌模型中結(jié)腸部位XO活性，并減少結(jié)腸部位小鼠腫瘤的數(shù)目。這些結(jié)果表明，金雀異黃酮可以通過抑制XO有效延緩結(jié)腸癌的發(fā)展。值得注意的是，金雀異黃酮降低了AOM/DSS小鼠結(jié)腸癌模型中尿酸含量，升高了結(jié)腸部位的GSH含量，這個(gè)結(jié)果顯示金雀異黃酮可能是通過降低尿酸或者緩解結(jié)腸部位的氧化應(yīng)激而延緩結(jié)腸癌的發(fā)展。氧化應(yīng)激引起的組織損傷長期以來一直與結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸腫瘤發(fā)生有關(guān)，但其分子機(jī)制仍不清楚[17]。最近的研究表明，過量的尿酸對機(jī)體是一種危險(xiǎn)信號(hào)，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[18-19]。因此，XO具體是通過哪種代謝產(chǎn)物促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)展還需進(jìn)一步研究。

綜上，本研究通過HPLC的方法，篩選到金雀異黃酮可有效抑制XO，并延緩AOM/DSS引起的小鼠結(jié)腸癌的發(fā)展。臨床數(shù)據(jù)也表明，金雀異黃酮與抗癌藥物，例如阿霉素，多西他賽，和他莫昔芬聯(lián)合使用時(shí)，展現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用[20-21]。這些結(jié)果表明，金雀異黃酮具有潛在的臨床治療或者聯(lián)合其他抗癌藥物預(yù)防結(jié)腸癌的作用。