加味六安煎對咳嗽變異性哮喘豚鼠肺組織病理及輔助性T細(xì)胞1、2類細(xì)胞因子的影響

張葉 李盼盼 吳力群 陳海鵬 霍婧偉 徐方蔚 張寧寧 路晨 陳宇航 廖欣婷

摘要 目的：觀察加味六安煎對咳嗽變異性哮喘豚鼠肺組織病理及輔助性T細(xì)胞1、2類細(xì)胞因子水平的影響，探討免疫相關(guān)作用機(jī)制。方法：將30只雄性豚鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、孟魯司特鈉組、中藥低中高劑量組。除對照組外均腹腔注射卵蛋白及氫氧化鋁致敏后用卵蛋白霧化激發(fā)，建立咳嗽變異性哮喘（CVA）模型，相應(yīng)給藥處理。觀察肺組織病理形態(tài)變化，檢測CVA豚鼠肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-12（IL-12）、白細(xì)胞介素-13（IL-3）。結(jié)果：光鏡：CVA模型豚鼠較正常組支氣管平滑肌增生肥厚，肺組織充血水腫，體積增大，周圍炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞及黏液栓增多，肺泡擴(kuò)張、塌陷;觀察組較模型組肺組織充血水腫、平滑肌增生肥厚及黏液栓等情況均不同程度減輕。透射電鏡：模型組較正常組肺泡壁增厚、肺間質(zhì)充血明顯，Ⅱ型肺泡上皮絨毛脫落，線粒體數(shù)量減少，部分腫脹。觀察組較模型組肺泡壁增厚、肺泡上皮絨毛脫落程度輕，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量多。肺泡灌洗液（BALF）：模型組較正常組IL-12降低，IL-13升高，IL-12/IL-13下降但不顯著;觀察組較模型組IL-12均上升，其中中藥中、高劑量組上升顯著;IL-13降低但不顯著，IL-12/IL-13均上升，中藥中、高劑量組升高明顯。結(jié)論：加味六安煎能減少CVA豚鼠炎癥細(xì)胞浸潤，減輕肺組織充血水腫及平滑肌增生肥厚，其作用機(jī)制可能與改善IL-12及IL-13水平，調(diào)控輔助性T細(xì)胞1、2免疫失衡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 加味六安煎;咳嗽變異性哮喘;豚鼠;肺泡灌洗液;肺組織病理;白細(xì)胞介素-12;白細(xì)胞介素-13;輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2

Abstract Objective：To observe the effects of Modified Liu′an Decoction on lung histopathology and Th1/Th2 cytokine levels of guinea pigs with cough variant asthma（CVA），and to explore its immune-related mechanism.Methods：A total of 30 male guinea pigs were randomly divided into a normal control group，a CVA model group，a montelukast sodium group，and a modified Liuan Decoction low，medium and high dose groups.Ovalbumin and aluminum hydroxide was injected intraperitoneally for sensitization，and the CVA model was established by egg protein atomization stimulation.Each group was given corresponding administration treatment，with the exception of the normal control group.The pathological changes of lung tissue were observed，and the levels of interleukin 12（IL-12） and interleukin 13（IL-13） in the CVA guinea pigs′ alveolar lavage fluid（BALF） were measured.Results：Observation under light microscopy：Compared with the normal group，the CVA model guinea pig presented with bronchial smooth muscle hyperplasia，lung tissue congestion and edema.There was also an increased volume，inflammatory cell infiltration in the surroundings，increase in goblet cells and mucus plugs，alveolar expansion and collapse.Compared with the CVA model group，the conditions of lung tissue congestion and edema，smooth muscle hyperplasia and mucus embolism in each drug intervention group were reduced to varying degrees.Observation under transmission electron microscope：Compared with the normal group，the alveolar wall of the CVA model group thickening and interstitial congestion were significant.In addition，there was a loss of type Ⅱ alveolar epithelial villi and a decrease in the number of mitochondria with and some swelling.The alveolar walls of each treatment group had varying degrees of thickening but not as severe as the model group.The loss of alveolar epithelial villi was lesser than that of the model group，and the number of mitochondria in the cytoplasm was greater than that of the model group.BALF：Compared with the normal group，IL-12 decreased，IL-13 increased and IL-12/IL-13 decreased but not significantly in the model group; Compared with the model group，IL-12 in the treatment group increased significantly，especially in the medium and high dose groups; IL-13 decreased but not significantly，IL-12/IL-13 increased，especially in medium and high dose groups.Conclusion：Modified Liu′an Decoction can reduce inflammatory cell infiltration in CVA guinea pigs，reduce lung congestion，edema，and smooth muscle hypertrophy.Its mechanism may be related to the improvement in IL-12 and IL-13 levels，as well as the regulation of Th1/Th2 immune imbalance.

