烘焙程度對小?？Х?-羥甲基糠醛生成的影響

劉興勇，陳興連，林 濤，王 麗，汪祿祥，李茂萱，邵金良

（云南省農業(yè)科學院 質量標準與檢測技術研究所，昆明 650205）

咖啡作為世界三大飲料之一，咖啡的消費量一直在增加[1]。咖啡具有提神醒腦、消除疲勞、生津止渴、利尿等功效[2]?？Х确职⒗瓤ǎ–offea arabica）、羅布斯塔（Coffea robusta）和利比里亞（Coffea liberica）三大原種，在中國稱為小粒、中粒和大粒種咖啡[3]。阿拉比卡咖啡（Coffea arabica）是全球生產最常見的咖啡品種，占咖啡總產量的75%以上[4]。云南是我國小?？Х戎鳟a區(qū)，咖啡種植面積和產量均占到全國的98%以上，云南具有低緯度、高海拔、晝夜溫差大等地理環(huán)境和氣候條件，生產的咖啡具有濃而不苦，香而不烈，略帶果酸味等特點[5]。

咖啡的品質取決于烘焙過程和工藝，起始烘焙溫度通常在180～250 ℃之間[6]，咖啡中酸類物質（綠原酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、咖啡?？鼘幩幔⑸飰A類（咖啡因、葫蘆巴堿）、糖類、脂肪和蛋白質等發(fā)生不同程度的美拉德、Strecker 降解、焦糖化等反應，生成吡嗪類、呋喃類、吡咯類、吡喃類和吡啶類化合物，還有大量的醛類、酮類、酚類、酯類、醇類化合物，這些化合物形成咖啡的特征風味[7-10]。烘焙咖啡中丙烯酰胺、5-羥甲基糠醛（5-HMF） 和羧甲基賴氨酸等已成為威脅咖啡飲用的安全性問題之一[11-12]。普遍認為，5-HMF 是由于糖等碳水化合物加熱分解所形成[13]，Hamzalolu 等[14]認為氨基酸、氨基酸-糖類混合物、維生素、多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素在共同加熱過程中也能形成少量的5-HMF。葡萄糖加熱轉化的呋喃果糖可以促進5-HMF 的形成，5-HMF 是咖啡烘焙過程中形成丙烯酰胺的重要中間體，二者含量呈負相關[15]。富含天門冬酰胺和葡萄糖的食品原料中，葡萄糖和天冬酰胺反應生成丙烯酰胺，進一步加熱分解而生成5-HMF；葡萄糖可直接分解為5-HMF，天門冬酰胺和葡萄糖是形成丙烯酰胺及5-HMF 的共同前體反應物。同時，5-HMF 與天冬酰胺反應也能生成丙烯酰胺[16]。5-HMF 與丙烯酰胺呈拮抗作用[15]。5-HMF 是美拉德反應和焦糖化反應的強度指示標志，用來衡量小?？Х群姹簾峒庸み^程中非酶促褐變的程度[17]。隨著人們生活水平、健康意識不斷提升，小?？Х鹊幕钚猿煞旨捌渖砉δ軅涫懿毮縖5]。5-HMF 作為咖啡烘焙中美拉德反應危害伴生物之一，在高濃度下，對人體黏膜、橫紋肌和內臟均具有刺激和損傷作用，具有基因毒性和遺傳毒性[18-19]。

目前，對云南小?？Х鹊难芯恐饕性谏锘钚晕镔|、抗氧化功能及品質[20-23]方面，針對烘焙過程中5-HMF 形成研究較少。本文以小粒生咖啡為對象，開展烘焙溫度、烘焙時間和烘焙方式對5-HMF 形成的影響，為優(yōu)化小粒咖啡烘焙工藝和質量控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮卡、卡蒂姆和卡杜拉生咖啡豆，普洱市思茅區(qū)云南咖啡交易中心。烘焙咖啡豆粉碎后過60目篩，盛放于咖啡包裝帶中，封口備用。

試劑：甲醇、乙腈（HPLC 級），德國Merck 公司產品，正己烷、氯化鈉、乙酸鈉、無水硫酸鎂、冰乙酸（AR 級），國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）粉末、C18粉，上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水由PURELAB flex 純水機系統(tǒng)制得，英國埃爾格ELGALabWater 公司。

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural）標準品（≥99%），美國Sigma-aldrich 公司。

