肉蓯蓉延緩衰老功能因子及作用機制研究△

宋紫騰，李瑩曼，徐旭，韓彥琪，張鐵軍*，許浚，4*

1.天津藥物研究院 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點實驗室，天津 300301；

2.天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300301；

3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；

4.中國中藥協(xié)會 藥食同源物質(zhì)評價和利用專業(yè)委員會，北京 100061

肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，被譽為“沙漠人參”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列屬上品。其味甘、咸，性溫，歸腎、大腸經(jīng)，中醫(yī)認(rèn)為其具有補腎陽、益精血、潤腸通便之效[1]。2018 年，肉蓯蓉（荒漠）被列入《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》中[2]，將其開發(fā)為保健產(chǎn)品的價值得到了認(rèn)可。據(jù)統(tǒng)計，肉蓯蓉在抗衰老延年類方劑中的出現(xiàn)頻率僅次于人參[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有顯著的抗氧化、延緩衰老、抗疲勞、改善記憶力等多方面作用[4]，但其延緩衰老的功能因子及作用機制尚不明確。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲）是一種多細(xì)胞生物，遺傳背景清楚、壽命相對較短、繁殖快、易培養(yǎng)，且隨壽命的增長表現(xiàn)出與人類相似的衰老表型。線蟲基因、蛋白、信號通路都與人類高度保守，與人類基因的同源性達60%～80%。近年來，線蟲在中藥及天然藥物抗衰老的研究中已得到廣泛應(yīng)用[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測肉蓯蓉延緩衰老的活性成分、靶點和信號通路；以線蟲為模式生物，通過觀察其壽命、生殖等整體指標(biāo)，測定其氧化應(yīng)激、運動能力的變化及與壽命相關(guān)基因的表達情況，探索肉蓯蓉延緩衰老的作用機制，為相關(guān)健康產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SMZ-168 型體視顯微鏡（Motic 公司）；CKX41型倒置相差熒光顯微鏡（Olympus 公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）；Mycycler 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因擴增儀、MJ Mini?型熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

肉蓯蓉采收自新疆于田縣荒漠肉蓯蓉良好農(nóng)業(yè)規(guī)范（GAP）種植基地，經(jīng)天津藥物研究院有限公司張鐵軍研究員鑒定為肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma；2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFHDA）、2% NaN3（Sigma 公司）；Trizol 試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green Kit（Takara 生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶（GSHPx）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）所需引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 線蟲

實驗所用10 種不同基因類型的線蟲均來源于Caenorhabditis Genetics Center，具體信息見表2。

表2 線蟲品系及基因型

2 方法

2.1 肉蓯蓉功能因子和靶點的篩選

通過查閱文獻并結(jié)合本課題組前期對肉蓯蓉物質(zhì)組的表征，從中篩選出主要化學(xué)成分及入血成分[6-9]。在ChemDraw 19.0 軟件中繪制化合物結(jié)構(gòu)，將其輸入到SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://new.swisstargetprediction.ch/），采用反向藥效團匹配方法得到虛擬篩選結(jié)果。同時利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）。使用UniProt數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）中的UniProtKB 搜索功能及Reviewed Swiss-Prot對蛋白進行過濾，并限定物種為“human”，將化合物靶標(biāo)蛋白矯正為基因名。整合2 個數(shù)據(jù)庫靶點結(jié)果，得到化合物潛在作用靶點庫。

2.2 衰老相關(guān)靶點的預(yù)測分析

使用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMⅠM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫，以“old、senile、decrepit、senescence、feeble、caducity”為關(guān)鍵詞進行檢索，其中GeneCards 篩選得分≥10%的基因，將2 個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果合并，剔除重復(fù)基因，最終得到衰老相關(guān)靶點。再將2.1項下功能因子作用靶點與上述衰老相關(guān)靶點合并，取交集，繪制韋恩圖。

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPⅠ）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將得到的交集靶點輸入到STRⅠNG 11.5（http://string-db.org/）數(shù)據(jù)平臺，將物種限定為“Homo sapiens”，交互得分最高置信度為0.900，獲得PPⅠ網(wǎng)絡(luò)。將數(shù)據(jù)保存為.TSV 格式，導(dǎo)入Cytoscope 3.8.0 軟件，以度（degree）值調(diào)整節(jié)點大小和顏色深淺，獲得肉蓯蓉活性成分與疾病靶點的PPⅠ網(wǎng)絡(luò)。選取度、介數(shù)（betweenness）、緊密度（closeness）3 個參數(shù)均大于中位數(shù)的點作為核心靶點，經(jīng)篩選共得到8個核心靶點。

