不同方法提取的橄欖果渣纖維素的性質(zhì)表征

郭 艷，王 悅，張 依，孟煥娜，李志西，馮憲超

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院 陜西楊凌 712100）

橄欖屬于木犀科木犀欖屬，主要分布在地中海沿岸國家，集中產(chǎn)地為意大利、西班牙、希臘。在中國，其被大量種植在甘肅、廣東、廣西、云南、四川等地區(qū)[1]。隴南是我國主要的橄欖生長地區(qū)，橄欖油產(chǎn)量和產(chǎn)值均居全國第一位[2]。橄欖果渣是橄欖榨油后剩余的殘渣，含有十分豐富的纖維素、半纖維素、果膠等成分，是優(yōu)良的膳食纖維來源，據(jù)報道，每噸橄欖果榨油后約產(chǎn)生0.2 t 的橄欖渣，而橄欖渣的傳統(tǒng)利用方法是將其作為飼料、肥料甚至直接丟棄，這些利用方法不僅造成資源的浪費，還引起許多環(huán)境問題[3-4]。

纖維素是一類由葡萄糖苷通過糖苷鍵連接而成的多糖類物質(zhì)的總稱，是生物質(zhì)的重要組成成分，不溶于水及大多數(shù)有機溶劑。在食物中廣泛存在于水果、蔬菜及谷物等植物基食品中。由于人體內(nèi)缺乏相應的纖維素酶，因此不能被人體消化吸收而隨糞便排出體外。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)纖維素是人體健康不可或缺的一類營養(yǎng)素，具有促進腸道蠕動，降血糖，降血脂，預防高血壓以及心血管疾病等生理功能，對人體健康起到積極作用[5]。

目前，提取農(nóng)業(yè)廢渣中纖維素的方法主要有酸法、堿法、酶法及機械處理法，堿法提取纖維素已廣泛運用于馬鈴薯渣、果渣、豆渣、茶渣等原料中[6-7]。然而，目前有關堿法提取橄欖渣纖維素及結構表征的方法鮮有報道。本研究以橄欖果渣為原料，用堿液浸提法提取橄欖果渣中的纖維素。在此基礎上，利用硫酸和鹽酸將此纖維素水解成微晶纖維素，通過電子掃描顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀、X 射線衍射儀、差示掃描量熱儀分析原始纖維素與微晶纖維素的結構，并對比兩類纖維素的持水力、持油力及膨脹力等理化性質(zhì)，為進一步研究橄欖果渣纖維素的性能與應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

橄欖渣（橄欖果榨油之后剩余的殘渣），甘肅武都油橄欖廠。尼羅紅、熒光增白劑，美國Sigma公司。溴化鉀、氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸等均為國產(chǎn)分析純級。

FW100 高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；T-203 電子天平，美國丹佛；202-00 干燥箱，北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；TD5A 臺式離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；HCJ-6D 磁力攪拌水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；Vetex70 傅里葉變換紅外光譜儀、Model D8 X-射線衍射儀，德國布魯克公司；Q2000 差示掃描量熱儀，美國TA 公司；A1R 激光共聚焦掃描顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 初始纖維素的制備 將橄欖果渣置于80℃干燥箱中干燥8 h，使含水量不高于5%，去除果核，粉碎后過40～60 目篩，將所得橄欖渣粉末和質(zhì)量分數(shù)8%的氫氧化鈉溶液按1∶15 混合，于80 ℃水浴鍋中水解80 min，隨后用6 mol/L 鹽酸中和。將上述所得混合物用高速離心機4 000 r/min 離心15 min，沉淀用大量蒸餾水洗滌，再離心，重復以上步驟3 次，棄上清，所得沉淀即為初始纖維素。將其置于50 ℃干燥箱中，干燥至恒重，使含水量不高于5%。保存在干燥器中備用。

