樺褐孔菌多糖的制備工藝優(yōu)化及其活性研究

郭鑫，包東瑞，趙佳樂，何旭，陳美華，夏廣清,3*，臧皓*

(1.通化師范學院醫(yī)藥學院，通化134002；2.通化師范學院長白山生物種質(zhì)資源研究院，通化134002；3.長白山生物種質(zhì)資源評價及應用研究院，通化134002；4.通化師范學院生命科學學院，通化134002)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)為銹革孔菌目、銹革孔菌科真菌類[1]，一般生長在樹皮下面，干燥后質(zhì)地堅硬，無臭無味，俗稱為樺樹茸，是十分重要的一類藥用真菌[2]。天然的樺褐孔菌主要分布于俄羅斯、芬蘭、波蘭、日本北海道等北半球北緯40°～50°的地區(qū)和我國的黑龍江省與吉林省一帶[3]。樺褐孔菌中具有多種生物活性成分[4]，主要包括多糖類、三萜類、黃酮類、多酚類、黑色素和木質(zhì)素類等。其中樺褐孔菌中多糖類物質(zhì)具有一定的抗腫瘤、抗氧化、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等生物活性而受到廣泛關注[5-9]。

本實驗采用酶法對樺褐孔菌多糖進行提取，以香菇柄多糖的提取方法為參照[10]，優(yōu)化酶法提取樺褐孔菌多糖工藝，并對所得多糖進行了相關抗氧化和降糖活性評價，旨在為樺褐孔菌的進一步開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌，吉林弘毅特產(chǎn)有限公司；果膠酶（30000U/mg）、纖維素酶（10000U/mg）、木瓜蛋白酶（＞200U/mg），麥克林；磺胺（99%）、奈乙二胺二鹽酸鹽、無水磷酸二氫鉀（99.5%）、無水磷酸氫二鉀（99%）、無水磷酸氫二鈉（99%）、無水磷酸二氫鈉（99%），薩恩化學；苯酚（99%）、Trolox、3，5-二羥基苯甲酸、可溶性淀粉，西亞化學；酒石酸鉀鈉、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、硝普鈉、阿卡波糖，美國sigma公司；NaOH、HCl、乙醇等常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

VDHG-9245A型恒溫箱，上海一恒科技有限公司；TDL-5-A型號低速大容量離心機，上海安亭科學儀器；高速中藥粉碎機，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司；磁力攪拌器，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海-恒科技有限公司；ZNCL-G190×90磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱鼓風干燥箱，上海-恒科學儀器有限公司；HY-2旋渦混勻儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；ReadMax1900Plus型光吸收酶標儀，上海閃普生物科技公司；BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯科學儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 水提法

樺褐孔菌以料液比1∶40加入蒸餾水溶液，置于95℃磁力攪拌水浴鍋內(nèi)進行提取2h后，離心沉淀，取上清液，水浴蒸發(fā)濃縮至10mL，加入4倍體積95 %乙醇，4℃靜置過夜，4000r/min離心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。

1.2.2 堿提法

樺褐孔菌以料液比1∶40加入5% NaOH溶液，放置于95℃磁力攪拌水浴鍋內(nèi)2h，進行提取后，離心沉淀，取上清液，水浴蒸發(fā)濃縮至10mL，加入4倍體積95 %乙醇，邊加邊攪拌，4℃靜置過夜，4000r/min離心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。

1.2.3 酶解法制備樺褐孔菌多糖工藝

樺褐孔菌以料液比1∶40加入pH為5.0的鹽酸溶液，在50℃下酶解2h，離心沉淀，取上清液，水浴蒸發(fā)濃縮至10mL，加入4倍體積95 %乙醇，4℃靜置過夜，4000r/min離心20min，收集沉淀，60℃真空干燥至恒重，即得粗多糖。詳見表1。

表1 不同酶最適水解參數(shù)Tab.1 Optimal hydrolysis parameters of different proteases

1.2.4 多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的測定

采用苯酚硫酸法[11]進行多糖含量測定。稱取葡萄糖10mg，配制成1.0mg/mL的葡萄糖溶液，取不同體積的該溶液，用蒸餾水水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20mg/mL的葡萄糖溶液，向EP管中依次加入葡萄糖各濃度樣品溶液250μL、苯酚溶液125μL、硫酸625μL，混合靜置30min后取出200μL加入到96孔板中，進行3次平行實驗，于490nm測定吸光度值。