2.4 基因本體（GO）生物分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

采用OmicsBean數(shù)據(jù)庫（http://www.omicsbean.cn/login/），對交集靶點進行GO 功能分析和KEGG通路富集分析，依據(jù)P值進行排序，并對得到的通路進行分析。

2.5 藥材-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥材、成分、靶點、通路導(dǎo)入Cytoscope 3.8.0軟件，構(gòu)建肉蓯蓉藥材-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.6 線蟲培養(yǎng)

線蟲在20 ℃條件下，使用NGM 培養(yǎng)基（雙蒸水250 mL 中含有NaCl 0.750 g、胰蛋白胨0.625 g和瓊脂4.250 g）進行恒溫培養(yǎng)。滅菌大腸埃希菌E.coliOP50（65 ℃，45 min）作為食物來源，均勻涂布于NGM 培養(yǎng)基表面。使用裂解液（5% NaClO，5 mol·L-1NaOH）進行線蟲同期化處理，同期化后的線蟲在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至L4 期。隨機挑取L4期線蟲，分為對照組（NGM 培養(yǎng)基）、不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉給藥組進行實驗。

2.7 藥物制備

取肉蓯蓉藥材10 g，按照料液比1∶10 加入蒸餾水，回流提取2 次，每次2 h，合并水提液，濾過后減壓濃縮至干。用滅菌蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為50 mg·mL-1（以生藥量計）的母液。用NGM 培養(yǎng)基分別配制成終質(zhì)量濃度為0、25、50、75、100、200、500 μg·mL-1的溶液，備用。

2.8 毒性實驗

將N2線蟲轉(zhuǎn)移到含有不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉（0、25、50、100、200、500 μg·mL-1）的培養(yǎng)皿中，每組100條。給藥當(dāng)天計為第0天，每天換新鮮含藥培養(yǎng)基并記錄線蟲死亡情況，得到肉蓯蓉的安全給藥劑量范圍。

2.9 應(yīng)激實驗

將N2線蟲轉(zhuǎn)移到含有不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉（0、25、50、75 μg·mL-1）的培養(yǎng)皿中，每組100 條。給藥當(dāng)天計為第0 天，每天換新鮮含藥培養(yǎng)基，給藥第7 天進行應(yīng)激實驗。氧化應(yīng)激實驗中，將各組線蟲轉(zhuǎn)移至NGM 培養(yǎng)基（每10 mL NGM 培養(yǎng)基中添加30% H2O210 μL）中，每30 min 記錄線蟲存活情況。熱應(yīng)激實驗中，將線蟲持續(xù)暴露在35 ℃條件下培養(yǎng)，每2 h記錄線蟲存活情況。

2.10 身體彎曲實驗

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下。給藥第3 天和第7 天進行身體彎曲實驗，取每組20 條線蟲，對30 s內(nèi)線蟲身體彎曲的次數(shù)進行檢測記錄。

2.11 咽泵實驗

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下，每個培養(yǎng)皿中各放1 條線蟲，每個質(zhì)量濃度設(shè)置5 個平行，給藥第0、3、7 天在體式顯微鏡下觀察線蟲吞咽頻率，每次跟蹤觀察60 s并記錄其咽泵次數(shù)。

2.12 繁殖實驗

取L1 期N2 線蟲置于給藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)至L4 期后，每天轉(zhuǎn)移至新的不同質(zhì)量濃度含藥培養(yǎng)基中，并對線蟲的產(chǎn)卵量進行測定，將含卵的舊板置于20 ℃培養(yǎng)48 h 后進行子代數(shù)量的測定。每個培養(yǎng)皿中含有1條線蟲，每個質(zhì)量濃度設(shè)置5個平行。

2.13 脂褐素積累測定

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下，每組100 條線蟲。給藥第7 天及第11 天進行脂褐素測定實驗，隨機選35 條線蟲置于2%瓊脂糖片上，用2%NaN3麻醉，使用熒光顯微鏡（激發(fā)光波長為360～370 nm，發(fā)射光波長為420～460 nm）觀察線蟲體內(nèi)的藍色自發(fā)熒光，并使用ⅠmageJ 1.51 軟件量化熒光強度。

