紫玉淮山組織培養(yǎng)技術(shù)

農(nóng)艷豐，李健

（百色學(xué)院，廣西百色 533000）

紫玉淮山，山藥屬，是廣東省廣州市增城區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所從增城區(qū)小樓鎮(zhèn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)家種紅肉薯蕷變異株中選育出的優(yōu)良品系[1]。其營養(yǎng)豐富，含有淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、皂甙、淀粉酶、膽堿、氨基酸、維生素、鈣、鐵、鋅等20 多種營養(yǎng)元素，肉質(zhì)紫紅，特別是花青素含量比普通淮山高[2]。紫玉淮山田間表現(xiàn)為抗病、抗逆性強[3]，因此，多地進行推廣種植，江西、江蘇、福建、廣西等均能適應(yīng)，并通過淺生槽技術(shù)栽培獲得高產(chǎn)[4-7]。紫玉淮山的生產(chǎn)種植中，利用薯塊繁殖，用種數(shù)量大，長期種植容易因病毒積累發(fā)生種性退化，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量下降。組培快繁技術(shù)不僅可以加快山藥種苗的繁育和推廣，也是山藥種苗脫毒復(fù)壯的有效手段。

目前國內(nèi)對山藥組培技術(shù)開展了較多的研究。王碧琴等[8]利用紫山藥的莖尖、莖段為材料開展組織培養(yǎng)，觀察得出兩者初始培養(yǎng)的成活率分別為43%和91%，培養(yǎng)基中添抗了褐化劑，外植體的褐化率降低。韓曉勇等[9]選用臺州紫山藥帶腋芽的莖段為材料開展組織培養(yǎng)，篩選出適宜的誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。朱海萍等[10]則采用紫色薯蕷塊莖進行快繁，成功誘導(dǎo)愈傷組織并誘導(dǎo)叢生芽。陳芝華等[11]采用‘明淮2 號’褐苞薯蕷帶腋芽莖段為外植體進行山藥組培快繁體系的優(yōu)化，完善了山藥組培快繁技術(shù)體系。但紫玉淮山的組織培養(yǎng)尚未見有研究報道。由于不同類型山藥組培快繁存在一定差異，不能滿足紫玉淮山的組培快繁生產(chǎn)要求，因此需要參考其他品種山藥的技術(shù)以建立其組織培養(yǎng)技術(shù)體系。本文以紫玉淮山嫩莖作為外植體進行組培快繁技術(shù)研究，為紫玉淮山種苗工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗以紫玉淮山的塊莖為試驗材料，催芽長出幼苗后待用。取長勢一致的紫玉淮山嫩莖，去掉葉片，從莖尖至下依次取2 節(jié)，作上、中、下部3 個處理，切成2～3 cm 帶腋芽的莖段。洗衣粉溶液浸泡10 min，自來水沖洗10 min，在超凈工作臺中使用75%酒精滅菌30 s，無菌水沖洗1 次，再使用0.1%升汞滅菌，上部莖段浸泡時間為4 min、6 min、8 min；中部莖段浸泡時間為6 min、8 min、10 min；下部莖段浸泡時間為8 min、10 min、12 min。升汞滅菌后，無菌水漂洗5 次。共9 個處理，每個處理接種30 個莖段在MS+1 mg/L KT 培養(yǎng)基上。培養(yǎng)15 d 后統(tǒng)計每個處理的污染數(shù)、存活數(shù)、褐化數(shù)。

污染率（%）＝污染外植體數(shù)／接種總數(shù)×100

存活率（%）＝存活外植體數(shù)／接種總數(shù)×100

褐化率（%）＝褐化外植體數(shù)／接種總數(shù)×100

1.1 初代培養(yǎng)

以最佳滅菌方案處理外植體后，分別接種于MS+KT（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L）的初代培養(yǎng)基中，共設(shè)6 個處理，每個處理分別接種30 個外植體，培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計每個處理莖段的萌芽數(shù)和總芽數(shù)，計算萌芽率和增殖系數(shù)。

萌芽率（%）＝萌芽的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)×100

增殖系數(shù)＝芽總數(shù)／接種外植體數(shù)

1.2 繼代培養(yǎng)

取初代培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的無菌芽切成不帶葉子的莖段接種在MS+3 mg/L KT+（0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4 mg/L）NAA 培養(yǎng)基，每個處理接種30 個外植體，共5 個處理。培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計每個處理萌發(fā)的芽數(shù)和芽高，計算莖段的增殖系數(shù)，記錄各處理的長勢。