1.2 儀器與設備

Waters e2695-2489 高效液相色譜儀、在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、2489 紫外檢測器、Empower 3 色譜數(shù)據工作站，美國Waters 公司；Gene Cafe 3D 熱風咖啡生豆烘焙機，韓國Genesis 公司；JJ200 電子分析天平，江蘇省常熟市雙杰測試儀器廠產品；KQ500-E 型超聲清洗器，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司產品；QL-861 漩渦混合器，江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 烘焙溫度烘焙溫度為180，200，220，240，250，260 ℃，烘焙時間為10 min，烘焙量為200 g，研究烘焙溫度對小粒咖啡5-HMF 形成的影響。

1.3.2 烘焙時間 烘焙時間為6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，20.0 min，烘焙溫度為230 ℃，烘焙量為200 g，研究烘焙時間對小?？Х?-HMF形成的影響。

1.3.3 烘焙方式[24]烘焙量為200 g，按表1的參數(shù)進行烘焙試驗，研究不同烘焙方式對小粒咖啡中5-HMF 形成的影響。

表1 咖啡豆烘焙的8 種程度參數(shù)Table 1 Parameters of eight roasting degree in roasted coffee

1.4 標準溶液的配制

1.4.1 5-HMF 標準儲備溶液 準確稱取5-HMF 10 mg（精確到0.0001 g），于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的5-HMF 標準儲備溶液，-18 ℃以下避光貯存，有效期12 個月。

1.4.2 5-HMF 標準中間溶液 準確吸取1.0 mL 5-HMF 標準品儲備溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，配制成5-HMF 標準中間溶液。-18 ℃以下避光貯存，有效期3 個月。

1.4.3 5-HMF 標準工作溶液 分別吸取5-HMF標準中間溶液0.10，0.20，0.50，1.00，2.50 mL，于10 mL 容量瓶中，用初始流動相定容至刻度，配制成5-HMF 標準工作溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 樣品的前處理方法

稱取粉碎過60 目篩的咖啡樣品2 g （精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，先加入5 mL 正己烷，超聲提取15～20 min，依次加入10 mL 水、10 mL乙腈和0.1 mL 乙酸，旋渦提取3～5 min，最后加入鹽析劑（3.0 g NaCl+1.0 g NaAc），去除正己烷，取乙腈溶液5 mL，加入凈化劑 （50 mg C18粉+20 mg PSA+200 mg MgSO4），旋渦提取3～5 min，以4 500 r/min 離心5 min 后，取2 mL 乙腈溶液過0.22 μm 濾膜，待測。

1.6 色譜檢測條件

Shiseido CAPCELL PAK MG C18色譜柱（150 mm×4.6 mm i.d.，5.0 μm）；柱溫30.0 ℃；流動相A為甲醇，流動相B 為水，梯度洗脫程序：0～15 min，10%A，15～20.0 min，10%～60%A，20～25 min，60%～10%A，25～30 min，10%A；流速0.80 mL/min。進樣量10.0 μL，檢測波長284 nm。

1.7 數(shù)據處理

利用Excel 2010 軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計；采用SPSS 22.0 軟件 Analyze 模塊下的Compare Means 進行方差分析，結果表示為“平均值±標準差”，并進行Duncan's 差異顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著；通過Excel 2010 進行數(shù)據圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 烘焙咖啡中5-HMF 含量分析

2.1.1 提取條件的優(yōu)化 烘焙咖啡基質比較復雜，含有色素、脂肪、蛋白質以及糖類等化合物[25]，常用的凈化方法有液液萃取法和固相萃取法，相關文獻采用正己烷液液萃取法進行凈化[26]，只能去除部分脂類，對咖啡中色素、其它脂類和糖類等雜質的去除效果較差。本試驗對提取劑、鹽析劑和凈化劑進行了優(yōu)化。結果顯示，提取劑為1%乙酸-乙腈溶液，鹽析劑為3.0 g NaCl+1.0 g NaAc，凈化劑為50 mg C18+20 mg PSA+200 mg MgSO4時，目標峰附近無雜質峰干擾，并且實現(xiàn)了基線分離（見圖2），確定的前處理條件分離和凈化效果較好，且5-HMF 回收率較好，達到90.6%以上，能夠滿足試驗要求。

圖1 5-羥甲基糠醛標準品HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural standard

圖2 微中烘焙中5-HMF 的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural in medium roasting degree