Keywords Modified Liuan Decoction; Cough variant asthma; Guinea pigs; Alveolar lavage fluid; Lung histopathology;Interleukin 12; Interleukin 13;Th1/Th2

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.014

咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）是一個特殊的哮喘類型，是慢性咳嗽的主要病因，約占41.95%，近年其患病率呈上升趨勢，未經(jīng)治療的患者約30%可發(fā)展為典型哮喘[1-3]。CVA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與典型哮喘相似，具有慢性非特異性氣道炎癥反應(yīng)，其氣道炎癥與免疫紊亂之間關(guān)系密切，主要表現(xiàn)為輔助性T細(xì)胞1（Th1）/輔助性T細(xì)胞2（Th2）比例失衡。白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-12、IL-13分屬于Th1和Th2的細(xì)胞因子，二者水平變化影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能。本課題組前期研究表明加味六安煎治療CVA患兒臨床療效可觀[4]，并經(jīng)動物實驗證實加味六安煎可以減少CVA大鼠咳嗽次數(shù)，減輕氣道炎癥[5]，改善氣道重塑[6]，但其作用機(jī)制在免疫調(diào)節(jié)方面研究尚不明確。本研究通過觀察加味六安煎對CVA豚鼠肺組織病理影響，分析肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中IL-12、IL-13水平變化，探討其治療CVA對免疫調(diào)節(jié)方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取4周齡健康清潔級雄性Hartley豚鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京2016-0011）]。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：P2018053），于室溫（23±2）℃，濕度50%～60%環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水與進(jìn)食。

1.1.2 藥物 加味六安煎（組成包括法半夏6 g、茯苓6 g、杏仁6 g、橘紅6 g、海浮石20 g、白芥子6 g、膽南星4 g、瓜蔞10 g、炒萊菔子10 g、葶藶子6 g），配制成濃度分別為0.74 g/mL、1.48 g/mL、2.22 g/mL的溶液（低、中、高劑量組），分別相當(dāng)于體質(zhì)量70 kg成人用量的5倍、10倍、15倍，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室制備;孟魯司特鈉（規(guī)格4 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，生產(chǎn)批號：N007972），用0.9%氯化鈉溶液配制成混懸液，于4 ℃冰箱保存。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白（Ovalbumin，OVA，北京索萊寶科技有限公司，生產(chǎn)批號：421C033）、氫氧化鋁（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號：20131125）、0.9%氯化鈉溶液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：53101968）、水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：30037516）、磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9061）、甲醇溶液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號：10014108）、霧化器（飛利浦Philips公司，型號：Sami型）、離心機(jī)（Sigma，型號：3K18）、透射電鏡[日立（中國）有限公司，型號：H-600]、白細(xì)胞介素12、13酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：EIA-2693、EIA-2634）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取健康豚鼠30只，按照隨機(jī)數(shù)表法分為6組，每組5只。A組，正常組;B組，模型組;C組，西藥組;D組，低劑量加味六安煎組;E組，中劑量加味六安煎組;F組，高劑量加味六安煎組。上述方法正常飼養(yǎng)3 d后開始實驗。除A組外，其余各組每只豚鼠均在第1、8天進(jìn)行腹腔注射10% OVA和AL（OH）3混合溶液1 mL致敏。自第15天起，B、C、D、E、F組豚鼠予以1%OVA溶液超聲霧化激發(fā)2 min，1次/d，共10 d。激發(fā)時觀察豚鼠反應(yīng)，如出現(xiàn)咳嗽、豎毛、噴嚏、干嘔、呼吸困難、極度煩躁等現(xiàn)象中2種和（或）以上，或抽搐、虛脫現(xiàn)象之一者，判定為造模成功。

1.2.2 干預(yù)方法 各組給藥劑量按人與豚鼠體表面積換算公式計算。激發(fā)之日即從實驗的第15天開始，用霧化器激發(fā)前30 min，各組分別藥物灌胃干預(yù)，共治療10 d。A組：不作處理。B組：灌服0.9%氯化鈉溶液1.7 mL/（100 g·d）。C組：灌服孟魯司特鈉混懸液1.2 mg/kg。D組：灌服低濃度加味六安煎溶液，1.7 mL/（100 g·d）。E組：灌服中濃度加味六安煎溶液，1.7 mL/（100 g·d）。F組：灌服高濃度加味六安煎溶液，1.7 mL/（100 g·d）。各組均為1次/d，連續(xù)灌胃10 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 細(xì)胞因子檢測 豚鼠予以10 mg/kg水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，夾板固定后打開胸腔，行氣管插管術(shù)后結(jié)扎右肺，使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）分3次行支氣管肺泡灌洗，每次2 mL PBS，并回收BALF。以3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，離心后留取上清液置-20 ℃冰存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測BALF中IL-12、IL-13含量。嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書提供方法進(jìn)行檢測操作。