1.2.4.2 樣品的多糖含量測定

向EP管中依次加入樣品溶液250μL、苯酚溶液125μL、硫酸625μL，混合靜置30min后取出200μL加入到96孔板中，進行3次平行實驗，于490nm測定吸光度值。

1.2.5 果膠酶酶解樺褐孔菌多糖的工藝優(yōu)化

1.2.5.1 單因素實驗

考查pH、添加酶的量、酶解時間以及酶解溫度對多糖含量的影響。固定反應條件添加酶的量9500U/g，酶解時間3h，酶解溫度55℃，考察不同溶液pH（2、3、4、5、6）對多糖含量的影響；固定反應條件酶解溶液的pH 4，酶解時間3h，提取溫度55℃，考察酶添加量（5500、6500、7500、8500、9500U/g）對多糖含量的影響；固定反應條件溶液的pH4，添加酶的量9500U/g，酶解溫度55℃，考察不同酶解時間（1.5、2、2.5、3、3.5h）對多糖含量的影響；固定反應條件溶液的pH4，添加酶的量9500U/g，酶解時間3h，考察不同酶解溫度（40、45、50、55、60℃）對多糖含量的影響。

1.2.5.2 正交試驗設計

正交試驗優(yōu)化果膠酶酶解樺褐孔菌多糖工藝參數(shù)，根據(jù)果膠酶最優(yōu)提取條件及單因素試驗結果，選用L9（34）正交試驗設計，探討pH（A）、酶添加量（B）、酶解時間（C）及酶解溫度（D）對多糖含量的影響，得到果膠酶酶解樺褐孔菌多糖的最佳條件。詳見表2。

表2 正交試驗因素與水平Tab.2 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.6 分析測定方法

1.2.6.1 抗氧化活性研究

1.2.6.1.1 NO清除實驗

參照文獻[12]的方法，略有改動。取1mg/mL的樺褐孔菌多糖溶液3mL，同時另取與樺褐孔菌多糖相同濃度的陽性對照姜黃素溶液3mL分別與3mL硝普鈉（5mmol/L）充分混勻，25℃下反應300min，在0、25、50、75、100、150、200、250、300min各取100μL，分別加100μL Greiss試劑后混合，于546nm波長下測定樺褐孔菌多糖對NO清除能力；甲醇溶液3mL與3mL硝普鈉（5mmol/L）充分混勻，25℃下反應300min，在0、25、50、75、100、150、200、250、300min各取100 μL，分別加100 μL Greiss試劑后混合，作為空白組。于546nm波長下檢測樣本組、陽性組和空白組的吸光度值。

1.2.6.1.2 清除·OH自由基的能力

參照[13]的方法，略有改動。樺褐孔菌多糖樣品及陽性參比溶液配制同1.2.6.1.1。配制3mM/L的FeSO4水溶液、3mM/L的過氧化氫溶液、6mM/L的水楊酸溶液備用。在50μL 3mM的FeSO4加入50μL樣品溶液以及50μL 3mM的過氧化氫溶液后混勻，靜置反應10min，再加50μL 6mM的水楊酸溶液，混勻，靜置反應30min。測定其在492nm處的吸光度值記為As，進行3次平行實驗；在50μL 3mM的FeSO4加入50μL樣品溶液以及50μL 3mM的過氧化氫溶液后混勻，靜置反應10min，再加50μL的蒸餾水，混勻，靜置反應30min。測定其在492nm處的吸光度值記為Ac；在50μL 3mM的FeSO4加入50μL蒸餾水以及50μL 3mM的過氧化氫溶液后混勻，靜置反應10min，再加50μL 6mM的水楊酸溶液，混勻，靜置反應30min。測定其在492nm處的吸光度值記為Ab；以Trolox作為陽性對照。按下列公式計算清除率。

