不同種源銀柴胡及其偽品的ⅠTS2序列分析與鑒別△

李振凱，馮璐，楊燕，宋樂，王紅，李彥青，高跳，彭勵(lì)

寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

中藥銀柴胡是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的一種清虛熱、除疳熱的根類藥材，臨床中多用于治療陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、小兒疳熱等證，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)銀柴胡還具有抗炎、抗過敏、抗癌等功效，具有良好的藥用價(jià)值[1]。20 世紀(jì)60 年代，銀柴胡作為首批中藥材入選《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）1963 年版[2]，并一直收錄至今，其基原植物為石竹科繁縷屬植物銀柴胡Stellaria dichotomaL.var.lanceolataBge.，至今無新的品種納入。

寧夏為銀柴胡的道地產(chǎn)區(qū)，自20世紀(jì)80年代引種馴化成功后，已有40 年的銀柴胡種植歷史。目前，寧夏同心縣已建成了全國最大的銀柴胡種植基地，獲得了“同心銀柴胡”國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志認(rèn)證。但是在銀柴胡由野生轉(zhuǎn)為栽培的過程中，其生境和種植方式產(chǎn)生了顯著的變化。尤其是農(nóng)戶長期自繁、自用，導(dǎo)致銀柴胡種質(zhì)出現(xiàn)不同程度的退化。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，部分產(chǎn)地植株出現(xiàn)形態(tài)矮化、葉片變厚、種子千粒質(zhì)量下降、抗逆性變?nèi)醯痊F(xiàn)象。目前，生境的變化或栽培技術(shù)的不同是否引起了栽培銀柴胡種質(zhì)的改變尚未見報(bào)道。有關(guān)銀柴胡偽品從古至今均有記載。清代《本草崇原集說》中記載：“今市肆中另覓草根白色而大，不知何種名銀柴胡，此偽充也，不可用?！盵3]在近現(xiàn)代臨床用藥和研究中，不僅發(fā)現(xiàn)霞草Gypsophila oldhamiana Miq.、旱麥瓶草Silene jenisseensisWilld、女婁菜Silene apricaTurcx.ex Fisch.et Mey.、燈芯草蚤綴Arenaria dahuricaFisch.ex Ser.、蠅子草Silene gallicaLinn.、石竹Dianthus chinensisL.等銀柴胡近緣植物的根偽充銀柴胡的現(xiàn)象，還有未定名銀柴胡偽品的記錄[4-5]。因此，實(shí)際栽培生產(chǎn)中銀柴胡品種退化的現(xiàn)象是否與種質(zhì)資源差異、偽品混入有關(guān)均有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

中藥材DNA 條形碼是一種基于分子生物學(xué)的新型中藥材鑒別方法[6-7]，其鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性已被大量研究結(jié)果所證實(shí)?！吨袊幍洹?015 年版起收錄中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，成為鑒別藥材真?zhèn)魏捅ＷC中藥材臨床應(yīng)用準(zhǔn)確、安全、有效的技術(shù)手段。陳士林[8]通過對(duì)10 批銀柴胡藥材的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ⅠTS2）序列進(jìn)行分析，明確了以228 bp 的ⅠTS2 序列為主體的標(biāo)準(zhǔn)銀柴胡DNA條形碼，為銀柴胡的分子鑒定提供了依據(jù)。

本研究以標(biāo)準(zhǔn)銀柴胡DNA 條形碼ⅠTS2 序列為鑒定依據(jù)，對(duì)收集的包括不同產(chǎn)地、不同生活型（野生、栽培）的17 份銀柴胡和2 份偽品進(jìn)行ⅠTS2序列分析，以期對(duì)不同種源銀柴胡及偽品進(jìn)行鑒別，為銀柴胡種質(zhì)資源多樣性研究、良種繁育及從源頭保證藥材生產(chǎn)的安全有效提供參考。

1 材料

1.1 儀器

JXFSTPRP-CL 型全自動(dòng)樣品研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；MiniSpin plus 型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；MⅠULAB型恒溫金屬浴（杭州米歐儀器有限公司）；MyCycler 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

銀柴胡種子分別采集自不同產(chǎn)地銀柴胡植株，經(jīng)寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院彭勵(lì)教授鑒定為銀柴胡Stellaria dichotomaL.var.lanceolataBge.的種子。其中1份銀柴胡種子（S16）為航天誘變后的F1代種子。所有銀柴胡種子于2021 年5 月種植于相同試驗(yàn)田中，期間采用相同的田間管理，在生長10 周后，取其葉片用于DNA 提取和測序分析。2 份偽品于2020 年5 月采集植株，經(jīng)彭勵(lì)教授鑒定為霞草Gypsophila oldhamianaMiq.和旱麥瓶草Silene jenisseensisWilld.，將其移栽至與種植銀柴胡相同的試驗(yàn)田中，進(jìn)行相同的田間管理，同銀柴胡樣品采集同一時(shí)期采集新鮮葉片用于DNA 提取和測序分析（表1）。通過《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》獲得了銀柴胡的標(biāo)準(zhǔn)序列[8]；霞草、旱麥瓶草、女婁菜、燈芯草蚤綴、蠅子草和石竹的ⅠTS2 序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫，序列信息見表2。