2.14 MDA、ROS含量及抗氧化酶活性測定

取N2 線蟲，分組及給藥處理同2.9項下，每組100條線蟲。給藥第7天，將每組培養(yǎng)基上的線蟲用0.9%氯化鈉溶液沖洗并收集于1.5 mL 離心管內(nèi)，置于冰上勻漿，轉(zhuǎn)速3000 r·min-1離心10 min（離心半徑42.5 mm），離心后取上清液，用試劑盒分別測定SOD、CAT、GSH-Px的活性及MDA含量。

ROS 測定實驗中，使用M9 緩沖液沖洗線蟲3 次，置于終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA 溶液中37 ℃黑暗孵育20 min，每5 min 搖勻1 次。隨后用M9緩沖液清洗2次，將線蟲置于載玻片上。使用熒光顯微鏡（激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長為520 nm）拍照，并使用ⅠmageJ 1.51 軟件評估相對熒光強度。

2.15 衰變加速因子-16（DAF-16）、SKN-1 的核易位及SOD-3、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶-4（GST-4）、熱休克蛋白-16.2（HSP-16.2）的可視化

分別采用TJ356、LG333 轉(zhuǎn)基因線蟲進行DAF-16、SKN-1 蛋白核易位實驗。分別采用CF1553、CL2166、TJ375 轉(zhuǎn)基因線蟲確定SOD-3、GST-4 和HSP-16.2 蛋白的表達情況。分組與給藥處理同2.9項下。給藥第7 天使用熒光顯微鏡對各組線蟲拍照，使用ⅠmageJ 1.51 軟件對GFP 熒光強度進行量化。

2.16 突變體線蟲壽命測定

分別采用CF1038、EU1、PS3551、DA1116 線蟲進行實驗，分為對照組和肉蓯蓉75 μg·mL-1給藥組。每天統(tǒng)計各組線蟲的存活率。

2.17 qRT-PCR實驗

將L4 期N2 線蟲轉(zhuǎn)移至含有不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉（0、25、50、75 μg·mL-1）的NGM培養(yǎng)基（含150 μmol·L-1五氟尿嘧啶），20 ℃培養(yǎng)6 d。采用Trizol 法提取線蟲總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 用于mRNA 定量。使用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù)，act-1作為內(nèi)參基因。

2.18 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 肉蓯蓉潛在活性成分和作用靶點

通過查閱文獻并結(jié)合本課題組前期研究，選取了包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類和木脂素類等12 個化學(xué)成分作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的目標(biāo)化合物，具體信息見表3。從數(shù)據(jù)庫中經(jīng)去除重復(fù)后得到12 個潛在活性成分的作用靶點共86個。

表3 肉蓯蓉活性成分

3.2 衰老相關(guān)靶點

在GeneCards、OMⅠM 數(shù)據(jù)庫分別收集到7753、295個與衰老相關(guān)的靶點。

3.3 藥物與疾病共同靶點及PPⅠ網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

藥物靶點與疾病靶點取交集得到75 個交集靶點，導(dǎo)入STRⅠNG 網(wǎng)絡(luò)分析平臺，隱去網(wǎng)絡(luò)中未連接的節(jié)點，構(gòu)建PPⅠ網(wǎng)絡(luò)，見增強出版材料。該PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中共有45個節(jié)點、59條連線。經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)分析篩選出8個核心靶點，見表4。

表4 肉蓯蓉延緩衰老核心靶點

3.4 GO富集分析和KEGG富集分析

通過OmicsBean數(shù)據(jù)庫，將核心靶點進行GO功能富集和KEGG 通路分析。GO 分析包含細(xì)胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物過程（biological process）3個方面，P值最小的前10 個條目見增強出版材料。結(jié)果表明，生物過程主要涉及到調(diào)節(jié)活性氧代謝過程、免疫反應(yīng)正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞器、多糖消化過程等；細(xì)胞組分主要包括內(nèi)膜系統(tǒng)、胞外區(qū)、質(zhì)膜、膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞外分泌體、高爾基體等；分子功能主要與葡萄糖苷酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、碳水化合物結(jié)合、β-果糖呋喃糖苷酶活性等有關(guān)。KEGG 共富集篩選得到27條衰老相關(guān)通路，將前20條通路繪制通路氣泡圖（見增強出版材料），肉蓯蓉延緩衰老主要涉及到癌癥通路、神經(jīng)分泌系統(tǒng)及信號傳導(dǎo)通路。癌癥通路主要包括前列腺癌（prostate cancer）、乳腺癌（breast cancer）等通路；神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)涉及雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、促性腺激素釋放素信號通路（GnRH signaling pathway）、胰島素信號通路（insulin signaling pathway）等；信號傳導(dǎo)通路有磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PⅠ3KAkt）信號通路和磷脂酶D 信號通路（phospholipase D signaling pathway）。