清除率(%)=[1-(As-Ac)/Ab]×100

1.2.6.2 降糖活性研究

1.2.6.2.1 α-葡萄糖苷酶的抑制

參照[14]的方法，略有改動。樺褐孔菌多糖樣品及阿卡波糖陽性參比溶液配制均采用DMSO。配制0.1mM的PBS、5mM PNPG溶液和0.1U/mL α-葡萄糖苷酶。在96孔板中加入20μL樣品、80μL 0.1M PBS和100 μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶于25℃孵化10 min后，加入50 μL l 5 mM PNPG于25℃孵化5 min。分別在0 min、5 min時在405 nm波長下測定吸光值記為As，進行3次平行實驗；在96孔板中加入20 μL DMSO、80 μL 0.1M PBS和100 μL 0.1U/mL α-葡萄糖苷酶于25℃孵化10 min后，加入50 μL l5 mM PNPG于25℃孵化5 min。分別在0 min、5 min時在405 nm波長下測定吸光值記為Ab；以阿卡波糖作為陽性對照。按下列公式計算抑制率。

抑制率(%)=[(A5min-A0min)b-(A5min-A0min)s]/(A5min-A0min)b×100

1.2.6.2.2 α-淀粉酶的抑制

參照[15]的方法，略有改動。樺褐孔菌多糖樣品及阿卡波糖陽性參比溶液配制均采用DMSO。配制20 mM的PBS、DNS溶液、4 U/mL α-淀粉酶和0.5%（w/v）淀粉。在EP管中加入20 μL樣品、80 μL蒸餾水和100 μL 4U/mL α-淀粉酶25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μL DNS溶液加入新的EP管85℃水浴反應15 min，待冷卻至室溫后加入900 μL蒸餾水稀釋，在540 nm波長下測定吸光值記為As，進行3次平行實驗；在EP管中加入20 μL樣品、80 μL蒸餾水和100 μL PBS 25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μL DNS溶液加入新的EP管85℃水浴反應15min，待冷卻至室溫后加入900 μL蒸餾水稀釋，在540 nm波長下測定吸光值記為Ac；在EP管中加入20 μL DMSO、80 μL蒸餾水和100 μL 4U/mL α-淀粉酶25℃孵化5 min，加入200 μL 0.5%淀粉于25℃孵化3 min后，取200 μL上述混合液和100 μLDNS溶液加入新的EP管85℃水浴反應15 min，待冷卻至室溫后加入900 μL蒸餾水稀釋，在540 nm波長下測定吸光值記為Ab；以阿卡波糖作為陽性對照。按下列公式計算抑制率。

抑制率(%)=[1-(As-Ac)/Ab]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)來進行差異性顯著分析，其中P<0.05差異顯著；Office excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)處理及繪圖，每次試驗設計3個平行，結果用平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 多糖含量測定

2.1.1 葡萄糖的標準曲線，詳見圖1。

以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光值（A）為縱坐標作圖，得到標準曲線y=0.0079x-0.0588 R2=0.9991。將待測的樣品的吸光度值帶入葡萄糖標準曲線中計算提取物中的多糖含量。

2.1.2 各方法下的提取物多糖含量

如表3所示，不同方法所得的提取物多糖含量存在一定的差異。酶法提取物所得多糖含量均顯著高于水提法和堿提法，以果膠酶最優(yōu)，其次為木瓜蛋白酶和纖維素酶；與酶法提取相比，堿提法次之，水提法所得提取物多糖含量最少。故選擇酶法提取中的果膠酶酶解提取法進行后續(xù)的工藝優(yōu)化。

表3 提取物多糖含量Tab.3 Extract polysaccharide content

2.2 果膠酶酶解樺褐孔菌多糖單因素實驗結果

2.2.1 pH對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖2可以看出，樺褐孔菌多糖的含量隨著pH的增加逐漸增大，當pH 5時，達到最大值。但在此之后隨著pH值的進一步增大，反而是抑制了果膠酶酶解的效率，降低了樺褐孔菌多糖的得率。因此，在本試驗條件下，適宜的pH值為5。

2.2.2 酶添加量對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖3可以看出，隨著酶添加量的不斷增加，樺褐孔菌多糖的含量呈現(xiàn)顯著的升高趨勢（P<0.05）。在酶添加量達到9500 U/g時，樺褐孔菌多糖含量達到最大值。因此，選擇酶添加量9500 U/g時為最佳酶添加量。

2.2.3 酶解時間對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，樺褐孔菌多糖含量在1.5～2.5 h之間呈現(xiàn)下降的趨勢；但此后隨著酶解時間的增加，增加酶解時間使得樺褐孔菌多糖提取量不斷增加，在3 h時達到最高，之后延長時間提取率的變化不顯著（P＞0.05）。所以，考慮到節(jié)約資源和成本選擇適宜酶解時間為3 h。