表1 銀柴胡及其混偽品植物樣品采集信息

表2 銀柴胡及其混偽品的ITS2檢索序列信息

Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒 [批號(hào)：B518261，生工生物工程（上海）股份有限公司]。

2 方法

2.1 DNA的提取

隨機(jī)從每份樣品中取新鮮葉片1～2片，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，分別加入液氮充分碾磨并離心，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增及測序

采用《中國藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》中ⅠTS2 通用引物：正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCC-AGACTACAAT-3′。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：dNTP mix（2.5 mmol·L-1）4.0 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各2.0 μL，Phusion DNA 聚合酶（2 U·μL-1）0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，5×Phusion HF Buffer 10 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性98 ℃，3 min；變性98 ℃，10 s，退火58 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，循環(huán)30 次；延伸72 ℃，8 min，16 ℃保存。將所得的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物一并送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA序列雙向測定。

2.3 序列處理與分析

將所得序列一并導(dǎo)入ⅠTS2 數(shù)據(jù)庫（http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）進(jìn)行序列注釋，去除兩端（5.8S和28S rRNA）區(qū)段，得到完整的ⅠTS2 序列。利用MEGA 8.0 軟件對(duì)所得序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算鳥嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比，選擇鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離模型計(jì)算得各樣本遺傳距離值。將得到的ⅠTS2 序列導(dǎo)入美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBⅠ）數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn) 行BLAST 分析，導(dǎo)入“中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)”（http://59.108.50.222/china/index.php? optionid=174#this）進(jìn)行物種鑒定。利用ⅠTS2數(shù)據(jù)庫預(yù)測ⅠTS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同種源銀柴胡ⅠTS2序列一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過對(duì)17份銀柴胡樣品的ⅠTS2序列進(jìn)行測序分析，共得到3 種單倍型序列。如圖1 所示，樣品S1～S3、S5～S8、S10、S12～S16 擁有相同的ⅠTS2 序列單倍型，為方便描述，將該序列命名為YCH1；樣品S4、S9、S11 的ⅠTS2 序列相同，命名為YCH2；樣品S17 的ⅠTS2 序列與其他樣品均不相同，命名為YCH3。其中YCH1 片段大小為228 bp，G+C 占比為57.46%；YCH2 片段大小為228 bp，G+C 占比為57.02%；YCH3 片段大小為224 bp，G+C 占比為55.36%。參照《中國藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》中公布的銀柴胡標(biāo)準(zhǔn)ⅠTS2序列YCH，對(duì)所有序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，YCH1和YCH2單倍型與YCH 一致，2 個(gè)單倍型存在的3 個(gè)變異位點(diǎn)均為YCH 公布的3 個(gè)變異位點(diǎn)，分別為89 bp處的C-胸腺嘧啶（T）變異位點(diǎn)、176 bp 處的T-C 變異位點(diǎn)和179 bp處的C-腺嘌呤（A）變異位點(diǎn)。YCH3單倍型與YCH比對(duì)含有4個(gè)堿基缺失，分別為61 bp處的C 缺失、102 bp 處的A 缺失、112 bp 處的C 缺失和172 bp 處的G缺失；另外在標(biāo)準(zhǔn)序列的3個(gè)變異位點(diǎn)上，89 bp位點(diǎn)為C、176 bp位點(diǎn)為T、179 bp位點(diǎn)為C，與YCH1單倍型的變異位點(diǎn)堿基相同。

圖1 17份銀柴胡樣品ITS2序列對(duì)比

3.2 銀柴胡與偽品基原植物ⅠTS2序列對(duì)比分析

通過檢索GenBank 數(shù)據(jù)庫和《中國藥典中藥材DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》獲得了霞草、旱麥瓶草、女婁菜、燈芯草蚤綴、蠅子草和石竹等銀柴胡偽品的6條ⅠTS2序列，分別為XC、HMPC、NLC、DXCZZ、YZC 和SZ，同時(shí)通過對(duì)霞草和旱麥瓶草的ⅠTS2 序列進(jìn)行測序，得到2 條單倍型序列XC1 和HMPC1。進(jìn)一步對(duì)銀柴胡及6 種偽品ⅠTS2 序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果如圖2 和表3 所示，相較于3 種單倍型銀柴胡ⅠTS2 序列與YCH 的差異，來自于6 種偽品基原植物的ⅠTS2 序列在序列長度、G+C 占比及變異位點(diǎn)上均存在較大的差異。

