基于網(wǎng)絡藥理學探討紫河車治療卵巢功能早衰的機制研究※

童 鑫,王 菲,帥維維,唐 喆,曹 靜,孫 麗

(南京醫(yī)科大學附屬婦產醫(yī)院/南京市婦幼保健院,江蘇 南京 210004)

卵巢功能早衰(簡稱“卵巢早衰”),是女性常見的內分泌疾病之一,發(fā)病率在40歲之前為百分之一,30歲之前為千分之一,20歲之前為萬分之一[1-3]。該病以原發(fā)性閉經或40歲之前繼發(fā)性閉經為主要臨床癥狀,通常還會伴有雌激素水平低下的圍絕經期表現(xiàn),嚴重影響女性生存質量。目前,卵巢早衰的發(fā)病機制尚未明確,可能與遺傳因素、免疫因素、代謝障礙、感染因素、醫(yī)源性因素、環(huán)境內分泌干擾物、個人行為因素有關[4]。西醫(yī)多采用激素替代療法(HRT),但長期應用會增加腫瘤和血栓風險。2017年發(fā)布的《早發(fā)性卵巢功能不全的臨床診療中國專家共識》[5]指出,對于不宜接受激素治療的卵巢早衰患者,可選擇中醫(yī)藥等非激素制劑以緩解低雌激素癥狀,長期服用不會增加心血管風險。紫河車可補腎強身,調補氣血,臨床多用于氣血兩虛所致形體羸瘦、陽痿早泄、不孕癥?，F(xiàn)代藥理研究表明,紫河車富含多種甾體激素,可直接刺激卵巢組織,促進女性生殖器發(fā)育[6],被中醫(yī)用于卵巢早衰治療安全有效,但具體機制尚不完全清楚。2007年英國藥理學家HOPKINS提出網(wǎng)絡藥理學的概念[7],網(wǎng)絡藥理學的整體性、系統(tǒng)性和藥物間相互作用性等特點與中藥多成分、多靶點、多途徑的特點相互吻合,符合中醫(yī)藥對疾病本質的認識[8]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法篩選紫河車主要活性成分,運用BATMAN-TCM、GeneCards數(shù)據(jù)庫收集紫河車治療卵巢早衰的相關靶點,構建“中藥-活性成分-靶點”、靶點蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡、靶點功能通路等多層次生物信息網(wǎng)絡,篩選出關鍵靶點和通路,為進一步開展紫河車治療卵巢早衰不良反應少于HRT的機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 紫河車主要活性化合物篩選 本研究以“ZI HE CHE”為關鍵詞,通過BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)在線分析工具,默認設置Score cutoff＞20分、P-value值＜0.05,檢索藥材紫河車的化學成分和靶點。通過ADME數(shù)據(jù)庫(absorption、distribution、metabolism、excretion)篩選,得到紫河車可能活性成分及其預測靶點。

1.2 與卵巢早衰相關的靶點 通過GenCards(The Human Gene Database,https://www.genecards.org/)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man,http://omim.org/)數(shù)據(jù)庫,以“premature ovarian failure”為關鍵詞對卵巢早衰相關的疾病靶點進行檢索[9],獲取與卵巢早衰相關的疾病靶點,合并去重,統(tǒng)一為基因符號。

1.3 構建靶點蛋白互作網(wǎng)絡和中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡 將紫河車的主要活性化合物、靶點通過STRING數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,https://string-db.org/)和Cytoscape 3.9.1[10]軟件構建靶點PPI網(wǎng)絡、中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡。

1.4 GO功能、KEGG通路富集分析 為進一步了解核心靶點基因的功能和紫河車治療卵巢早衰的主要作用通路,將上述篩選得到的藥物與疾病相關的關鍵靶點輸入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),輸入靶基因名稱列表,并選定物種為“homo sapiens”,設置參數(shù)P＜0.01,靶點數(shù)(count)≥3,分別進行GO功能富集和KEGG通路注釋分析,將結果導入R3.6.0軟件,安裝colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程集包,根據(jù)DAVID統(tǒng)計結果進行GO功能、KEGG通路的可視化分析,獲得條圖和氣泡圖。