3.5 藥材-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape 3.8.0 軟件將肉蓯蓉延緩衰老的活性成分、靶點、通路映射到藥材-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中。該網(wǎng)絡(luò)中共有114 個節(jié)點、218 條線（見增強出版材料）。

3.6 肉蓯蓉對線蟲壽命的影響

毒性實驗結(jié)果如圖1 所示，與對照組比較，肉蓯蓉25、50 μg·mL-1可延長線蟲壽命，100 μg·mL-1無明顯效果，200、500 μg·mL-1對線蟲具有一定毒性，縮短了線蟲的壽命。根據(jù)毒性實驗結(jié)果，選擇肉蓯蓉給藥質(zhì)量濃度為25、50、75、100 μg·mL-1，測定N2 線蟲壽命。結(jié)果如表5 所示，與對照組比較，肉蓯蓉25、50、75 μg·mL-1組線蟲壽命顯著延長，因此以25、50、75 μg·mL-1進行后續(xù)實驗。

表5 不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉對線蟲壽命的影響（,n=100）

表5 不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉對線蟲壽命的影響（,n=100）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖1 不同質(zhì)量濃度肉蓯蓉給藥后線蟲的生存曲線

3.7 肉蓯蓉對線蟲應(yīng)激能力的影響

在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下，與對照組比較，肉蓯蓉處理組線蟲壽命延長（圖2A），其中對照組線蟲平均壽命為（1.44±0.07）h，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲平均壽命為（2.02±0.05）h，壽命顯著延長（P＜0.001）。在熱應(yīng)激條件下，與對照組比較，肉蓯蓉處理組線蟲的抗熱休克能力提升，壽命延長（圖2B），其中對照組線蟲平均壽命為（19.25±0.20）h，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲平均壽命為（22.80±0.08）h，與對照組比較壽命延長作用顯著（P＜0.001）。

圖2 應(yīng)激條件下肉蓯蓉對線蟲壽命的影響

3.8 肉蓯蓉對線蟲脂褐素積累和身體彎曲能力的影響

脂褐素會隨著年齡的增加而逐漸積累。與對照組比較，肉蓯蓉25、50、75 μg·mL-1組線蟲在第7天藍色熒光水平分別降低了15.09%、28.67%、39.86%（圖3A～B）；在第11 天藍色熒光水平則分別降低了8.55%、22.36%、36.84%，表明肉蓯蓉抑制了脂褐素的積累。

肉蓯蓉對線蟲身體彎曲能力的影響如圖3C 所示，與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲在第3 天和第7 天30 s 內(nèi)身體彎曲次數(shù)分別增加了25%、36.17%，表明肉蓯蓉可促進線蟲身體彎曲。

圖3 肉蓯蓉對線蟲衰老色素積累及運動能力的影響

3.9 肉蓯蓉對線蟲吞咽能力及繁殖能力的影響

在第3天和第7天，與對照組比較，肉蓯蓉給藥組線蟲咽部泵送率（60 s 內(nèi)咽泵次數(shù)）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A），表明肉蓯蓉并沒有改變N2 線蟲的食物攝入量，肉蓯蓉介導(dǎo)的長壽作用并不依賴于飲食限制。給藥處理線蟲產(chǎn)卵量（圖4B）和子代數(shù)（圖4C）與對照組相比無明顯變化，表明肉蓯蓉并未對線蟲的繁殖能力產(chǎn)生影響。

圖4 肉蓯蓉對線蟲吞咽能力及繁殖能力的影響（,n=5）

3.10 肉蓯蓉對ROS、MDA含量及抗氧化酶活性的影響

急性應(yīng)激毒性會導(dǎo)致ROS 水平的升高。如圖5A、5B 所示，與對照組比較，給藥第7 天肉蓯蓉組線蟲ROS 積累水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。為探究肉蓯蓉對線蟲內(nèi)源性抗氧化防御能力的影響，測定了線蟲體內(nèi)抗氧化酶的活性。與對照組比較，肉蓯蓉25、50、75 μg·mL-1組線蟲SOD、CAT、GSH-Px 活性顯著升高（圖5C～E）。MDA 是脂質(zhì)過氧化的重要生物標(biāo)志物，與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲體內(nèi)MDA 水平顯著降低（P＜0.05，圖5F）。以上結(jié)果表明，肉蓯蓉可以有效緩解線蟲的氧化應(yīng)激。