2.2.4 酶解溫度對果膠酶酶解樺褐孔菌多糖含量的影響

由圖5可以看出，在溫度40～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，樺褐孔菌多糖含量變化不顯著（P＞0.05）。當溫度為50℃時，樺褐孔菌多糖含量達到最大值，超過50℃后，樺褐孔菌多糖含量顯著下降（P<0.05），所以選擇適宜酶解溫度為50℃。

2.3 果膠酶酶解樺褐孔菌正交試驗結果

在單因素實驗基礎上，以多糖含量為評價指標，利用正交試驗篩選出果膠酶提取樺褐孔菌多糖的最佳工藝參數(shù)，結果見表4。

表4 酶解樺褐孔菌正交試驗設計及結果Table.4 Orthogonal test design and results of enzymatic hydrolysis of Inonotus obliquus

由極差分析可得出影響果膠酶酶解樺褐孔菌工藝的主次因素為pH＞提取溫度＞酶解時間＞加酶量，最佳提取條件是A1B3C2D3，即提取pH 4、加酶量9500 U/mg、酶解時間3 h、提取溫度55℃。按最佳理論條件進行實驗，測得多糖含量（0.1598±0.013）mg Glu/g提取物。

2.4 抗氧化活性實驗結果

2.4.1 樺褐孔菌多糖清除NO的能力

樺褐孔菌多糖可有效的清除試驗體系中的NO，姜黃素溶液對NO的清除效果非常顯著，如圖6所示，與姜黃素相比，1 mg/mL的樺褐孔菌多糖在0～300 min內(nèi)清除率與樺褐孔菌多糖濃度呈劑量依賴關系，隨樺褐孔菌多糖濃度增加，清除率也逐漸升高，150～250 min時，清除率明顯增加，樺褐孔菌多糖在250 min時，清除率最高。

2.4.2 清除羥基自由基的能力

樺褐孔菌多糖對試驗體系中的羥自由基有顯著的清除作用（P<0.05），如圖7所示，Trolox溶液對羥基的清除效果非常顯著，與Trolox相比，當樺褐孔菌多糖質(zhì)量濃度小于4 mg/mL時，清除率顯著升高；當濃度大于4 mg/mL時，隨著樺褐孔菌多糖濃度增加，羥自由基的清除率變化不顯著；在5 mg/mL時達最大清除率83.44%。

2.5 降糖活性實驗結果

2.5.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

樺褐孔菌多糖對試驗體系中的α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用（P<0.05），如圖8所示，阿卡波糖溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制效果非常顯著，與阿卡波糖相比，當樺褐孔菌多糖質(zhì)量濃度小于0.25 mg/mL時，清除率顯著升高；當濃度大于0.25 mg/mL時，隨著樺褐孔菌多糖濃度增加，α-葡萄糖苷酶的抑制率緩慢升高，差異不顯著；在1 mg/mL時達最大抑制率92.15%。

2.5.2 α-淀粉酶抑制活性

樺褐孔菌多糖對試驗體系中的α-淀粉酶有顯著的抑制作用（P<0.05），如圖9所示，阿卡波糖溶液對α-淀粉酶的抑制效果非常顯著，與阿卡波糖相比，當樺褐孔菌多糖質(zhì)量濃度小于5 mg/mL時，清除率顯著升高（P<0.05）；在樺褐孔菌多糖濃度為5 mg/mL時達最大抑制率39.78%。

3 結論

果膠酶酶解最佳工藝為：提取pH 4、加酶量9500 U/g、酶解時間3 h、提取溫度55℃。經(jīng)過驗證，在此條件下的樺褐孔菌多糖含量為（0.1598±0.013）mg Glu/g提取物。多糖對NO、羥基自由基有較好的清除能力，以及對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有較好的抑制作用，顯示出了較好的抗氧化活性及降糖活性。因此，實驗所得的果膠酶的酶解條件對樺褐孔菌食品藥品的相關方向研究具有重要意義。本實驗中僅以樺褐孔菌多糖產(chǎn)物作為研究對象，進行了體外抗氧化以及降糖活性研究，并未研究其內(nèi)在的藥理功效，可進一步進行相關物質(zhì)的提取純化以及深入的藥理學試驗研究，進一步探索樺褐孔菌的藥理活性及保健功效，為今后樺褐孔菌的開發(fā)與利用提供理論基礎。