表3 不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ITS2序列特征

圖2 不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ITS2序列

將獲得的3 種單倍型銀柴胡ⅠTS2 序列和6 種偽品的ⅠTS2 序列導(dǎo)入NCBⅠ數(shù)據(jù)庫，以YCH 為對(duì)照進(jìn)行BLAST 分析，結(jié)果顯示YCH1 與標(biāo)準(zhǔn)序列相似度為100%，YCH2 為98.68%，YCH3 為98.25%，而6 種偽品基原植物ⅠTS2 序列均未得到比對(duì)結(jié)果。進(jìn)一步將以上序列分別導(dǎo)入“中藥材DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)”進(jìn)行物種鑒定，結(jié)果顯示來自銀柴胡的3 種單倍型序列均被鑒定為銀柴胡，其中YCH1和YCH2序列與數(shù)據(jù)庫中銀柴胡ⅠTS2 相似性最高均為100%，YCH3 序列相似性最高為98.20%，其余6 種偽品基原植物ⅠTS2序列鑒定結(jié)果均非銀柴胡。

3.3 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

基于K2P 模型計(jì)算不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ⅠTS2 序列遺傳距離，結(jié)果見表4。銀柴胡的YCH1單倍型序列與YCH一致，遺傳距離最小，為0；次之為YCH2 單倍型，遺傳距離為0.014；YCH3 遺傳距離最大，為0.936。而偽品基原植物ⅠTS2 序列與YCH 均表現(xiàn)出較大的遺傳距離，其中旱麥瓶草和蠅子草ⅠTS2 序列（HMPC、HMPC1 和YZC）遺傳距離相對(duì)較小，分別為1.610、1.621 和1.610，其余植物ⅠTS2 序列的遺傳距離均超過1.800。進(jìn)一步構(gòu)建不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ⅠTS2 序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。銀柴胡、旱麥瓶草和蠅子草聚為1 個(gè)大的分支，霞草、石竹、女婁菜和燈芯草蚤綴聚為1個(gè)大的分支，其中YCH1和YCH2單倍型序列與YCH聚為1個(gè)小的分支，又與YCH3同為1個(gè)分支，此外HMPC1 與HMPC、XC1 和XC 各聚為1 個(gè)分支。綜上，基于K2P 模型計(jì)算的ⅠTS2 序列遺傳距離和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出一致的特征，說明不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物間存在不同的親緣距離。

圖3 不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ITS2序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ITS2序列遺傳距離

3.4 ⅠTS2二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

將得到的不同單倍型銀柴胡及偽品的ⅠTS2 序列分別導(dǎo)入ⅠTS2 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，成功獲得了YCH1、YCH2、YCH3、XC、HMPC、YZC、SZ的ⅠTS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，未成功預(yù)測出女婁菜和燈芯草蚤綴可靠的二級(jí)結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果如圖4 所示，7 個(gè)序列單倍型的ⅠTS2 二級(jí)結(jié)構(gòu)均為典型的被子植物ⅠTS2 序列一環(huán)（主環(huán)）四臂（4 個(gè)螺旋區(qū)）結(jié)構(gòu)，但是不同序列在部分莖臂和環(huán)上存在一定差異。其中與YCH 相似度最高的YCH1 和YCH2 單倍型具有完全一致的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而相似度略低的YCH3 單倍型的Ⅱ臂多1 個(gè)內(nèi)環(huán)，在Ⅲ臂的中段少了1 個(gè)內(nèi)環(huán)，多了1 個(gè)凸環(huán)。其余4 個(gè)偽品基原植物的ⅠTS2 序列與3 種單倍型銀柴胡ⅠTS2 序列在中心環(huán)結(jié)構(gòu)、莖臂長度及內(nèi)環(huán)和凸環(huán)數(shù)量、結(jié)構(gòu)上均表現(xiàn)出顯著差異。

圖4 不同單倍型銀柴胡及偽品基原植物ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

4 討論與結(jié)論

近年來，隨著分子鑒定和DNA 條形碼技術(shù)的不斷成熟，ⅠTS2 序列在中藥材尤其是植物類中藥材鑒別分析中得到了廣泛的應(yīng)用和可靠的效果，并成為中藥材DNA條形碼建立的主體序列之一[7]?！吨袊幍渲兴幉腄NA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》公布了包括銀柴胡ⅠTS2序列DNA條形碼在內(nèi)的500余種中藥材的DNA條形碼，為中藥材提供了可靠鑒定依據(jù)的同時(shí)，也為中草藥基原植物、種子真?zhèn)舞b別和種質(zhì)資源分析等相關(guān)研究提供了有效的分析手段。但在已有研究報(bào)道中，學(xué)者普遍關(guān)注銀柴胡的ⅠTS 序列，對(duì)于ⅠTS2序列的應(yīng)用和研究較少，如李軍等[9]比較了4種DNA條形碼序列ⅠTS、psbA-trnH、rbcL和matK在銀柴胡藥材及混偽品中的鑒別效果；孟祥善等[10]利用ⅠTS 序列分析了銀柴胡種質(zhì)資源的多樣性。而ⅠTS2序列相較于ⅠTS 序列更易獲得，承受的選擇壓力較小，相對(duì)變化較大，且具有相對(duì)保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在物種鑒定、遺傳物質(zhì)分析中具有更大的優(yōu)勢[11]。