1.3 生根培養(yǎng)

取長勢健壯的無菌芽，將其切成3～4 cm，接種在MS、1/2MS+NAA（0 mg/L+0.1 mg/L，0.3 mg/L、0.5 mg/L）處理的培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基都添加1 g/L 活性炭。共5 個處理，每個處理接種30 個無菌芽。30 d 后，分別統(tǒng)計生根無菌芽數(shù)、總根數(shù)，計算紫玉淮山組培苗的生根率、平均根數(shù)。

生根率（%）＝生根芽數(shù)／接種總芽數(shù)×100

平均根數(shù)（條）＝總根數(shù)／生根芽數(shù)

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強度為2000～3500 lx，光照時間為16 h。

1.5 馴化移栽

將生長健壯大致一致的組培苗移出培養(yǎng)室，在室溫?zé)捗? d。取出清洗組培苗基部干凈，用1%（質(zhì)量體積比）多菌靈溶液浸泡根部20 min 后瀝干水分，再移栽到不同配方的基質(zhì)中。移栽基質(zhì)設(shè)置4 組，分別為蛭石與營養(yǎng)土=1∶3、有機肥營養(yǎng)土、干凈的沙子、沙子與菜園土=1∶3。每個處理30株。1 個月后統(tǒng)計成活率。

成活率（%）=成活株數(shù)/移栽總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 取材部位及滅菌時間的篩選

以不同部位紫玉淮山莖段進行不同滅菌處理，探討適宜的取材部位和滅菌時間。如表1 所示，使用0.1%升汞作為滅菌劑對紫玉淮山莖段滅菌效果好，整體上污染率均達到15%以下。存活率以中上部為較好，達70%以上，褐化率隨著滅菌時間的增加而增大，莖段越老褐化越程度越高。綜合考慮，為達到理想滅菌效果，減少褐化率，保持存活率，試驗取材應(yīng)以中上部莖段為宜，滅菌時間以0.1%升汞處理4～8 min 為宜。

表1 0.1%升汞不同滅菌時間對紫玉淮山不同部位莖段的滅菌效果

2.2 KT 對莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)萌芽的影響

KT 為細胞分裂素，具有誘導(dǎo)芽的分化、促進側(cè)芽萌發(fā)生長的作用。莖段初代培養(yǎng)中，側(cè)芽不斷萌發(fā)、生長，逐漸長成芽叢，反復(fù)切割，轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，便可以在短期內(nèi)獲得大量的芽（圖1）。由表2 可知，同處理中，上部莖段（莖尖）的萌芽率和增殖率皆高于中下部莖段，萌芽率最高可達100%，中下部的萌芽率最高均不超過77%；添加了KT 的處理中，增殖系數(shù)相對于對照組呈顯著差異，上中部莖段在添加KT 2～4 mg/L 處理中，增殖系數(shù)均高于2.0，而下部的莖段整體增殖系數(shù)均不到1.0，可能與下部腋芽活躍程度有關(guān)。綜合萌芽率和增殖系數(shù)考慮，初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基適合選用MS+3 mg/L KT 培養(yǎng)基，以上部莖段為外植體的萌芽率和增殖系數(shù)最高。

圖1 MS+3 mg/L KT 培養(yǎng)基在紫玉淮山初代誘導(dǎo)中的應(yīng)用效果

表2 KT 對紫玉淮山莖段誘導(dǎo)萌芽的效果

2.3 不同激素組合對繼代增殖的影響

在添加KT 3.0 mg/L 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加不同濃度的NAA，探討生長素和細胞分裂素配合使用是否具有協(xié)同作用。由表3 可知，每個處理增殖系數(shù)達到2.5 以上，其中添加了NAA 0.1 mg/L 和0.2 mg/L 的處理達到顯著差異。各個處理的平均芽高均達到3.0 cm 以上，并出現(xiàn)顯著差異。長勢則以添加NAA 0.1 mg/L、0.2 mg/L 和0.3 mg/L 的處理為好，見圖2。綜合增殖系數(shù)、平均芽高和長勢考慮，繼代培養(yǎng)最佳的激素組合為MS+KT 3 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L。

表3 不同濃度NAA 與KT 組合對繼代增殖的效果

圖2 紫玉淮山繼代培養(yǎng)效果

2.4 生根培養(yǎng)