圖5 肉蓯蓉對線蟲ROS、MDA含量及抗氧化酶活性的影響（,n=100）

3.11 肉蓯蓉對衰老相關(guān)基因mRNA表達的影響

KEGG 分析前20 條通路中的胰島素（ⅠⅠS）信號通路與線蟲衰老密切相關(guān)，且機制研究相對較成熟[10]，因此驗證了胰島素信號通路上與衰老相關(guān)基因的表達。線蟲體內(nèi)釋放的胰島素樣肽（ⅠLPs）與其受體DAF-2 結(jié)合后激活晚期糖基化終末產(chǎn)物-1（AGE-1），進一步激活蛋白激酶B-1/2（Akt-1/2），使得轉(zhuǎn)錄因子DAF-16 磷酸化，導(dǎo)致DAF-16 活性及其向細(xì)胞核遷移的行為受到抑制[11]。如圖6所示，與對照組 比 較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組 線 蟲DAF-2、AGE-1、Akt-1 mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），DAF-16 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）。表明肉蓯蓉介導(dǎo)的延壽作用依賴于ⅠⅠS 信號通路。sir-2.1基因在線蟲衰老、應(yīng)激及凋亡等生理活動中均具有重要的作用，上調(diào)sir-2.1基因的表達會延長線蟲的壽命[12]，但給藥處理后并未顯著改變SⅠR-2.1 mRNA 的表達水平（圖6）。HSF-1、SKN-1對線蟲的氧化應(yīng)激和衰老起重要調(diào)控作用[11]。結(jié)果表明，與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲HSF-1、HSP-16.1、HSP-16.2、SKN-1 mRNA 表達水平顯著提高（圖6）。

轉(zhuǎn)錄因子DAF-16/叉頭盒蛋白（FOXO）和SKN-1/核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）被激活，可調(diào)節(jié)許多編碼抗氧化相關(guān)蛋白的基因[13]。與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲SOD-3、GST-4、CTL-1、CTL-2、MTL-1 mRNA 的表達水平顯著上調(diào)，表明肉蓯蓉可能通過增強抗氧化能力來延長壽命。飲食限制法能夠通過限制食物攝入來改善線粒體功能，延長壽命[14]。各組線蟲EAT-2 mRNA 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明肉蓯蓉介導(dǎo)的延壽作用并不通過飲食限制途徑（圖6）。

圖6 肉蓯蓉對衰老相關(guān)基因mRNA表達的影響（,n=100）

3.12 肉蓯蓉對相關(guān)基因突變體線蟲壽命的影響

與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組daf-16、skn-1、hsf-1基因突變體線蟲在給藥處理后壽命曲線并未發(fā)生顯著右移（圖7A～C），而eat-2基因突變體線蟲平均壽命增加了16.45%（P＜0.001，圖7D）。結(jié)果表明，肉蓯蓉介導(dǎo)的延壽作用與daf-16、hsf-1和skn-1基因相關(guān)，但與eat-2基因無關(guān)。

圖7 肉蓯蓉對衰老相關(guān)轉(zhuǎn)基因突變體線蟲壽命的影響

3.13 肉蓯蓉對DAF-16、SKN-1蛋白核易位的影響

DAF-16蛋白分別在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞間和細(xì)胞核中表達的代表性圖片見圖8A。與對照組比較，肉蓯蓉給藥后線蟲體內(nèi)DAF-16蛋白在細(xì)胞核定位比例顯著升高，細(xì)胞質(zhì)定位比例顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，圖8C）。SKN-1 蛋白分別在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核表達的代表性圖片見圖8B。與對照組比較，肉蓯蓉75 μg·mL-1組線蟲體內(nèi)SKN-1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)定位比例顯著降低，細(xì)胞核定位比例顯著升高（P＜0.05，圖8D）。