本研究通過對(duì)17份不同種源銀柴胡ⅠTS2序列進(jìn)行測序和分析，共得到3條不同序列單倍型（YCH1，YCH2 和YCH3）。通過序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為YCH1 或YCH2 單倍型的16 份銀柴胡種質(zhì)ⅠTS2 序列與標(biāo)準(zhǔn)銀柴胡DNA 條形碼ⅠTS2 序列高度一致。另有1 份樣品為YCH3 單倍型，其ⅠTS2 序列與銀柴胡標(biāo)準(zhǔn)序列的相似度達(dá)到98.20%，但其存在4 個(gè)堿基缺失，且與另外2 個(gè)單倍型具有較大的遺傳距離（0.936～0.937）。此外，ⅠTS2 序列在細(xì)胞內(nèi)以二級(jí)結(jié)構(gòu)的形式發(fā)揮功能，這種結(jié)構(gòu)蘊(yùn)含著更為豐富的遺傳信息[12]。進(jìn)一步的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，YCH1和YCH2 單倍型具有相同的ⅠTS2 序列結(jié)構(gòu)，但YCH3單倍型存在多處的結(jié)構(gòu)差異，說明YCH1 和YCH2可能具有相同的遺傳信息和生物功能，但YCH3 可能存在一定的差異。YCH3 單倍型來源于寧夏石嘴山市大武口區(qū)石炭井煤礦采集的銀柴胡植物樣品，在本課題組前期的銀柴胡資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該采集地與其他采集地的生境有顯著的差異，表現(xiàn)為高含鹽量（全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為297.74 g·kg-1），pH為7.29，而非其他產(chǎn)地的堿性土壤，土壤質(zhì)地以砂礫為主，與其他產(chǎn)地中砂土或粉砂土的生境也有顯著的差異。大量的研究證實(shí)，植物長期生長在特定環(huán)境中，受環(huán)境中各種生態(tài)因子的綜合影響可能引起植物DNA突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量畸變等遺傳物質(zhì)的改變，進(jìn)而改變新陳代謝調(diào)控酶，使得次生代謝的產(chǎn)物發(fā)生變異[13-15]。因此是否有更多遺傳物質(zhì)的變化，亦或是有新品種的產(chǎn)生，以及這些變異是否會(huì)引起藥材成分和功效的變化尚需進(jìn)一步關(guān)注和深入研究。此外，對(duì)6 種偽品基原植物ⅠTS2 序列的鑒定分析也進(jìn)一步證明其與正品銀柴胡存在遺傳物質(zhì)的本質(zhì)差異，其ⅠTS2 序列不僅在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與正品銀柴胡不同，二級(jí)結(jié)構(gòu)也與銀柴胡存在顯著差異，因此，可以采用ⅠTS2技術(shù)進(jìn)行銀柴胡及其偽品的鑒定。

道地藥材是指經(jīng)過中醫(yī)臨床的長期驗(yàn)證，具有特定的種質(zhì)、特定的產(chǎn)區(qū)和加工方法，質(zhì)優(yōu)效佳、具有較高知名度的藥材[16-17]。其形成過程往往是特定基因型在特定生境下次生代謝過程關(guān)鍵酶基因表達(dá)受到時(shí)空差異等復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果[18]。因此，具有道地性的種質(zhì)資源被認(rèn)為是決定道地藥材品質(zhì)的關(guān)鍵因素[19-20]。通過本研究可以發(fā)現(xiàn)，目前寧夏栽培銀柴胡與野生銀柴胡保持著一致或十分接近的ⅠTS2 序列特征，初步可以判斷其具有相似的種質(zhì)特性，為寧夏銀柴胡道地性形成機(jī)制研究提供了有效的種質(zhì)資源依據(jù)。此外，田間生產(chǎn)中出現(xiàn)的品種退化現(xiàn)象可能是田間管理方法或生境差異導(dǎo)致，因此建議進(jìn)一步建立健全規(guī)范的銀柴胡良種繁育技術(shù)，制定相關(guān)的操作規(guī)程。本研究結(jié)果對(duì)銀柴胡真?zhèn)舞b別、種質(zhì)資源篩選、新品種選育及寧夏銀柴胡道地產(chǎn)區(qū)建設(shè)有積極的借鑒意義。