2 結果

2.1 紫河車主要活性成分篩選 通過BATMAN-TCM在線分析工具獲得紫河車的高分活性成分共16個,如17-β-雌二醇、乙醇胺、雌三烯、8-脫氧-14-脫氫-Aconosine、醛固酮等;獲得預測藥物靶點數(shù)共1 695個。見表1。

表1 紫河車中16個目標活性成分和靶點數(shù)

2.2 疾病靶點篩選 通過Genecards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫分別獲得與卵巢早衰相關的疾病靶點3 125、21個,合并、去重后得到3 146個。

2.3 藥物和疾病的交集基因 采用Draw Venny Diagram在線程序(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行去重和篩選,最終將疾病和藥物基因符號取交集獲得藥物與疾病的共同靶點。見圖1(掃描標題處二維碼查看圖片)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡 通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取靶蛋白相互作用關系,設置最高置信度(highest confidence)大于0.900生成PPI互作網(wǎng)絡圖,將藥物和疾病相映射得到342個交集靶點在STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析,結果包含342個節(jié)點,1 780條連線關系,靶蛋白平均節(jié)點度值為10.4。其中節(jié)點表示蛋白,每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系,將數(shù)據(jù)庫結果導入Cytoscape 3.9.1中進行可視化。見圖2(掃描標題處二維碼查看圖片)。使用MCODE插件進行分析,其中得分較大的EP300、AKT1、TP53、CREBBP、MAPK1、ESR1等靶蛋白均與其他蛋白相互作用較強。見圖3(掃描標題處二維碼查看圖片)。

2.5 “紫河車-活性成分-關鍵靶點-卵巢早衰”網(wǎng)絡構建 將紫河車活性成分、關鍵靶點、卵巢早衰靶點的相互作用關系導入Cytoscape 3.9.1中進行網(wǎng)絡可視化,其中淺藍色六邊形代表紫河車,綠色圓圈代表共同靶標,紫色三角代表有效成分,紅色菱形代表卵巢早衰。以degree值調節(jié)網(wǎng)絡中的節(jié)點大小,degree越高表明與該成分相關的靶點越多,邊代表靶點與活性成分之間的關系。見圖4(掃描標題處二維碼查看圖片)。

2.6 GO功能富集分析結果 根據(jù)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫篩選出30個GO生物過程。GO功能富集分析顯示,紫河車治療卵巢早衰的作用機制可能與對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、激素介導的信號通路(hormone-mediated signaling pathway)、類固醇激素介導的信號通路(steroid hormone mediated signaling pathway)等生物過程有關;與核染色質(nuclear chromatin)、轉錄因子復合體(transcription factor complex)、膜筏(membrane raft)、膜區(qū)(membrane region)等細胞成分有關;與核激素受體結合(nuclear hormone receptor binding)、轉錄共調節(jié)因子活性(transcription coregulator activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)等分子功能有關。見圖5(掃描標題處二維碼查看圖片)。

2.7 KEGG通路富集分析結果 對342個關鍵靶點,按照P＜0.05篩選富集通路,得到與卵巢早衰密切相關的關鍵生物學通路6個,包括內分泌抵抗(Endocrine resistance)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、抗葉酸(Antifolate resistance)、鉑耐藥(Platinum drug resistance)、類固醇激素的合成(Steroid hormone biosynthesis)、非同源末端連接(Non-homologous end-junction)。見圖6(掃描標題處二維碼查看圖片)。對涉及的6條通路圖使用R語言程集包進行注釋后再分析顯示,關鍵靶點顯著富集于PI3K-Akt/m TOR信號通路、ERBB信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等。代表通路圖見圖7、圖8(掃描標題處二維碼查看圖片)。

3 討論

中醫(yī)一般將卵巢早衰歸于“血枯”“早發(fā)絕經”“經斷前后諸證”范疇。中醫(yī)認為,腎藏精主導月經,腎氣與腎-天癸-沖任-胞宮軸密切相關,對應于現(xiàn)代醫(yī)學的下丘腦-垂體-卵巢-子宮性腺軸[11],可見該病致病之本為腎虛及脾虛肝郁失調,可見卵巢早衰與腎、肝、脾3個臟腑有關。