1.2.2 微晶纖維素的制備 取上述初始纖維素分別 與2 mol/L H2SO4、2 mol/L HCl 按料液比1∶10混合，在45 ℃磁力攪拌水浴鍋中水解45 min[8]，轉速為200 r/min，隨后加入大量蒸餾水以停止反應，用質(zhì)量分數(shù)8%的一定量氫氧化鈉溶液中和，隨后過濾所得濾渣分別為H2SO4-MCC、HCl-MCC。將其置于50 ℃干燥箱中，干燥至恒重，使含水量不高于5%。保存在干燥器中備用。

1.3 纖維素相關性質(zhì)表征

1.3.1 持水性測定 準確稱取1.00 g 纖維素于50 mL 離心管中，加入25 mL 蒸餾水，充分振蕩1 h，繼而3 000 r/min 離心10 min，隨后棄去上層清液并用濾紙將壁上殘留的水滴吸干，然后稱取質(zhì)量。按式（1）計算持水力（WRHC）[9]。

式中，m2——吸水后樣品的質(zhì)量（g）；m1——吸水前樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.2 持油性測定 準確稱取1.00 g 纖維素于50 mL 離心管中，加入20 g 玉米油，室溫下靜置1 h。3 000 r/min 離心20 min，棄去上層清液并用濾紙將壁上殘留的油滴吸干，然后稱其質(zhì)量。按式（2）計算持油力（WOHC）[9]。

式中，m2——吸油后樣品的質(zhì)量（g）；m1——吸油前樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.3 膨脹力測定 準確稱取1.00 g 纖維素于20 mL 刻度試管中，輕微振蕩，使表面保持平整，讀取纖維素干品體積記為V1，然后準確移取10 mL 蒸餾水加入試管，振蕩均勻后放置24 h，讀取纖維素吸水之后的體積記為V2。按式（3）計算膨脹力（WSC）[10]。

式中，V2——吸水后的體積（mL）；V1——吸水前的體積（mL）；m——樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.4 結晶度測定 將纖維素樣品研磨至細粉末狀，干燥至恒重，在室溫下于X-射線衍射儀上進行譜圖測定，在40 kV、40 mA，以及衍射角2θ=10°～40°條件下測定，掃描速度為0.02°/min。晶粒尺寸根據(jù)Scherrer 公式[11]計算，見式（4）。

式中，L002——水解纖維素002 面晶粒尺寸（nm）；k——Scherrer 常數(shù)，取0.94；γ——X 射線的波長，為0.154 nm；β——衍射峰半高寬（rad）；θ——衍射角（°）。

1.3.5 DSC 測定 稱取5 mg 左右的纖維素置于DSC 鋁盒中，以空的密封鋁盒作為對照，氮氣作為保護氣，測定模式為Standard 模式，待測樣品以10 ℃/min 的速率從20 ℃升至500 ℃[12]。

1.3.6 微觀結構 采用電子掃描顯微鏡觀察不同纖維素的微觀結構，觀察時采用高真空模式，工作電壓為10 kV。將纖維素樣品干燥，然后噴金，粘臺后觀察。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜 準確稱取1 mg 纖維素粉末于瑪瑙研缽中充分研磨，再加入100 mg干燥至恒重的溴化鉀粉末，繼續(xù)研磨至樣品與溴化鉀粉末混合均勻后，稱取30 mg 混合物壓片，薄片置于傅里葉變換紅外光譜儀上進行譜圖測定。測定范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.8 乳化性測定 乳液的配制根據(jù)Hu 等[13]的方法稍作修改。將纖維素配成0.2%的懸浮液，然后10 000 r/min 勻漿2 min，按與玉米油質(zhì)量比為4∶1 的比例加入一定量的玉米油進行混合，10 000 r/min 勻漿2 min。油滴和纖維素分別用尼羅紅和熒光增白劑進行染色，用蓋玻片覆蓋載有乳液的載玻片，利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察乳液的乳化結果。

