石生黃堇種子生理及萌發(fā)特性△

于尚平，郭巧生*，趙開軍，刁和芳，劉麗，劉暢，景定坤，朱瑩瑩

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材研究所，江蘇 南京 210095；

2.南京中山制藥有限公司，江蘇 南京 210000

巖黃連為罌粟科紫堇屬植物石生黃堇Corydalis saxicolaBunting.的全草，味苦，性涼，具有清熱解毒、利濕、止痛止血之功效，主治肝炎、口舌糜爛、火眼等[1-2]，是廣西西北山區(qū)治療肝炎和肝硬化等疾病的常用藥[3]。目前，對(duì)其研究主要集中在化學(xué)成分、藥理方面，在種植栽培方面只有一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。例如，蔣水元等[4]對(duì)不同品種、著生部位、貯藏方法的石生黃堇種子進(jìn)行初步探索研究；李翠等[5]在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)石生黃堇種子僅在收獲后3 個(gè)月內(nèi)有活力，種子萌發(fā)率只有15%～30%；陳曉英等[6]對(duì)石生黃堇光合特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究；王冬梅等[7]初步探索了藥材產(chǎn)地加工方法對(duì)巖黃連品質(zhì)的影響。對(duì)種子萌發(fā)特性、資源分布、生長發(fā)育規(guī)律、有效成分的積累規(guī)律等方面研究較少，缺乏系統(tǒng)深入的試驗(yàn)研究。隨著石生黃堇的藥用價(jià)值被發(fā)掘，其市場需求量不斷擴(kuò)大，野生資源無法滿足市場需求。在人工栽培試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，石生黃堇繁殖系數(shù)低下，這是其規(guī)范化栽培的主要障礙。因此，本課題組對(duì)石生黃堇種子生理及萌發(fā)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，旨在為其規(guī)范化栽培提供參考。

1 材料

1.1 樣品

于2021 年5 月采自廣西壯族自治區(qū)河池市東蘭縣的栽培植物，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所郭巧生教授鑒定為石生黃堇Corydalis saxicolaBunting.種子，采收后室內(nèi)自然晾干。

1.2 儀器

DVM6a 型超景深顯微鏡[茂盛實(shí)業(yè)（上海）有限公司]；19 cm×14 cm 發(fā)芽盒（南京晶格化學(xué)科技有限公司）；GXZ-260B 型智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；BMS-120.4型分析天平（上海卓精電子科技有限公司）；DELTA 320型pH計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.3 試藥

鹽酸（批號(hào)：160725196H）、氫氧化鈉（批號(hào)：20210406）均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 外形基本特性

取石生黃堇種子20 粒，觀察種子形狀、色澤、光滑度、質(zhì)感等，在超景深顯微鏡下測量種子大小，總結(jié)種子形態(tài)特征。

2.2 吸水率的測定

取石生黃堇凈種子0.3 g，置于燒杯中，加入蒸餾水30 mL 自然吸漲，定期用吸水紙吸干種子表面水分后稱質(zhì)量，直到最后2 次測定值相差不超過0.05 g為止，3次重復(fù)，按公式（1）計(jì)算吸水率。

2.3 萌發(fā)抑制物的生物測定

取粉碎的石生黃堇種子3 g置于錐形瓶中，加入蒸餾水20 mL，保鮮膜封口后在4 ℃冰箱內(nèi)浸提，每隔6 h 振蕩1 次，浸提24 h 后取出，作為第1 天的浸提液，將含有種子粉末的錐形瓶中再加入蒸餾水20 mL，按上述方法反復(fù)浸提至第3天。將浸提液用于白菜種子發(fā)芽試驗(yàn)，以等體積蒸餾水為對(duì)照（CK），統(tǒng)計(jì)白菜種子的萌發(fā)情況。將浸提液存放于4 ℃的冰箱中貯藏備用。

2.4 休眠特性檢驗(yàn)