紫河車,又稱為胞衣、胎衣等,為健康產婦分娩出的胎盤加工品?！缎榆庒t(yī)案》中用其補任脈,因其含有促性腺激素和雌、孕激素,可促進乳腺和女性生殖器官的發(fā)育,調節(jié)月經周期。沖、任二脈能夠直接或間接作用于性腺軸,影響第二性征的發(fā)育,調節(jié)卵巢及子宮內膜的周期性變化[12]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法共篩選出紫河車高分活性成分16個,如雌酮、雌三醇、黃體酮、雄甾酮、雌三烯等,表明紫河車治療卵巢早衰的主要藥效基礎為多種甾體激素。西醫(yī)臨床治療卵巢早衰主要使用雌孕激素序貫療法,通過周期性補充雌孕激素,經下丘腦-垂體-卵巢性腺軸的負反饋調節(jié),降低FSH水平,恢復卵泡對促性腺激素的敏感性。長期使用激素治療,會增加女性患者子宮內膜癌、乳腺癌的發(fā)病率,增加心腦血管疾病和肺栓塞的概率,停藥后易復發(fā)[13]。本研究PPI網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn),度值較大的靶點有 EP300、CREBBP、ESR1、TP53、AKT1、MAPK1、MAPK3、PIK3CA、PIK3R1等,這些靶點可能是紫河車治療卵巢早衰的主要作用靶點。如MAPK1就是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族成員,其在包括氧化應激、DNA損傷、癌癥發(fā)展和病毒感染在內的環(huán)境應激下被激活[14]。MAPK通路大致可分為細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和應激激活蛋白激酶/c-Jun N-末端激酶(SAPK/JNK)三大類[15]。GO功能富集分析可見對類固醇激素反應、對肽激素的反應、腺體發(fā)育、脂質代謝過程的調節(jié)等生物過程在紫河車治療卵巢早衰中起到了關鍵作用。通過KEGG富集分析顯示,紫河車主要活性成分相關靶點涉及內分泌抵抗、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、抗葉酸、鉑耐藥、類固醇激素的合成、非同源末端連接等,關鍵靶點顯著富集于PI3K-Akt/m TOR信號通路、c AMP信號通路、MAPK信號通路等。

卵巢早衰源于卵泡閉鎖,很多分子都會影響卵泡的發(fā)育,細胞外的分子都需依靠信號通路的傳導才能進入細胞發(fā)揮效應,所以對信號通路進行調控,可以達到抑制細胞凋亡的作用。卵巢早衰的發(fā)生與細胞凋亡關系緊密。卵巢微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)對卵母細胞的成熟非常重要,卵母細胞分泌多種因子促進顆粒細胞的增殖,顆粒細胞產生多種物質支持卵母細胞的成熟[16]。二者共同參與調節(jié)卵泡成熟及排卵的過程,涉及的信號通路如PI3K-Akt、m TOR、MAPK 等[17]。PI3K-Akt/m TOR信號通路也是細胞增殖和凋亡的主要傳導通路之一[18]。卵母細胞中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)的過度激活可使原始卵泡過早發(fā)育及卵泡過快凋亡,進而發(fā)展成為卵巢早衰。相關文獻指出,PI3K和Akt信號通路參與卵巢早衰的發(fā)生,終止PI3K的信號可能導致原始卵泡過早發(fā)育,并過快凋亡,從而導致卵巢早衰[19]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)是PI3K-AKT軸下游的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,負責調控細胞的增殖和抑制,對卵泡的調節(jié)起重要作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn),m TOR信號通路異常對小鼠的早期胚胎發(fā)育甚至出生后的生長都有影響[21]。

本研究從網(wǎng)絡藥理學角度預測紫河車治療卵巢早衰的可能藥效成分、主要作用靶點和相關信號通路,為進一步開展紫河車治療卵巢早衰不良反應少于HRT的機制研究和藥物開發(fā)提供依據(jù)。鑒于網(wǎng)絡藥理學的局限性,后期須對主要活性成分、關鍵靶點和通路進行驗證。