2 結果與分析

2.1 持水力、持油力和膨脹力

3 種纖維素的持水力、持油力和膨脹力測定數(shù)據(jù)如表1所示，纖維素本身具有較高的持水性，這是因為纖維素中存在較多的羥基[14]，纖維素與水分子間的氫鍵作用決定了其較高的持水性，經(jīng)硫酸和鹽酸水解之后得到的微晶纖維素，持水力由原先的3.19（初始纖維素）升高到3.81（H2SO4-MCC）和3.24（HCl-MCC），酸水解過程破壞了纖維素的原有結構，導致更多的親水基團暴露，增加了親水基團的比表面積，因此持水性增強。3 種纖維素的持油力均低于持水力，且總體較低，這是因為所提取的纖維素是水不溶性的，而申輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)水溶性纖維具有較好的吸附有機物的特性，水不溶性纖維的吸油性相對較差。申瑞玲等[16]報道稱高纖維素含量的食品可以降低對油脂的吸附，而木質(zhì)素和半纖維素含量較高時持油性較強，這與本文酸水解之后微晶纖維素的持油性較低的結果相符。膨脹力的變化趨勢與持水力一致，膨脹力代表纖維素的生理功能，即可以使人體腸道增容，使人產(chǎn)生飽腹感，可以有效預防肥胖癥。硫酸水解得到的微晶纖維素的膨脹力最大，鹽酸水解次之。且水解之后的微晶纖維素的膨脹力均高于初始纖維素，表明酸水解之后纖維素的生理活性有所提高。

表1 不同纖維素的持水力、持油力及膨脹力Table 1 The water/oil holding capacity and swelling force of different cellulose samples

2.2 結晶度分析

不同的纖維素變體有纖維素Ⅰ、纖維素Ⅱ、纖維素Ⅲ、纖維素Ⅳ和纖維素X[17]，圖1為初始纖維素和微晶纖維素的XRD 圖譜，H2SO4-MCC 與HCl-MCC 的衍射圖譜基本一致，表明材料結晶具有相同性。觀察幾種纖維素的X 衍射圖譜，可以看出，所有纖維素在2θ 約為22°左右有一個尖銳的峰，在2θ 約為14°和16°左右有2 個較為弱一點的峰，分別代表纖維素結晶區(qū)和無定形區(qū)的衍射強度，這是典型的纖維素Ⅰ型結構[18-20]。經(jīng)酸水解前、后的纖維素，雖然特征譜線幾乎一致，但結晶度有較大差異。通過Jade 軟件計算出纖維素的結晶 度 分 別 為37.53% （ 初 始 纖 維 素）、75.77%（H2SO4-MCC） 和 64.92% （HCl-MCC）。依 據(jù)Scherrer 公式計算纖維素的晶粒尺寸分別為2.57 nm（初始纖維素）、5.35 nm（H2SO4-MCC）和4.96 nm（HCl-MCC）。與結晶區(qū)相比，無定形區(qū)纖維素分子鏈的排列是松散無序的。酸水解過程H+可以進入纖維素的無定形區(qū)，加速葡萄糖間糖苷鍵的斷裂[21]。隨著酸水解過程的進行，纖維素無定形區(qū)被水解，結晶區(qū)所占的比例升高，因此結晶度增大。這一結果與之前的報道[22]類似，即初始纖維素經(jīng)過酸水解之后晶粒數(shù)量增多，尺寸增大，結構更加規(guī)整。晶粒尺寸增大也表明無定形區(qū)減少，結晶區(qū)比例增大，晶型更加完整。

圖1 不同纖維素的X 射線衍射圖譜Fig.1 XRD patterns of different cellulose samples

2.3 DSC 結果分析

圖2所示為不同纖維素的DSC 曲線，由圖2可知3 種纖維素在100 ℃和360 ℃左右有2 個明顯的峰，100 ℃左右的峰代表水的蒸發(fā)損失，此溫度越高，焓值越大，表明水的蒸發(fā)越困難，證明其持水性越好。水的蒸發(fā)溫度從108.89 ℃（初始纖維素） 升高至112.57 ℃（H2SO4-MCC） 和109.9 ℃（HCl-MCC），這是由于酸水解之后纖維素表面暴露出更多的羥基，更容易保持水分，這與纖維素的持水性測定結果相一致。360 ℃左右的峰是由于隨著溫度的升高，在高溫作用下分子鏈發(fā)生斷裂，纖維素開始降解所形成，其溫度受結晶度、結晶尺寸[23-24]的影響較大，此處的起點溫度越高，熱穩(wěn)定性越好[25]。H2SO4-MCC 和HCl-MCC 的熱降解溫度稍低于初始纖維素，這可能是由于通過鹽酸和硫酸水解作用導致粒徑和聚合度減小，纖維素比表面積增大，暴露在外面的活性基團增多，因此熱穩(wěn)定性降低。

