牛源無乳鏈球菌耐藥性與毒力基因的表達(dá)量差異分析

范 雪，邵 偉，趙艷坤，杜曉慧，陳 賀，王富蘭，王 帥

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091）

0 引言

【研究意義】奶牛養(yǎng)殖環(huán)境、牛體本身以及致病菌之間的相互作用是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要致病菌，引起奶牛乳房炎的原因有很多，擠奶時(shí)工人手上攜帶的細(xì)菌以及臥床墊料等都可能引起奶牛乳房炎。無乳鏈球菌是一類人畜共患性病原菌，作為奶牛乳房炎的主要致病菌，能引起奶牛急性慢性的乳房炎，造成奶牛乳區(qū)出血等癥狀。【前人研究進(jìn)展】無乳鏈球菌是一類條件性致病菌，致病性廣泛，可通過體表創(chuàng)傷以及口腔等途徑感染動(dòng)物機(jī)體[1]。無乳鏈球菌在侵入動(dòng)物機(jī)體后，可逃避宿主細(xì)胞的吞噬作用而大量繁殖，從而造成動(dòng)物機(jī)體發(fā)病。無乳鏈球菌的致病性因毒力因子在表達(dá)上的不同而表現(xiàn)出差異性。無乳鏈球菌可憑借自身的毒力和致病性來侵襲寄主的組織，并在組織中生長(zhǎng)繁殖。無乳鏈球菌的毒力因子主要有β-溶血素、CAMP因子、莢膜多糖等致病因子?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】無乳鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一。近年來，由于生產(chǎn)生活中對(duì)奶牛乳房炎的治療致使無乳鏈球菌產(chǎn)生了一定的耐藥性及多重耐藥現(xiàn)象。目前無乳鏈球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性及多重耐藥情況日較嚴(yán)重?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)檢測(cè)無乳鏈球菌中的一些耐藥基因及毒力基因，并且對(duì)不同無乳鏈球菌菌株的毒力基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，為無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎篩選出合適的抗菌藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株除質(zhì)控菌株為購買的編號(hào)為ATCC12386，其他均由前期對(duì)患奶牛乳房炎牛乳中經(jīng)過培養(yǎng)、生化鑒定及16SrDNA比對(duì)分離鑒定所得，菌株由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所保存。

1.1.2 主要試劑

16種抗菌藥物藥敏板購買自天津市金章科技發(fā)展有限公司，試驗(yàn)所需哥倫比亞血平板均購自泰州木凡生物科技有限公司，胰蛋白胨大豆肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。DNA Maker DL2000及2×PowerTapPCR MasterMix均為百泰克生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。細(xì)菌基因組提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測(cè)

所用無乳鏈球菌菌株在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)18～24 h復(fù)蘇純化，后在胰蛋白胨大豆肉湯進(jìn)行增菌，采用微量肉湯稀釋培養(yǎng)的方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.2 毒力基因與耐藥基因的PCR檢測(cè)

所采用的毒力基因引物參照[2-3]的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，耐藥基因參照[4-6]的方法設(shè)計(jì)，引物均有北京鼎峰生物技術(shù)股份有限公司合成。反應(yīng)體系為30μL：2×PowerTapPCR MasterMix 15 uL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，ddH2O補(bǔ)齊至30μL。表1

表1 無乳鏈球菌毒力基因與耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequence of virulence gene and drug resistance gene of Streptococcusagalactiae

1.2.3 無乳鏈球菌8種毒力基因的熒光定量檢測(cè)

細(xì)菌RNA提取先用20 mg/mL的溶菌酶處理，后用Trizol法進(jìn)行RNA提取。反應(yīng)體系為20μL：2×One Step SYBR Green Mix 10μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1μL，上下游引物各0.4μL，50×ROX reference Dye 1 0.4μL，模板DNA1μL，無RNA酶的ddH2O補(bǔ)至20μL。反應(yīng)體系為逆轉(zhuǎn)錄（50℃，3 min），預(yù)變性（95℃，30 s），循環(huán)反應(yīng)（95℃，10 s；60℃，30 s）×30，溶解曲線（95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s）。表2

表2 無乳鏈球菌毒力基因熒光定量引物序列Table 2 Sequence of fluorescent quantitative primers for virulence gene of Streptococcus agalactiae

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用EXCEL對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，之后利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（22.0）對(duì)無乳鏈球菌毒力基因的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan多重比較，P＜0.05視為差異顯著。利用EXCEL繪制藥敏試驗(yàn)柱狀圖、GraphPad Prism軟件（7.0）繪制基因表達(dá)量圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌抗菌藥物敏感性檢測(cè)