2.1.2 線性范圍、檢出限和定量限 用流動相配制質量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L 和50.0 mg/L 的5-HMF 標準工作溶液。在優(yōu)化后的測定條件下進行測定，以5-HMF 的峰面積（y）對其質量濃度（x） 做工作曲線，5-HMF 在0.5～50.0 mg/L 范圍內有良好的線性關系，相關系數(shù)（r）為0.9991。以5-HMF 色譜峰3 倍信噪比（S/N）計算檢出限（LOD）為0.01 mg/kg，以5-HMF 色譜峰10倍信噪比（S/N）計算定量限（LOQ）為0.03 mg/kg（見表2）。

表2 線性范圍、線性方程和相關系數(shù)Table 2 Linear ranges，linear regression equation and correlation coefficient

2.1.3 回收率與精密度 微中烘焙的鐵皮卡、卡蒂姆和卡杜拉樣品中進行低、中、高3 種質量分數(shù)（10，20，50 mg/kg）的5-HMF 加標回收試驗，每個添加水平做5 組平行試驗。5-HMF 的回收率為85.50%～105.5%，相對標準偏差（RSD）為4.28%～7.59%（見表3）。

表3 方法的回收率和精密度（n=5）Table 3 Recovery and precision of the method （n=5）

2.2 小粒咖啡烘焙時間和溫度曲線

咖啡生豆本身沒有香氣，咖啡豆經過烘焙加熱，酸類物質、生物堿類、多糖、脂肪和蛋白質等發(fā)生諸如焦糖反應、美拉德反應、降解等諸多物理化學以及生化變化，產生咖啡誘人香氣和風味[27]，咖啡烘焙加熱是一個同時具備傳熱和傳質的復雜過程。本試驗小?？Х仍谡麄€烘烤過程中，自動控溫和翻轉，以保證受熱均勻。將處于室溫的咖啡生豆倒入預熱后的烘焙機滾筒中，滾筒內的溫度會迅速且大幅下降，原先內部積聚的熱量被咖啡生豆吸收并使水分蒸發(fā)，隨咖啡豆表面水分的蒸發(fā)流失，咖啡豆表面溫度先是趨穩(wěn)，隨即迅速爬升，并在4 min 后達到約115 ℃，隨烘焙時間的延長，其烘焙溫度呈現(xiàn)升高趨勢。鐵皮卡、卡蒂姆和卡杜拉的烘焙時間-溫度曲線基本相同（圖3）。

圖3 咖啡的烘焙時間-溫度曲線Fig.3 Curve temperature-time of roasting coffee process

2.3 烘焙溫度對5-HMF 形成的影響

烘焙溫度對鐵皮卡、卡蒂姆和卡杜拉中5-HMF 形成的影響如圖4所示。

圖4 不同烘焙溫度對烘焙咖啡5-HMF 形成的影響Fig.4 Effects of different roasting temperature on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in roasted coffee

5-HMF 是美拉德反應和焦糖化反應過程中形成的中間產物，其產生受糖的種類、溫度、pH值、水分活度、加熱時間的影響[28]。圖4顯示，烘焙溫度對小?？Х戎?-HMF 的生成影響較大，溫度為180～240 ℃，隨烘焙溫度的升高，美拉德反應產物5-HMF 的生成量逐漸增多，240 ℃時達到峰值，鐵皮卡為 （28.50±0.15）mg/kg、卡蒂姆為（25.34±0.22）mg/kg、卡杜拉為（16.65±0.19）mg/kg。烘焙溫度大于240 ℃，5-HMF 含量隨溫度的升高而顯著下降，260 ℃烘焙10 min 后，5-HMF 含量小于0.05 mg/kg。意味著5-HMF 可通過更高溫度的烘焙而減少，小粒咖啡烘焙過程中，溫度對5-HMF 的影響較大，240 ℃以上高溫能促進烘焙中形成的5-HMF 快速消解。

2.4 烘焙時間對5-HMF 形成的影響

圖5顯示，烘焙溫度為230 ℃，烘焙時間在12 min 內，小?？Х鹊?-HMF 隨烘焙時間延長，其含量逐漸增加，烘焙時間為12 min，鐵皮卡含量為（27.03±0.27）mg/kg、卡蒂姆（25.10±0.13）mg/kg、卡杜拉（22.99±0.25）mg/kg；烘焙時間大于12.0 min，5-HMF 含量隨烘焙時間的延長而顯著下降；烘焙時間達到20.0 min，鐵皮卡5-HMF 含量（0.315±0.12）mg/kg、卡蒂姆（0.363±0.21）mg/kg、卡杜拉（0.321±0.12）mg/kg，該結果與Kocada?li 等[13]結論一致。說明咖啡烘焙過程中，前期（12 min）加熱能促進5-HMF 的生成，烘焙時間大于12 min，烘焙咖啡的5-HMF 明顯降低直至消失，230 ℃烘焙20 min 后，其5-HMF 含量低于0.06 mg/kg，可能的原因是5-HMF 降解為有機酸[29]。