圖8 肉蓯蓉對DAF-16和SKN-1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核易位的影響

3.14 肉蓯蓉對線蟲SOD-3、GST-4、HSP-16.2 蛋白表達的影響

利用CF1553、CL2166 和TJ375 轉(zhuǎn)基因線蟲分別對SOD-3、GST-4 和HSP-16.2 蛋白表達水平進行可視化和定量（圖9）。與對照組比較，肉蓯蓉各質(zhì)量濃度組線蟲SOD-3、GST-4 蛋白表達水平均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。肉蓯蓉50、75 μg·mL-1組線蟲HSP-16.2 蛋白表達水平顯著提高（P＜0.01，P＜0.001）。

圖9 肉蓯蓉對線蟲SOD-3、GST-4和HSP-16.2蛋白表達的影響

4 討論

隨著我國人口老齡化程度加劇，探究抗衰老機制并開發(fā)延緩衰老的健康產(chǎn)品至關(guān)重要。中藥具有不良反應(yīng)小、整體均衡調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，在抗衰老研究中發(fā)揮著獨特的作用[15]。衰老屬中醫(yī)“虛勞”范疇，與五臟內(nèi)傷密切相關(guān)，其根本原因是腎氣虧虛、腎精不固，病位主要在腎，與脾胃虛衰關(guān)系密切。腎為先天之本，脾為后天之本，因此中醫(yī)認(rèn)為通過補脾益腎可以起到延年益壽、防病抗衰老的作用[16]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，針對衰老機制的相關(guān)研究日益增多，出現(xiàn)了自由基學(xué)說、端粒學(xué)說、DNA 損傷修復(fù)學(xué)說、免疫衰老學(xué)說、內(nèi)分泌學(xué)說等，其中自由基學(xué)說受到廣泛認(rèn)可[17]。中醫(yī)指出，腎虛的本質(zhì)涉及多個衰老學(xué)說。腎虛患者體內(nèi)存在自由基損傷且身體免疫功能紊亂，同時還存在神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)?？梢?，腎虛實質(zhì)涉及自由基損傷學(xué)說、免疫功能下降學(xué)說和神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)學(xué)說等關(guān)于衰老的機制。多項研究表明，抗衰老中藥可通過提高體內(nèi)抗氧化酶活性、清除過剩的ROS 抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護細(xì)胞免受氧化損傷，達到延緩衰老的目的[18-19]。

肉蓯蓉歸腎經(jīng)，功效為補腎陽、益精血，《神農(nóng)本草經(jīng)疏》 記載：“肉蓯蓉為滋腎補精血之要藥”[20]。目前對肉蓯蓉延緩衰老的研究多集中在糖類、苯乙醇苷類成分對D-半乳糖致衰老大鼠模型的保護作用。其中肉蓯蓉多糖主要是通過抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶力、增強免疫功能和端粒酶活性等起到延緩衰老作用；肉蓯蓉總苷主要通過抗氧化、減少腦損傷和調(diào)節(jié)機體免疫力等功能起作用；苯乙醇苷類物質(zhì)中的松果菊苷可通過ROS 信號通路、飲食限制信號通路和胰島素/胰島素樣生長因子信號通路延長線蟲的壽命[21]。肉蓯蓉延緩衰老的功能已經(jīng)得到證實，但其作用機制研究尚不充分。

本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，紅景天苷和6-去氧梓醇可能通過作用于ⅠⅠS 通路上的HRAS、HK2和甲狀腺激素通路上的HRAS、ESR1，共同調(diào)節(jié)線粒體功能、減少胰島素抵抗，進而發(fā)揮延緩衰老作用[22]；有報道稱抑制Ras/Raf/MEK/ERK 和Ras/PⅠ3K/PTEN/Akt/mTOR 途徑可以延緩細(xì)胞衰老[23]，毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷F、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、連翹脂素葡萄糖苷、紅景天苷可能作用于HSP90AA1、ESR1 共 同 調(diào) 節(jié)PⅠ3K/Akt/mTOR[24-25]，紅景天苷可能通過作用于HRAS 調(diào)節(jié)PⅠ3K/Akt/mTOR、Ras/Raf/MEK/ERK 和Ras/PⅠ3K/PTEN/Akt/mTOR[23]，2′-乙酰毛蕊花糖苷可作用于F2 調(diào)節(jié)MMP-2[26]，松果菊苷、毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷F、異毛蕊花糖苷、2′-乙酰毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷A、紅景天苷與MMP2 結(jié)合，從而調(diào)節(jié)c-Raf/MEK/ERK和ERK/MAPK 通路[27]，以上化合物均可能通過抑制癌癥信號通路從而延緩衰老；磷脂酶D（PLD）下調(diào)可刺激人體細(xì)胞中ROS 的積累從而加速細(xì)胞衰老，這被廣泛認(rèn)為在衰老中起重要作用，紅景天苷和2′-乙酰毛蕊花糖苷可能分別作用于HRAS 和F2，通過激活RAS、cAMP 通路共同上調(diào)PLD，從而降低ROS 的堆積延緩衰老[28]。以上結(jié)果顯示HRAS 基因在抗衰老相關(guān)信號通路中發(fā)揮了重要作用，且KEGG 通路分析顯示，HRAS 是人類壽命相關(guān)信號通路ⅠGF-1/PⅠ3K/Akt/FoxO 中的一個關(guān)鍵基因，為后續(xù)利用線蟲進行體內(nèi)實驗驗證提供了依據(jù)。