1.2.3.2 光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 豚鼠予以10 mg/kg水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，迅速打開胸腔，暴露肺部及心臟，取出肺組織，放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤情況，支氣管黏膜、上皮細(xì)胞以及肺泡損害情況，基底膜、平滑肌以及杯狀細(xì)胞增生情況等病理變化。

1.2.3.3 透射電鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 上述操作后取1 mm×1 mm×1 mm大小的肺組織放入2.5%戊二醛中固定，制備電鏡標(biāo)本。用透射電鏡觀察肺組織上皮細(xì)胞、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布，方差齊性，選擇單因素方差分析，否則采用非參數(shù)秩和檢驗中Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CVA豚鼠肺組織病理變化

2.1.1 光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 正常組豚鼠支氣管黏膜光滑完整，管腔通暢，肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見平滑肌層及管壁增厚，無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。CVA模型組豚鼠支氣管黏膜充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，基底膜增生、肥厚，氣管腔內(nèi)黏液栓，上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，肺泡擴(kuò)張塌陷。與模型組比較，各藥物干預(yù)組病理變化均有不同程度的減輕，鏡下可見黏膜充血水腫減輕，炎癥細(xì)胞減少，管腔內(nèi)黏液減少，基底膜變薄，杯狀細(xì)胞及上皮細(xì)胞減少。見圖1。

2.1.2 透射電鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 正常組肺泡壁未見增厚，肺泡間質(zhì)血管豐富、充血。肺泡上皮細(xì)胞絨毛豐富、完整。胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的板層小體。線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體均正常。模型組肺泡壁明顯增厚，肺間質(zhì)血管充血明顯，Ⅱ型肺泡上皮絨毛脫落，線粒體數(shù)量減少，部分出現(xiàn)腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體豐富。各觀察組肺泡壁均有不同程度的增厚但不如模型組重，肺泡上皮絨毛脫落較模型組輕，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量較模型組多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體變化不明顯。見圖2。

2.2 CVA豚鼠BALF中IL-12及IL-13水平變化 經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗，CVA豚鼠模型組與正常組、中藥各劑量組之間、中藥組與西藥組IL-12水平，模型組與給藥干預(yù)組、加味六安煎各劑量組間、中藥組與西藥組之間IL-13水平，模型組與正常組、加味六安煎各劑量組間、中藥組與西藥組之間IL-12/IL-13比值，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）;與模型組比較，各觀察組IL-12水平、IL-12/IL-13比值均有所升高，其中中藥組中、高劑量組IL-12水平升高，正常組IL-13水平較低，中藥組中、高劑量組L-12/IL-13比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。見表1。

3 討論

中醫(yī)學(xué)并無CVA病名，歷代醫(yī)家根據(jù)CVA主要臨床表現(xiàn)將其歸為“哮咳”“風(fēng)咳”“咳嗽”等范疇。其主要病機(jī)為內(nèi)有“伏痰”，外邪引動，內(nèi)外相合而發(fā)之，痰飲內(nèi)伏為咳嗽之根本，可見“伏痰”在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用?！逗娱g六書》指出“治咳者，治痰為先”。導(dǎo)師吳力群教授稟承從痰論治思想，選用《景岳全書·新方八陣》中的六安煎，并遵循小兒生理特點及病邪傳變性質(zhì)進(jìn)行化裁，摒棄生姜辛溫散寒之品，加用海浮石、瓜蔞、膽南星、葶藶子等清肺化痰之藥;其中半夏、陳皮、茯苓可健脾、燥濕、化痰，杜生痰之源，杏仁、白芥子、萊菔子既可調(diào)暢氣機(jī)又有豁痰止咳之功，以“健脾化痰，清肺降氣”為基本治則辨治CVA。