取健康飽滿的石生黃堇種子，去除種皮后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，放于15 ℃/25 ℃（模擬自然的變溫條件即1 d 內(nèi)將種子置于25 ℃條件下12 h、15 ℃條件下12 h，如此反復(fù)循環(huán)）黑暗條件下培養(yǎng)，觀察種子的萌發(fā)情況。

2.5 不同發(fā)芽條件下種子發(fā)芽率測定

2.5.1適宜浸種時(shí)間的確定 選取飽滿、大小基本一致的石生黃堇種子，在室溫條件下分別浸種24、36、48、60、72 h，于15 ℃/25 ℃黑暗條件下砂床進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

2.5.2適宜發(fā)芽床的確定 選取飽滿，大小基本一致的石生黃堇種子，室溫條件下用蒸餾水浸種60 h，分別置于以下發(fā)芽床，于15 ℃/25 ℃黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。各處理如下：1）在培養(yǎng)皿中鋪上2 層濕潤的濾紙，置種；2）在培養(yǎng)皿上鋪2 層濕潤并消過毒的無紡紗布，置種；3）在培養(yǎng)皿上鋪2 層濕潤并消過毒的無紡紗布，置種，然后在種子上面鋪1層紗布；4）在培養(yǎng)皿中放入過60 目篩并用高溫消毒的細(xì)砂20 g（砂水體積比為4∶1），置種；5）把濾紙折疊，將種子置于褶溝處。

2.5.3適宜溫度和光照的確定 選取飽滿、大小基本一致的石生黃堇種子，種子洗凈后，用蒸餾水浸種60 h，吸水紙吸干種子表面水分。設(shè)計(jì)10、15、20、25、30 ℃及10 ℃/20 ℃、15 ℃/25 ℃ 7 個(gè)處理，并將各溫度處理的種子分別放在光12 h/暗12 h（光照強(qiáng)度為弱光）、全黑暗條件下，定期澆水，觀察種子萌發(fā)情況。

2.5.4適宜pH 的確定 選取飽滿、大小基本一致的石生黃堇種子，室溫條件下自來水浸種60 h，吸水紙吸干種子表面水分，分別用鹽酸和氫氧化鈉配制酸性和堿性母液，將酸堿母液及pH 為7 的蒸餾水分別加入砂床（砂子用去離子水清洗3 遍，于121 ℃條件下進(jìn)行高溫滅菌處理）上，調(diào)節(jié)濕砂的pH 為5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0（用pH 計(jì)測定），于15 ℃/25 ℃黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

2.6 不同貯藏方式對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響

選取剛采收的飽滿、大小基本一致的石生黃堇種子，在室溫條件下自然干燥3～5 d 后，按以下4 種方式貯藏。1）4 ℃低溫干藏：種子置于紙袋中，于4 ℃冰箱中貯藏；2）4 ℃低溫砂藏：將洗凈的河沙篩成粗砂（18 目）和細(xì)砂（40 目），經(jīng)高溫滅菌（121 ℃，30 min）后，在容器底部鋪粗砂3～5 cm，再鋪細(xì)砂5～10 cm，將石生黃堇種子裝入紗布網(wǎng)袋中，平鋪于細(xì)砂上，再蓋細(xì)砂5～10 cm，細(xì)砂相對(duì)濕度為15%左右，用保鮮膜封住容器，打孔透氣，將容器置于冰箱中；3）15 ℃非密閉干藏：種子放入袋中，于15 ℃條件下貯藏；4）15 ℃密閉干藏：種子放入種子袋中，置于密閉的塑料貯藏罐中，于15 ℃下進(jìn)行貯藏。

2.7 測定指標(biāo)

以種子根莖處胚芽伸出2 mm 時(shí)的天數(shù)作為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以種子萌發(fā)數(shù)達(dá)到最高、以后再無萌發(fā)種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)作為末次計(jì)數(shù)時(shí)間，采用公式（2）～（3）計(jì)算發(fā)芽勢、發(fā)芽率。

2.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 24 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 石生黃堇種子及果莢基本特性