衰老的自由基學(xué)說表明，氧化應(yīng)激機制是導(dǎo)致人體衰老的重要機制，也是當(dāng)前中藥延緩衰老的研究重點[29-30]。正常情況下，機體體內(nèi)自由基處于平衡狀態(tài)，抗氧化防御系統(tǒng)一旦遭到破壞，產(chǎn)生的過量ROS 使氧化還原反應(yīng)處于漸進氧化狀態(tài)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，攻擊細(xì)胞膜、DNA 和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致其變性、損傷，加速衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生[31]。本研究結(jié)果表明，肉蓯蓉能明顯提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px 的活力并降低ROS 的水平和MDA 的積累，進而改善過氧化氫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，此外還能有效緩解線蟲的熱應(yīng)激，顯著抑制脂褐素的積累并增強線蟲的身體彎曲能力，延長其壽命。

線蟲的ⅠⅠS信號通路與其生長、發(fā)育、壽命及代謝息息相關(guān)，是第一個被研究出與衰老相關(guān)的信號通路[32]，且與人類壽命ⅠGF-1/PⅠ3K/Akt/FOXO 通路同源[33]。線蟲體內(nèi)的胰島素信號受體為DAF-2，位于細(xì)胞膜上。當(dāng)活性物質(zhì)激活DAF-2 受體時，可以使PⅠ3K的同源物AGE-1活化，AGE-1產(chǎn)生的第二信使可以促使下游的Akt 被激活，進而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子DAF-16。磷酸化的DAF-16 不能進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。因此抑制DAF-2，其對DAF-16的負(fù)調(diào)控作用解除，DAF-16進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，并與細(xì)胞核中的其他因子相互作用，包括SⅠR-2.1、HSF-1 和SKN-1，使得線蟲壽命延長[34]。線蟲Nrf家族轉(zhuǎn)錄因子SKN-1是機體對氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分。ⅠⅠS 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可直接抑制SKN-1，這一過程與DAF-16類似，ⅠⅠS通路上的Akt-1、Akt-2和SGK-1 都可以通過磷酸化SKN-1 進而抑制SKN-1的活性[35]。線蟲體內(nèi)實驗研究結(jié)果表明，肉蓯蓉可以通過下調(diào)ⅠⅠS 通路，即降低daf-2、age-1和akt-1基因的表達水平，從而降低DAF-16 及SKN-1 的磷酸化水平，并促進其核易位，進而上調(diào)下游抗氧化相關(guān)蛋白基因與熱休克相關(guān)基因的表達水平，最終使線蟲延長壽命，減緩衰老。

綜上，本研究以肉蓯蓉中潛在功能因子為研究對象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)解析藥材-成分-靶點-通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析得到其延緩衰老可能的作用靶點和通路，根據(jù)預(yù)測結(jié)果進一步利用線蟲體內(nèi)實驗驗證肉蓯蓉延緩衰老的作用機制，結(jié)果表明肉蓯蓉能明顯延長線蟲壽命，抑制衰老色素積累并改善線蟲因衰老引起的運動能力下降，通過增強線蟲抗氧化系統(tǒng)有效抵抗熱應(yīng)激及氧化應(yīng)激造成的自由基損傷。肉蓯蓉介導(dǎo)的延壽作用機制可能是通過ⅠⅠS信號通路下調(diào)daf-2，age-1，上調(diào)daf-16及其下游靶基因（sod-3、mtl-1、gst-4、ctl-1和ctl-2），同時激活skn-1和熱休克相關(guān)基因（hsf-1、hsp-16.1和hsp-16.2）的表達來實現(xiàn)的。