血漿外泌體circRNA診斷HCC聯(lián)合檢測模型的建立與驗(yàn)證

孟 俊，王俊青，費(fèi)曉春，顧志冬

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院普外科，上海 200025；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院病理科，上海 200025）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一。由于HCC臨床癥狀出現(xiàn)較晚，缺乏敏感的生物標(biāo)志物用于早期診斷[1]，因此大多數(shù)患者在確診時已處于疾病晚期。目前，臨床上亟需可用于早期篩查和診斷HCC的新型標(biāo)志物。外泌體是一種極具應(yīng)用前景的新型液體活檢靶標(biāo)，其作為一種細(xì)胞間信號傳遞的關(guān)鍵“中介”，在包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。目前，關(guān)于外泌體在HCC早期診斷中的研究仍較少。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種單鏈共價閉合的RNA。外泌體中含量較為豐富的非編碼RNA是微小RNA（microRNA，miRNA）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA），近年來發(fā)現(xiàn)circRNA也廣泛存在于外泌體中，這為進(jìn)一步挖掘外泌體功能及作用機(jī)制提供了新的研究方向。由于circRNA具有強(qiáng)大的抗降解能力，因此具有巨大的臨床應(yīng)用潛力[3]。GE等[2]的研究結(jié)果顯示，circRNA與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，且可穩(wěn)定地從患者外周血外泌體中富集。這表明檢測外泌體circRNA或可作為一種全新的肝癌早期診斷策略。本研究擬通過尋找HCC患者差異表達(dá)的circRNA，建立全新的、可用于HCC診斷的外泌體circRNA模型，并探討該模型在HCC診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2019年6月上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院接受根治性切除術(shù)的HCC患者256例（HCC組），根據(jù)入組時間，將HCC患者分為發(fā)現(xiàn)集（25例）、訓(xùn)練集（126例）和驗(yàn)證集（105例）。選取同期上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院確診為乙型肝炎相關(guān)肝硬化患者100例（肝硬化組），其中訓(xùn)練集50例、驗(yàn)證集50例。另選取同期上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院健康體檢者125名作為正常對照組，其中發(fā)現(xiàn)集25名、訓(xùn)練集50名、驗(yàn)證集50名。除性別外，訓(xùn)練集和驗(yàn)證集HCC患者臨床病理參數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 訓(xùn)練集與驗(yàn)證集HCC患者臨床病理參數(shù)比較 例

1.2 入選和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 入選標(biāo)準(zhǔn) （1）HCC組：符合HCC病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡≥18周歲，既往無其他惡性腫瘤病史，接受根治性切除術(shù)且臨床各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和病理檢查資料完整。（2）肝硬化組：既往有慢性乙型肝炎病史，影像學(xué)診斷明確具有肝硬化改變但無肝占位性病變。（3）正常對照組：體格檢查均正常，無乙型肝炎病史，無惡性腫瘤病史，實(shí)驗(yàn)室檢查無異常。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）HCC組：既往有惡性腫瘤病史，同時合并其他惡性腫瘤，臨床資料不完整，術(shù)后病理檢查證實(shí)非HCC，影像學(xué)資料缺失，拒絕簽署知情同意書。（2）肝硬化組：既往有惡性腫瘤病史，存在肝臟占位性病變，合并其他病毒性肝炎，肝硬化影像學(xué)診斷不明確。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集 收集所有HCC患者術(shù)前一般資料（年齡、性別、術(shù)前診斷、既往病史、腹水情況、肉眼癌栓、術(shù)前肝腎功能指標(biāo)、乙型肝炎病毒感染狀態(tài)、AFP、癌胚抗原水平等）和術(shù)后臨床病理資料（肝硬化、腫瘤數(shù)、腫瘤大小、鏡下癌栓、衛(wèi)星灶、包膜完整性、病理分級等）。所有術(shù)前血漿樣本均在患者治療前采集。

1.3.2 外泌體分離 采集所有對象外周血樣本6 mL，乙二胺四乙酸抗凝，2 h內(nèi)1 200×g離心10 min，分離血漿，保存于-80 ℃，10 d內(nèi)統(tǒng)一完成外泌體的分離和核酸的抽提、逆轉(zhuǎn)錄，并將模板凍存于-80 ℃。采用Invitrogen總外泌體分離試劑盒（美國Invitrogen公司）分離血漿外泌體，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。簡要步驟：將凍存的血漿2 000×g離心20 min，以去除細(xì)胞碎片，在2 mL血漿樣本中加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）和600 μL外泌體分離試劑，混勻，4 ℃靜置30 min，然后4 ℃ 15 000×g離心5 min，去除上清液，即獲得外泌體沉淀。