如圖1A～B所示，石生黃堇種果為蒴果，長3.0～5.1 cm，扁條形或線形、略彎曲，成熟時(shí)2 瓣裂，內(nèi)含種子20～30粒。如圖1C～D 所示，石生黃堇種子長0.91～1.12 mm，寬1.20～1.41 mm，厚0.62～0.76 mm，腎形或橢圓形，表面黑色或棕黑色，有光澤，種皮堅(jiān)硬，有致密的蠟質(zhì)層和角質(zhì)層，表面為網(wǎng)紋型紋飾，種臍位于干截面的中間，略凹陷，其上有白色或淺黃色雞冠狀的油質(zhì)體種阜，種孔位于種臍旁邊，被種阜所覆蓋。

圖1 石生黃堇果莢及種子形態(tài)

3.2 石生黃堇種子吸水曲線

由圖2 可知，石生黃堇種子吸水過程大致可以分為3 個(gè)階段：第1 階段為0～2 h，是種子急劇吸水的階段，吸水率已近50%；第2 階段為2～22 h，此階段為種子緩慢吸水的時(shí)期，種子吸水量緩慢增加；第3 階段22 h 之后，種子吸水率基本上處于穩(wěn)定狀態(tài)，吸水率達(dá)到70%以上。由此看出，石生黃堇種子雖質(zhì)地堅(jiān)硬，種皮革質(zhì)，但是其吸水無障礙，在24 h 內(nèi)基本上可以達(dá)到飽和狀態(tài)，滿足種子萌發(fā)所需要的水分。

圖2 石生黃堇種子吸水曲線

3.3 石生黃堇種子萌發(fā)抑制物的生物測定

第2 天的種子浸提液對(duì)白菜種子發(fā)芽率、根長、莖長抑制作用最強(qiáng)，與CK、第3 天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），由此可以推斷出，種子中存在某種物質(zhì)抑制其萌發(fā)，該抑制物質(zhì)至少需要48 h 才能完全可以溶于水中，第3 天浸提液中白菜種子的發(fā)芽率、根長、莖長與CK 相差無幾，與第1、2 天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能與某些易溶于水的萌發(fā)抑制物在浸提期間發(fā)生了水解、氧化、拮抗等作用有關(guān)。因此，將種子浸泡在水中48 h 以上，基本上能降解萌發(fā)抑制物（表1）。

表1 不同浸提時(shí)間對(duì)白菜種子發(fā)芽率、根長及莖長的影響（,n=3）

表1 不同浸提時(shí)間對(duì)白菜種子發(fā)芽率、根長及莖長的影響（,n=3）

注：同列不同小寫字母表示P＜0.05；表2～6同。

3.4 石生黃堇種子休眠特性的檢驗(yàn)

經(jīng)過30 d培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中的石生黃堇種胚均未發(fā)芽（圖3A），可以看出大部分種胚具有休眠性。如圖3B～C所示，種子存在形態(tài)發(fā)育不完全的現(xiàn)象。

圖3 石生黃堇種子胚發(fā)芽及發(fā)育狀態(tài)

3.5 不同發(fā)芽條件下種子發(fā)芽率的測定

3.5.1適宜發(fā)芽床的確定 砂上種子的發(fā)芽率最高為60.00%，紙上與砂上無明顯差異，而棉間種子的發(fā)芽率最低為27.33%（表2）?？赡苁鞘S堇種子細(xì)小，種子在棉間承受的阻力較大，種胚難以突破伸長，導(dǎo)致在棉間的發(fā)芽率最低。在實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，砂上種子的啟動(dòng)日期相較其他發(fā)芽床明顯提前，以棉為發(fā)芽床的種子發(fā)霉現(xiàn)象嚴(yán)重，可能與棉的保水性強(qiáng)、透氣性較差有關(guān)，故選擇砂床較為適宜。