研究表明，牛源無乳鏈球菌對(duì)青霉素、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、頭孢噻吩、頭孢噻呋、慶大霉素、氟苯尼考、利福昔明、萬古霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明這11種藥物的敏感性達(dá)到了65%以上，其中敏感性最高的是氟苯尼考（92.4.%）和頭孢噻呋（88.4%）；無乳鏈球菌菌株對(duì)這16種藥物均存在不同程度的耐藥，無乳鏈球菌對(duì)氨芐西林、紅霉素、克林霉素的耐藥率均達(dá)到了50%以上，對(duì)磺胺異惡唑的耐藥率也達(dá)到了45%以上。圖1

圖1 牛源無乳鏈球菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Testing results of drug resistanceof Streptococcusagalactiae from cattle

多重耐藥情況多為2耐和4耐，多重耐藥率分別為23.1%和15.4%，多重耐藥最嚴(yán)重的是對(duì)這16種抗菌藥物均耐藥。奶牛乳房炎無乳鏈球菌均有多種耐藥情況，并且根據(jù)場(chǎng)間用藥不同，地區(qū)不同而有所差異。圖2

圖2 牛源無乳鏈球菌多重耐藥檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Testing results of multi-drug resistance of Streptococcusagalactiae from cattle

2.2 無乳鏈球菌耐藥基因與毒力基因的檢測(cè)

研究表明，無乳鏈球菌對(duì)紅霉素、克林霉素及多西環(huán)素，氨芐西林這是4種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，并產(chǎn)生了多重耐藥現(xiàn)象，多集中于對(duì)2～5種藥物耐藥，甚至達(dá)到了對(duì)16種藥物都耐藥。sul1和gyrA的檢出率為100%，ermB檢出率為93.3%，ermC的檢出率為33.3%；而ermA、sul2、sul3及parC這4種耐藥基因未檢出。pavA、cfb、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA、hylB的檢出率為100%，rib檢出率為13.3%，bca的檢出率為53.3%，cylE檢出率為73.3%；而bac、lmb、scpB這3種毒力基因未檢出。圖3，圖4

圖3 無乳鏈球菌毒力基因的凝膠電泳Fig.3 Gel electrophoresis of virulence gene of Streptococcusagalactiae

圖4 無乳鏈球菌耐藥基因的凝膠電泳Fig.4 Gel electrophoresis of drug resistance genes of Streptococcus agalactiae

2.3 無乳鏈球菌毒力基因的表達(dá)量差異

研究表明，野生菌株HLJ044和NM-038-2顯著高于質(zhì)控菌株ATCC12386（P＜0.05）；在cspA基因中，NM-038-2的表達(dá)量顯著高于其它2株菌，HLJ044的表達(dá)量顯著高于質(zhì)控菌株ATCC12386（P＜0.05）；在sip基因的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果中，HLJ044的表達(dá)量顯著高于其他2株菌，質(zhì)控菌株ATCC12386又顯著高于NM-038-2（P＜0.05）；對(duì)于iagA基因，NM-038-2菌株的表達(dá)量顯著高于其他2株菌（P＜0.05）；對(duì)于pavA基因和hylB基因，NM-038-2菌株的表達(dá)量顯著高于其他2株菌（P＜0.05）；NM-038-2的表達(dá)量顯著高于其他2株菌，而ATCC12386菌株的表達(dá)量又顯著高于HLJ044菌株（P＜0.05）；在bibA基因的表達(dá)量檢測(cè)圖中，NM-038-2顯著高于其他兩株菌，HLJ044菌株的表達(dá)量又高于質(zhì)控菌株ATCC12386（P＜0.05）。圖5

圖5 無乳鏈球菌不同菌株毒力基因的表達(dá)量Fig.5 Testing results of virulence genes expressions in different strains of Streptococcusagalactiae

3 討論

3.1 無乳鏈球菌耐藥性

抗菌藥物的用量與細(xì)菌耐藥性的形成存在著一定的關(guān)系，除了細(xì)菌自身耐藥性的變遷和藥物自身的特點(diǎn)之外，還可能與藥物種類、數(shù)量和藥物的用量相關(guān)[7-8]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物為抑菌劑，而β-內(nèi)酰胺類為殺菌劑，可以先使用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物抑制細(xì)菌的生物被膜的形成，采用β-內(nèi)酰胺類藥物采用自身對(duì)細(xì)菌的殺菌效果，把細(xì)菌鏟除，達(dá)到相輔相成的效果[9]。