1.3.3 circRNA檢測 使用Arraystar circRNA芯片（美國ARRASTAR公司）鑒定肝癌細(xì)胞系Hep3B和正常肝細(xì)胞系L02（購自中科院細(xì)胞庫）的外泌體來源circRNA表達(dá)的差異，用于后續(xù)發(fā)現(xiàn)集篩選。嚴(yán)格按說明書操作。

1.3.4 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測 使用Trizol試劑（美國ThermoFisher Scientific公司）提取外泌體總RNA。使用Prime-Script RT試劑盒（日本TaKaRa公司）對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。采用ABI 7500 PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）及SYBR試劑盒（日本TaKaRa公司）對特定circRNA的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。在發(fā)現(xiàn)集階段，采用2-ΔCq法對靶circRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量，以GAPDH為內(nèi)參基因[5]。其中ΔCq靶circRNA=Cq靶circRNA-CqGAPDH。在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集階段，根據(jù)2-ΔΔCq方法確定特定外泌體circRNA的表達(dá)水平，其中ΔΔCq=（ΔCq靶circRNA-正常對照組的平均ΔCq）。引物序列：c i r c_0 0 0 0 6 9 0 正向引物為5'-GAGACCCTCCACAAATTTGCA-3'，反向引物為5'-CCTCCCGGAACACCTCTG-3'；circ_0001359 正向引物為5'-CCTGGAATCACGAAGCACAG-3'；反向引物為5'-GTTGGGTAATACTGCCGCTG-3'；circ_0000396 正向引物為5'-CCTGGCAAACACTGGAATCC-3'，反向引物為5'-CAGCAAGCAGAGACGATCAC-3'；GAPDH 正向引物為5'- AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，反向引物為5'- GCCCAATACGACCAAATCC-3'。

1.3.5 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 采用全蛋白提取試劑盒（江蘇凱基公司，目錄號KGP2100）提取血漿總蛋白。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，試劑盒購自美國ThermoFisher Scientific公司。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對樣本中的蛋白進(jìn)行分離，采用濕轉(zhuǎn)法（300 mA、120 min）將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，然后在4 ℃下與兔抗人CD9、CD63、CD81、Alix以及Calnexin抗體（美國Abcam公司，1∶500稀釋）孵育過夜。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（上海碧云天公司）孵育2 h，最后采用超敏化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用非配對Student t檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價不同circRNA診斷HCC的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞系Hep3B和正常細(xì)胞系L02外泌體circRNA表達(dá)的差異

與正常細(xì)胞系L02比較，肝癌細(xì)胞系Hep3B中有102個exo-circRNA表達(dá)升高（P＜0.05）。將102個差異表達(dá)的外泌體circRNA與exoRBase數(shù)據(jù)庫中的HCC患者外周血外泌體cricRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，鑒定出4個在HCC患者血漿外泌體中表達(dá)量升高的circRNA，分別為circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396和circ_0000722。見圖1。

圖1 HCC患者外周血高表達(dá)外泌體circRNA篩選結(jié)果

2.2 HCC組、肝硬化組和正常對照組外泌體分離及circRNA表達(dá)的比較

免疫印跡法結(jié)果顯示，HCC組、肝硬化組和正常對照組血漿樣本均高表達(dá)CD9、CD63、CD81和Alix 4種外泌體標(biāo)志物，無外泌體陰性標(biāo)志物Calnexin表達(dá)。提示外泌體分離成功。見圖2。

圖2 血漿外泌體分離效果的免疫印跡法鑒定結(jié)果

采用RT-qPCR檢測HCC組和正常對照組發(fā)現(xiàn)集血漿外泌體中circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396和circ_0000722的表達(dá)量。結(jié)果顯示，HCC組血漿外泌體中circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396的相對表達(dá)量顯著高于正常對照組（P＜0.05），circ_0000722相對表達(dá)量在2個組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 HCC組與正常對照組發(fā)現(xiàn)集4種血漿外泌體circRNA相對表達(dá)量的比較