表2 不同發(fā)芽床對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響（,n=3）

表2 不同發(fā)芽床對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響（,n=3）

3.5.2適宜浸種時(shí)間的確定 如表3 所示，在24～72 h，隨著浸種時(shí)間的增加，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，且在浸種60 h 時(shí)，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均為最高，故選擇浸種60 h為宜。

表3 不同浸種時(shí)間對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響（,n=3）

表3 不同浸種時(shí)間對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響（,n=3）

3.5.3適宜發(fā)芽溫度和光照 由表4可知，10～25 ℃條件下石生黃堇種子均可發(fā)芽，溫度高時(shí)發(fā)芽速度快，15 ℃/25 ℃黑暗條件下，發(fā)芽率最高為68%，且變溫條件下發(fā)芽率略高于恒溫條件下石生黃堇種子的發(fā)芽率。適宜溫度范圍內(nèi)，光照與否對(duì)石生黃堇種子發(fā)芽率的影響不明顯，若溫度不適，光照為影響種子發(fā)芽的主要因素。

表4 不同溫度和光照條件下石生黃堇種子萌發(fā)情況（,n=3）

表4 不同溫度和光照條件下石生黃堇種子萌發(fā)情況（,n=3）

3.5.4發(fā)芽適宜pH 的確定 由表5 可知，在pH 3～11條件下，其發(fā)芽率先增加再下降，pH在5、7、9、11 發(fā)芽率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明石生黃堇種子萌發(fā)對(duì)土壤酸堿度要求不嚴(yán)，在pH 為7 時(shí)發(fā)芽率最高，為72%。

表5 不同pH對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響（,n=3）

表5 不同pH對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響（,n=3）

3.5.5發(fā)芽初次和末次計(jì)數(shù)時(shí)間 從圖4 可知，石生黃堇種子啟動(dòng)時(shí)間較晚，9 d 后才陸續(xù)發(fā)芽，第9～20 d發(fā)芽速度明顯加快，發(fā)芽20 d后，種子發(fā)芽速度明顯下降，并趨于平穩(wěn)，整個(gè)發(fā)芽周期為1～23 d，第9天為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，第23天為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。

圖4 石生黃堇種子發(fā)芽率與時(shí)間的關(guān)系

3.6 不同貯藏方式對(duì)石生黃堇種子萌發(fā)的影響

從表6 可知，石生黃堇種子不耐貯藏，采用4 ℃濕藏的方式，貯藏4 個(gè)月發(fā)芽率基本上可以保持在60%左右，貯藏第3 個(gè)月發(fā)芽率最高為76%；4 ℃干藏3 個(gè)月下降極其顯著，貯藏6 個(gè)月種子發(fā)芽率就降到20%左右，說明在溫度較低貯藏時(shí)，濕藏處理有利于種子保持生理活性，使胚不斷發(fā)育成熟。采用15 ℃干藏（接近種子萌發(fā)的溫度）貯藏6個(gè)月，發(fā)芽率基本上也可保持在40%左右。