CVA屬于慢性非特異性氣道炎癥，其發(fā)病機(jī)制與典型哮喘相似，主要由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同參與所致，其中嗜酸性粒細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞，其增殖、分化、成熟、浸潤等與慢性炎癥的病理過程相關(guān)[7]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)失衡在CVA發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，主要表現(xiàn)為Th1型細(xì)胞因子釋放減少、Th2型細(xì)胞因子增加，Th1/Th2細(xì)胞因子比例失衡與CVA疾病的進(jìn)展關(guān)系密切。Th2可以直接調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的活化，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[8]。IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等在氣道內(nèi)滲出，從而引起氣道黏膜水腫、支氣管平滑肌痙攣、氣道氣流受限，是促使某些細(xì)胞因子對氣道上皮損傷而發(fā)生病理變化的重要因素[9]。梁冰紅[10]研究顯示，CVA患兒血清中IL-13表達(dá)水平明顯增高，可能通過參與某種機(jī)制或通路調(diào)控兒童CVA的發(fā)生、發(fā)展。此外亦有研究表明CVA大鼠模型中IL-13水平明顯增高，給予藥物干預(yù)后可抑制IL-13在模型大鼠中的過度表達(dá)[11]。本研究顯示：CVA豚鼠模型組IL-13水平明顯高于正常對照組，各觀察組經(jīng)藥物干預(yù)后IL-13水平明顯降低，與既往研究相符合，加味六安煎高劑量組降低最明顯，但各觀察組之間IL-13水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-12主要由Th1細(xì)胞分泌可上調(diào)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的γ干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生，促進(jìn)Th1反應(yīng)，抑制Th2細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。IL-12能抑制B細(xì)胞合成IgE，減少嗜酸性粒細(xì)胞向氣道內(nèi)浸潤，其水平下降是哮喘炎癥反應(yīng)的重要特征[13-14]。既往研究表明哮喘患兒和模型小鼠血清中IL-12水平均較正常組降低，經(jīng)布地奈德治療后均有所升高[15]。本研究中CVA豚鼠模型組IL-12表達(dá)水平較正常組降低，藥物干預(yù)后各觀察組IL-12水平均較模型組有所升高，且中藥組中、高劑量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)研究表明CVA、哮喘等疾病患者體內(nèi)存在不同程度的免疫功能異常，且與Th1/Th2細(xì)胞比例異常，免疫功能失衡有關(guān)[16-17]。研究提示CVA患兒體內(nèi)存在Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，與疾病進(jìn)展和反復(fù)發(fā)作關(guān)系密切[18]。Th1和Th2類細(xì)胞因子之間相互制約，通過達(dá)到動態(tài)平衡維持機(jī)體免疫功能，糾正Th1/Th2細(xì)胞免疫功能紊亂有助于減輕氣道炎癥反應(yīng)[19]。本研究分別選取Th1和Th2類細(xì)胞因子中IL-12、IL-13，通過觀察二者之間水平的變化，觀察加味六安煎對CVA模型豚鼠Th1/Th2免疫平衡調(diào)節(jié)。研究結(jié)果顯示CVA模型豚鼠與正常組比較，BALF中IL-13水平升高，IL-12水平下降，表明CVA模型豚鼠存在Th1/Th2失衡，與CVA發(fā)病機(jī)制中Th2細(xì)胞過度分化相符合[20]。經(jīng)加味六安煎治療后中、高劑量組的IL-12水平明顯上升，IL-13水平下降，IL-12/IL-13比值明顯升高，加味六安煎中、高劑量組尤為顯著（P<0.05），表明加味六安煎對Th1/Th2失衡狀態(tài)具有調(diào)節(jié)作用。氣道炎癥細(xì)胞釋放各種炎癥反應(yīng)的自由基，如過氧化氫和一氧化氮，自由基易損傷線粒體，致其超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而線粒體的損傷也會增加氣道炎癥，二者之間相互作用[21-22]。線粒體損傷在氣道炎癥和氣道重塑之間起橋梁作用，抑制其損傷可減少上皮細(xì)胞損傷，抑制氣道重塑[23]。通過光鏡和透射電鏡觀察CVA模型豚鼠肺組織病理變化顯示支氣管黏膜充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，基底膜增生、肥厚等，肺泡壁明顯增厚，肺間質(zhì)血管充血明顯，Ⅱ型肺泡上皮絨毛不明顯，線粒體數(shù)量減少，經(jīng)加味六安煎干預(yù)后CVA豚鼠支氣管黏膜充血水腫減輕，炎癥細(xì)胞減少，基底膜變薄，肺泡壁增厚不明顯，線粒體數(shù)量多于模型組等。

綜上所述，加味六安煎可以明顯減輕CVA豚鼠肺組織支氣管黏膜充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤程度，減緩肺泡壁增厚情況，從而減少胞質(zhì)內(nèi)線粒體的損傷，其可能通過升高機(jī)體IL-12水平，降低IL-13水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡，減輕氣道炎癥，從而抑制氣道重塑，發(fā)揮治療CVA的作用。但本研究僅檢測CVA豚鼠BALF中IL-12、IL-13水平，關(guān)于加味六安煎對CVA豚鼠及CVA患兒血清中IL-12、IL-13水平的影響仍需要進(jìn)一步探索。

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（2021-04-13收稿 本文編輯：王明）