2.3 HCC組、肝硬化組、正常對照組訓(xùn)練集和驗(yàn)證集隊(duì)列中circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396的表達(dá)情況

無論是訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集，H C C組circ_0000690相對表達(dá)量均高于肝硬化組和正常對照組（P＜0.001）；正常對照組、肝硬化組、HCC組circ_0001359相對表達(dá)量依次升高（P＜0.05）；HCC組與肝硬化組之間circ_0000396相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但均高于正常對照組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 HCC組、肝硬化組、正常對照組訓(xùn)練集和驗(yàn)證集隊(duì)列中circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396的表達(dá)情況

2.4 基于 circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396的HCC診斷模型的構(gòu)建

采用Logistic回歸分析建立基于circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396診斷HCC的聯(lián)合檢測模型為：Logit（P）=1.110×circ_0000690+0.822×circ_0001359+0.622×circ_0000396-4.153。

無論是訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集，HCC組聯(lián)合檢測模型的概率值均高于肝硬化組及正常對照組（P＜0.05），肝硬化組則高于正常對照組（P＜0.05）。早期HCC患者（巴塞羅那分期0+A期）聯(lián)合檢測模型的概率值與HCC患者整體的概率值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 HCC組、肝硬化組、正常對照組聯(lián)合檢測模型概率值的比較

2.5 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷HCC的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷H C C的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.802、0.726、0.621、0.859，診斷早期HCC的AUC分別為0.767、0.698、0.611、0.847。聯(lián)合檢測模型診斷HCC的效能優(yōu)于AFP（P＜0.05）。見表2、表3和圖6。

圖6 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷訓(xùn)練集中HCC的ROC曲線

表2 各項(xiàng)指標(biāo)診斷訓(xùn)練集HCC的ROC曲線參數(shù)

表3 各項(xiàng)指標(biāo)診斷訓(xùn)練集早期HCC的ROC曲線參數(shù)

2.6 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷HCC的驗(yàn)證

ROC曲線分析結(jié)果顯示，在驗(yàn)證集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷HCC的AUC分別為0.752、0.663、0.615、0.847，診斷早期HCC的AUC分別為0.763、0.673、0.591、0.845。聯(lián)合檢測模型診斷HCC的效能優(yōu)于AFP（P＜0.05）。見表4、表5和圖7。

表4 各項(xiàng)指標(biāo)診斷驗(yàn)證集HCC的ROC曲線參數(shù)

表5 各項(xiàng)指標(biāo)診斷驗(yàn)證集早期HCC的ROC曲線參數(shù)

圖7 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷驗(yàn)證集HCC的ROC曲線

2.7 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷AFP陰性HCC的效能

將AFP＜20 ng/mL定義為AFP陰性。ROC曲線分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC分別為0.810、0.695、0.588、0.894；診斷AFP陰性早期HCC的AUC分別為0.786、0.672、0.574、0.877。見表6、表7和圖8。

圖8 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷訓(xùn)練集AFP陰性HCC的ROC曲線

表6 各項(xiàng)指標(biāo)診斷訓(xùn)練集AFP陰性HCC的ROC曲線參數(shù)

表7 各項(xiàng)指標(biāo)診斷訓(xùn)練集AFP陰性早期HCC的ROC曲線參數(shù)

在驗(yàn)證集中，circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC分別為0.702、0.670、0.641、0.840；診斷AFP陰性早期HCC的AUC分別為0.747、0.669、0.587、0.846。見表8、表9和圖9。

圖9 circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測模型診斷驗(yàn)證集AFP陰性HCC的ROC曲線

表8 各項(xiàng)指標(biāo)診斷驗(yàn)證集AFP陰性HCC的ROC曲線參數(shù)

表9 各項(xiàng)指標(biāo)診斷驗(yàn)證集AFP陰性早期HCC的ROC曲線參數(shù)

3 討論

近年來，越來越多的學(xué)者致力于探索外泌體在腫瘤中的診斷潛力，外泌體circRNA在腫瘤診斷和預(yù)后評估中的作用引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注[5]。外泌體可有效保護(hù)內(nèi)含的circRNA免受RNA酶降解，維持其穩(wěn)定性和完整性[6]。因此，外泌體circRNA被認(rèn)為是多種實(shí)體腫瘤早期診斷和預(yù)后評估的理想生物標(biāo)志物。已有多項(xiàng)研究證實(shí)血漿外泌體circRNA可用于胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤的診斷[7]。對于肝癌，已有少量研究提示外泌體circRNA可作為潛在的診斷標(biāo)志物。LYU等[8]的研究結(jié)果顯示，血漿circ_0070396可用于肝癌的診斷。SUN等[9]報道了1種可用于肝癌診斷的包含3個外泌體circRNA（hsa_circ_0004001、hsa_circ_0004123、hsa_circ_0075792）的分子組合。但這些研究尚存在一定的不足，如單個標(biāo)志物相對于AFP診斷效能提高不顯著、樣本量較小（＜100例）、缺乏獨(dú)立驗(yàn)證等。本研究納入較大樣本量，構(gòu)建了一個含3種circRNA（circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396）的HCC診斷聯(lián)合檢測模型。該模型診斷HCC的AUC為0.886，敏感性為76.98%，特異性為87.00%，具有較好的診斷效能；獨(dú)立驗(yàn)證結(jié)果顯示，本研究建立的聯(lián)合檢測模型可用于HCC的診斷。但本研究用于建立聯(lián)合檢測模型的3種circRNA在肝癌中的生物學(xué)作用及其臨床價值目前尚未見報道，其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明確。