表6 不同貯藏方式下石生黃堇種子的發(fā)芽率（,n=3）

表6 不同貯藏方式下石生黃堇種子的發(fā)芽率（,n=3）

4 討論

石生黃堇為巖溶石山地區(qū)特有的多年生草本植物，局限分布裸露石山，生于石縫、石穴[8]，生長環(huán)境極其惡劣。其種子自然繁殖率低，種群資源更新困難，主要原因包括：1）石生黃堇種子本身生活力低下。通過研究發(fā)現(xiàn)石生黃堇種子生活力水平較低，可能與花期生存條件惡劣，如偶有驟寒使球花敗育、花期多雨阻礙授粉、種子采收后的干燥貯藏方式有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步探究。2）生物因素、生態(tài)環(huán)境導(dǎo)致種子種皮堅(jiān)硬。巖溶山區(qū)地表容易滲漏，土壤耕作淺，蓄水能力差，極易發(fā)生干燥，石生黃堇為了適應(yīng)這種缺水干旱的環(huán)境，不斷增厚種皮結(jié)構(gòu)，因此種子吸水達(dá)到飽和狀態(tài)需要更多的時(shí)間。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雖然存在種皮堅(jiān)硬的問題，但是不影響種子吸水性，可通過較長時(shí)間浸泡軟化種皮，同時(shí)此過程也起到降解萌發(fā)抑制物的作用。3）種子發(fā)育狀態(tài)不一致。由于長期的進(jìn)化，植物具有特殊的種子傳播及萌發(fā)策略，確保在合適的時(shí)間和地點(diǎn)下進(jìn)行種子的萌發(fā)與幼苗的建成，但是由于親本之間存在遺傳差異性，或者在資源環(huán)境不足的條件下資源分配的差異，導(dǎo)致個(gè)體差異。這也是石生黃堇果穗中部的種子發(fā)芽率高于頂部和基部的發(fā)芽率、不同采收部位發(fā)芽率存在差異可能的原因[9]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分種子還存在胚發(fā)育不一致的狀況，可通過砂藏100 d的方法，發(fā)芽率可達(dá)76%，進(jìn)一步提高了種子發(fā)芽的整齊度。4）種子存在萌發(fā)抑制物。種子內(nèi)源抑制物即化感物質(zhì)是導(dǎo)致種子休眠的主要原因，在藥用植物中普遍存在，如蒙古黃芪[10]、延胡索[11]、貝母[12]等。本研究發(fā)現(xiàn)石生黃堇種子存在能溶于水的萌發(fā)抑制物，浸泡60 h 基本可以降解，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)，但是過長時(shí)間浸種，也會(huì)使種子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，進(jìn)而影響種子的發(fā)芽率。5）種子采后干燥方式很重要。石生黃堇狹域分布在中國西南部，自然環(huán)境先天脆弱、資源量比較少，當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶在采收季節(jié)采收好種子后一般放在陽光下曬干或者直接放在大棚內(nèi)晾干，此時(shí)溫度較高，太陽輻射相對(duì)較強(qiáng)，種子內(nèi)部水分急劇蒸發(fā)下降，自由水盡失，導(dǎo)致種子活力降低甚至完全喪失活性，雖然外表發(fā)亮完整，但是內(nèi)部種子干癟，也解釋了曬干處理在不同干燥處理（鮮種、曬干、陰干）方法中，發(fā)芽率最低的原因，也為后續(xù)進(jìn)一步研究種子含水量與種子發(fā)芽的情況打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。6）種子不耐貯藏。種子貯藏的首要任務(wù)是為了保證種子的活力以延長種子的壽命，種子在貯藏過程中，溫度和含水量是種子貯藏的2 個(gè)主要的參數(shù)，在溫度較低（4 ℃）進(jìn)行貯藏時(shí)，濕藏可以使種子保持生理活性，使胚不斷發(fā)育成熟。本研究前期也嘗試過15 ℃濕砂層積的方法，砂藏層積20 d 左右就發(fā)芽，因此在15 ℃下進(jìn)行貯藏時(shí)適合采用干藏方法。

5 結(jié)論

石生黃堇種子屬綜合休眠型，種子雖種皮堅(jiān)硬，但種皮透水性良好，滿足種子萌發(fā)所需要的水分；部分種子還存在胚發(fā)育不完全和萌發(fā)抑制物的現(xiàn)象。通過對(duì)石生黃堇種子的外部環(huán)境條件的摸索，發(fā)現(xiàn)適宜石生黃堇種子萌發(fā)的條件為春天種子采收后進(jìn)行室內(nèi)陰干處理3～5 d 后，清水浸種60 h、15 ℃/25 ℃黑暗條件、pH 偏中性的砂床。石生黃堇種子不耐貯藏，最好隨采隨播；若短期貯藏可以采用低溫濕藏的方法貯藏3 個(gè)月，發(fā)芽率可達(dá)到76%；若需要長期貯藏可采用15 ℃密閉干藏，發(fā)芽率基本可保持在40%左右。