無乳鏈球菌常常定植于奶牛的乳腺中，雖然無乳鏈球菌的致病性不強(qiáng)，但其對(duì)奶牛乳腺組織造成傷害并使奶牛機(jī)體的免疫功能失衡。研究結(jié)果顯示，無乳鏈球菌對(duì)紅霉素、克林霉素，磺胺異惡唑及四環(huán)素耐藥，與多個(gè)文獻(xiàn)對(duì)于無乳鏈球菌的藥敏結(jié)果趨于一致[10-13]?？赡芘c對(duì)于無乳鏈球菌引起的病癥采用同類藥物所造成有關(guān)。對(duì)于青霉素、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、頭孢噻吩等11種抗菌藥物的敏感性較高，此結(jié)果與鄧穎穎[14]的研究結(jié)果一致，但與劉嬋[15]、祝宇[5]等分離出的無乳鏈球菌對(duì)不同抗菌藥物表現(xiàn)出不同的耐藥性的結(jié)果有所不同，尤其是對(duì)青霉素、紅霉素等藥物的耐藥的結(jié)果不一致，可能是因?yàn)榈貐^(qū)或菌株來源不同所采用的治療藥物也有所不同而導(dǎo)致。

3.2 無乳鏈球菌毒力基因與耐藥基因檢測(cè)

鞭毛、菌毛，生化因子等等都可以作為調(diào)節(jié)細(xì)菌的物理屬性[16-18]。pavA、cfb、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA、hylB毒力基因的檢出率為100%，此研究結(jié)果與前人研究一致[19-20]；而對(duì)于rib檢出率為13.3%，bca的檢出率為53.3%，cylE檢出率為73.3%，3種毒力基因的檢出率均有所出入。而對(duì)于bac、lmb、scpB這3種毒力基因未檢出，這與Carvalho-Castro[21]等在巴西分離的菌株未檢出bac基因相符，與Duarte等[22]的檢出率為7.3%的結(jié)果有所不同，可能是由于無乳鏈球菌的來源不同而導(dǎo)致。

研究共檢測(cè)到了4種耐藥基因。與藥敏試驗(yàn)結(jié)果基本相符合，并且試驗(yàn)無乳鏈球菌菌株產(chǎn)生了同時(shí)攜帶4種耐藥基因的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于氟喹諾酮類耐藥基因gyrA的檢出率為100%，而parC的檢出率為0%，與王愛媛[19]的研究結(jié)果不同，對(duì)于無乳鏈球菌攜帶ermB基因的檢測(cè)結(jié)果來看，與路璐等的研究結(jié)果有所差異，可能是由于各地對(duì)于細(xì)菌引起的奶牛乳房炎的用藥不同所導(dǎo)致。

3.3 無乳鏈球菌毒力基因的表達(dá)量差異

粘附與定植相關(guān)的纖維蛋白原結(jié)合蛋白，黏連蛋白，細(xì)菌免疫原性黏附素基因等等，與侵襲相關(guān)的β溶血素，CAMP因子，透明質(zhì)酸鹽裂解酶等，與免疫逃避相關(guān)的莢膜合成及細(xì)胞壁相關(guān)因子，表面免疫原性蛋白，超氧化物歧化酶等等。蘇友祿等[23]的研究，結(jié)果顯示，蛋白缺失導(dǎo)致弱毒株的毒力變強(qiáng)，而強(qiáng)毒株的毒力明顯減弱，并且缺失蛋白菌株的毒力基因（sodA、cspD及cspG）在弱強(qiáng)菌株中的表達(dá)呈現(xiàn)出相反模式，但cspA和pavA基因的表達(dá)未受影響。Wang[24]的研究結(jié)果顯示，缺失hylB基因會(huì)導(dǎo)致可能導(dǎo)致無乳鏈球菌的存活能力降低，對(duì)宿主的毒力明顯減弱。

4 結(jié)論

無乳鏈球菌對(duì)紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，場(chǎng)內(nèi)在用藥前先做診斷，采用合適的抗菌藥物防止奶牛乳房炎。大多數(shù)毒力基因都有不同程度的檢出，但對(duì)于普通PCR和熒光定量PCR檢測(cè)較高的pavA、cfb、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA、hylB這8個(gè)基因?qū)o乳鏈球菌的致病性起著重要的作用。