目前，AFP仍是HCC診斷中應(yīng)用最廣泛的生物標(biāo)志物，但AFP的敏感性較低，特別是在早期肝癌中，特異性也不足，有近20%的肝硬化患者AFP異常升高，且此升高現(xiàn)象與惡性腫瘤的發(fā)生無顯著相關(guān)性[10]。因此，臨床亟需一種診斷肝癌較為靈敏的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，基于3種circRNA建立的聯(lián)合檢測模型在AFP陰性HCC患者中的陽性率（敏感性）與肝癌患者整體陽性率（敏感性）基本一致，在訓(xùn)練集中，聯(lián)合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC為0.894，敏感性為81.25%，特異性為87.00%；在驗(yàn)證集中，聯(lián)合檢測模型診斷AFP陰性HCC的AUC為0.840，敏感性為74.47%，特異性為90.00%。提示聯(lián)合檢測模型對AFP陰性HCC具有良好的診斷效能。

難以早期診斷是目前肝癌預(yù)后不良的重要原因[11]。準(zhǔn)確的早期診斷可大大提高肝癌患者行根治性切除術(shù)的比例，切實(shí)提高臨床療效。然而，目前臨床仍缺乏有效的肝癌早期診斷策略。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練集中，基于 circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396建立的聯(lián)合檢測模型診斷早期HCC的AUC為0.859；在驗(yàn)證集中，聯(lián)合檢測模型診斷早期HCC的AUC為0.847。由此可見，聯(lián)合檢測模型對早期HCC有較好的診斷效能。

無論是對早期HCC，還是對APF陰性HCC，本研究建立的聯(lián)合檢測模型均表現(xiàn)出較好的診斷效能。由于本研究入組的肝硬化患者例數(shù)較少，后續(xù)將納入更多的肝硬化患者，并開展前瞻性研究，觀察聯(lián)合檢測模型在預(yù)測肝癌早期發(fā)生中的價值。此外，由于本研究納入的3種外泌體circRNA（circ_0000690、circ_0001359、circ_0000396）的生物學(xué)功能尚不明確。因此，闡明這3種circRNA的來源，并研究其生物學(xué)功能也將是下一步研究的目標(biāo)。

本研究尚存在一些局限之處：（1）入組的患者例數(shù)雖然較多，但仍顯不足，需要納入更多的HCC患者來進(jìn)一步驗(yàn)證本研究得出的結(jié)果；（2）納入的HCC患者多為乙型肝炎相關(guān)肝癌，因此需要納入不同疾病背景的肝癌患者，以確認(rèn)聯(lián)合檢測模型的普適性；（3）考慮到乙型肝炎相關(guān)肝硬化是乙型肝炎患者發(fā)生肝癌過程中至關(guān)重要的一項(xiàng)病理生理性改變，而乙型肝炎相關(guān)肝硬化是肝癌發(fā)生的重要危險因素，因此在未來的研究中將納入更多的慢性乙型肝炎（無肝硬化）患者，從而對本研究結(jié)果進(jìn)行更為細(xì)致的分層驗(yàn)證。

綜上所述，基于3種circRNA（circ_0000690、circ_0001359和circ_0000396）構(gòu)建的聯(lián)合檢測模型對HCC具有較好的診斷效能，亦適用于早期HCC和AFP陰性HCC的鑒別診斷，有助于提升臨床對HCC的診斷和鑒別診斷效率，有利于改善HCC患者的預(yù)后。此外，在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步圍繞這3個外泌體circRNA進(jìn)行分析，旨在明確其生物學(xué)功能，從而為肝癌的治療提供全新靶點(diǎn)。