圖5 不同烘焙時間對烘焙咖啡5-HMF 形成的影響Fig.5 Effects of different roasting time on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in roasted coffee

2.5 烘焙方式對5-HMF 形成的影響

烘焙程度對鐵皮卡、卡蒂姆和卡杜拉中5-HMF 形成的影響見表4。

小?？Х仍诤姹杭訜徇^程中，水分隨溫度升高而蒸發(fā)?？Х榷顾纸档?，體積膨脹，同時發(fā)生諸多化學物理變化。隨烘焙時間的延長，除水分蒸發(fā)，還有其它成分散失，使咖啡豆的質量減少[30]。表4結果顯示，隨烘焙程度增加，5-HMF 含量呈快速降低趨勢，不同烘焙程度咖啡豆中5-HMF 含量差異顯著（P＜0.05）。淺烘焙（230 ℃，12 min）和肉桂烘焙（235 ℃，12 min）的烘焙咖啡中，5-HMF含量分別為鐵皮卡（30.53±0.45）mg/kg 和（36.76±0.33）mg/kg，卡蒂姆（25.71±0.32）mg/kg 和（18.28±0.41）mg/kg，卡杜拉（17.99±0.48）mg/kg 和（15.25±0.37）mg/kg；烘焙程度達到意式烘焙 （250 ℃，23 min），5-HMF 含量降到最低，鐵皮卡（0.21±0.03）mg/kg，卡蒂姆（0.12±0.04）mg/kg，卡杜拉（0.15±0.03）mg/kg，5-HMF 降解率分別為99.31%，99.53%和99.17%。不同烘焙程度的小?？Х?-HMF 含量由大到小為淺烘焙＞肉桂烘焙＞微中烘焙＞濃度烘焙＞城市烘焙＞深城市烘焙＞法式烘焙＞意式烘焙。

表4 不同烘焙程度的烘焙咖啡5-HMF 含量（mg/kg）Table 4 Content of 5-hydroxymethylfurfural of roasted coffee in different roasting degree （mg/kg）

烘焙方式看：淺烘焙和肉桂烘焙屬于輕度烘焙，烘焙溫度和時間均未超過5-HMF 的降解要求，輕度烘焙可使咖啡中累積較高含量的5-HMF；其余烘焙方式在溫度和時間上均達到使5-HMF 降解的要求，促進5-HMF 含量顯著降低。不同咖啡烘焙方式的5-HMF 含量研究結果與溫度和時間結果一致，因此，為控制或者消除咖啡中內源污染物5-HMF 的含量，在保證風味的前體下，可通過調控烘焙的溫度和時間減少烘焙咖啡中5-HMF 的含量。

3 結論

采用QuEChERS 凈化方法，以乙酸-乙腈溶液為提取劑，氯化鈉和乙酸鈉為鹽析劑，C18粉、PSA 和無水硫酸鎂為凈化劑，可實現(xiàn)咖啡中5-HMF 的提取、鹽析和凈化。QuEChERS 凈化方法最佳試驗條件：提取溶劑為1%乙酸-乙腈溶液，鹽析劑為3.0 g NaCl+1.0 g NaAc，凈化劑為50 mg C18+20 mg PSA+200 mg MgSO4，5-HMF 的回收率≥85.5%。5-HMF 在0.5～50.0 mg/L 范圍內有良好的線性關系，相關系數(shù)（r）為0.9991，檢出限為0.01 mg/kg，定量限為0.03 mg/kg，在10，20，50 mg/kg 添加水平的回收率為85.50%～105.5%，相對標準偏差為4.28%～7.59%（n=5）。

烘焙溫度180～240 ℃，隨烘焙溫度升高，5-HMF 生成量逐漸增加，到240 ℃時達到峰值，烘焙溫度大于240 ℃，急劇下降；烘焙溫度為230 ℃，烘焙時間為6～12 min，5-HMF 生成量隨烘焙時間延長而增加，烘焙時間為12.0 min，5-HMF 生成量達到最大值，烘焙時間大于12 min，5-HMF 含量顯著降低；烘焙程度增加，5-HMF 含量顯著降低。小?？Х鹊?-HMF 隨烘焙溫度、烘焙時間和烘焙程度的改變，是一個逐漸產生、達到峰值和急劇下降的動態(tài)變化過程，通過調整烘焙溫度、時間來控制咖啡中5-HMF 的形成。