將生長健壯一致的無菌芽接種到生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)7～10 d，無菌苗基部開始著生1～3 條白或粉紅色粗短的須根，15 d 后底部逐步長白色主根，見圖3。由表4 可知，MS 減半的培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)生根，同時添加了生長素NAA 的處理生根率均達到80%以上，平均根數(shù)可達4 條以上，根系長，較粗，植株葉呈淡紫色。綜合考慮，生根培養(yǎng)基選用1/2 MS+NAA 0.5 mg/L 培養(yǎng)基較好，其生根率高，植株生長健壯，選用此激素配方培養(yǎng)出的健壯組培苗，更能適應(yīng)下一步的煉苗移栽。

表4 不同培養(yǎng)基對生根培養(yǎng)的效果

圖3 紫玉淮山生根培養(yǎng)效果

2.5 馴化移栽

由表5 的數(shù)據(jù)可以看出，在不同移栽基質(zhì)處理中，4 種基質(zhì)中蛭石∶營養(yǎng)土=1∶3 處理成活率較高（86.7%），其次是有機肥營養(yǎng)土，沙子作為移栽基質(zhì)的成活率最低。蛭石可以改善營養(yǎng)土結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基質(zhì)pH、保水性較好，不易結(jié)塊且透氣性強，營養(yǎng)土能為植物提供生長所需的多種養(yǎng)分，蛭石和營養(yǎng)土按1∶3 的體積配比能滿足組培苗對養(yǎng)分和水分、基質(zhì)空氣的需求。有機肥營養(yǎng)土所含的礦質(zhì)元素較多能供給組培苗的生長，但透水性不比蛭石透水性好，容易爛根。細沙透水性強，混合菜園土作為移栽基質(zhì)可以增強透水透氣。移栽組培苗葉片整體呈紫綠色。長勢好的處理，葉片較大，葉柄粗壯些，綜合結(jié)果，以蛭石與營養(yǎng)土配比1∶3 為最優(yōu)的方案。

表5 不同移栽基質(zhì)對組培苗移栽的效果

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)過程中，淮山外植體普遍存在著褐化現(xiàn)象。試驗切割組培材料時，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)外植體枯死，及基部培養(yǎng)基黑褐化的現(xiàn)象[12]。嫩莖的不同部位誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的效果不同，本實驗將嫩莖分為三個部分分別來探討合適的外植體，發(fā)現(xiàn)中上部作為外植體較合適，可能是因為其木質(zhì)化程度低，不容易褐化，細胞活躍，腋芽容易誘導(dǎo)出來。植物組織和細胞的增殖、分化、生根過程中，受到內(nèi)源激素和外源激素共同調(diào)控。本實驗中，添加活性炭作為抗褐化劑，具有良好的效果。唐君等[13]認為，淮山組織培養(yǎng)過程中，品種基因型和培養(yǎng)基中激素配比會對外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)及植株再生造成一定影響。不同階段的組織培養(yǎng)中，外植體所需的外源激素種類、濃度和配比并不完全一致。因此，在植物組織培養(yǎng)過程中，我們應(yīng)根據(jù)植物各個生長階段的需要，選用合適的培養(yǎng)基。通常來說，淮山組織培養(yǎng)過程中，NAA 和2，4-D 為常用的生長素，6-BA、KT為常用細胞分裂素。本實驗的預(yù)實驗中，使用6-BA 誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的效果一般，KT 的誘導(dǎo)效果明顯。對生長素與細胞分裂素配合使用，生長素濃度高時利于生根，而細胞分裂素濃度高時利于長芽。在本次試驗過程中發(fā)現(xiàn)，初代培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)階段，細胞分裂素的影響顯著，生長素?zé)o明顯影響。生根培養(yǎng)中，減少大量元素和不添加外源物對生根率和平均根數(shù)影響不大，但生長狀況影響較大。

本試驗研究表明，對紫玉淮山莖段的滅菌處理及誘導(dǎo)效果，以中上部莖段0.1%升汞處理4～8 min為宜，存活率高，污染率和褐化率低，滅菌效果好，同時誘導(dǎo)萌芽效果較好。初代培養(yǎng)基以MS+3 mg/L KT 較好；繼代腋芽培養(yǎng)增殖率最佳的培養(yǎng)基為MS+KT 3 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L；生根培養(yǎng)基宜選用1/2 MS+NAA 0.5 mg/L；移栽基質(zhì)為蛭石與營養(yǎng)土配比1∶3。建立的組培快繁體系可為紫玉淮山工廠化生產(chǎn)種苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。