圖2 不同纖維素的DSC 掃描圖譜Fig.2 DSC results of different cellulose samples

2.4 微觀結構分析

SEM 圖可用來分析纖維素的形態(tài)學特征和結構特征，如圖3所示，初始纖維素的微觀結構呈扁平且相互交疊狀分布（圖3a），由于半纖維素和木質(zhì)素的存在使其分布雜亂又無序，且表面不平整。經(jīng)酸水解后初始纖維素降解斷裂，以短棒狀的纖維片段為主，長度變短，直徑幾乎保持不變，表面更加光滑整齊（圖3b，3c），可見纖維素的水解反應主要是結構疏松的無定形部分發(fā)生降解，纖維橫向斷裂，剩余部分表面更加光滑，結構更加緊湊[26]，跟上述X 衍射結果一致。

圖3 纖維素掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope images of cellulose samples

2.5 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析

纖維素的FTIR 圖譜如圖4所示，3 條曲線峰在一定程度上都展示了其獨特的特征結構。其中890 cm-1與1 165 cm-1處為β-1，4-糖苷鍵的特征吸收峰。3 650～3 000 cm-1處的吸收峰是由纖維素分子中-OH 的伸縮振動所引起，酸水解后，由于氫鍵的形成，波數(shù)向低波數(shù)移動[27]，表明酸水解有利于形成氫鍵。2 900 cm-1處的吸收峰是C-H 基團的彎曲振動所引起，1 640 cm-1是吸收水的峰[28]，1 430 cm-1處的吸收峰對應著-CH2-的伸縮振動[29]；1 736 cm-1代表的是羰基伸縮區(qū)中的一些附加帶，是半纖維素中羧基和乙?；蠧-O 的伸縮振動，然而酸水解之后此處的峰變小甚至消失不見，表明酸水解之后部分半纖維素水解。

圖4 不同纖維素樣品的FTIR 圖譜Fig.4 FTIR spectrum of different cellulose samples

2.6 乳化性分析

用尼羅紅和熒光增白劑1∶1 混合液對新鮮乳液進行染色，觀察油滴的分布情況，這種纖維素固體顆?？梢晕皆谟?水界面穩(wěn)定乳液的機制稱為皮克林機制，由固體顆粒穩(wěn)定的乳液稱為皮克林乳液[30]，纖維素因具有高度有序的結晶結構，并且具有很強的分子內(nèi)和分子間氫鍵，導致其難溶于水[31]，因此限制了纖維素的乳液穩(wěn)定作用。Kalashnikova 等[32]研究指出，酸水解纖維素是一個異構過程，得到含有大量纖維素納米顆粒的渾濁懸浮液。顆粒在界面的不可逆吸附是液滴穩(wěn)定的主要原因。圖5紅色區(qū)域代表油滴，藍色區(qū)域代表纖維素基質(zhì)，由圖5可知，酸水解之后的微晶纖維素（圖5b，5c）與初始纖維素（圖5a）相比，油滴分布比較均勻且油滴較小，說明乳液穩(wěn)定性較好[33]。對比H2SO4-MCC 與HCl-MCC 的乳化特性，發(fā)現(xiàn)H2SO4-MCC 形成的乳液更加穩(wěn)定，形成這種情況的可能原因是SO42+的引入增加了纖維素的不可逆吸附作用[34]。

圖5 纖維素乳液的CLSM 圖片F(xiàn)ig.5 CLSM images of cellulose emulsions

3 結論

本研究以橄欖果渣為原料，經(jīng)干燥、粉碎、堿液浸提過程提取出橄欖果渣中的纖維素。在此基礎上，進一步采用低濃度的硫酸和鹽酸溶液將上述纖維素水解為微晶纖維素。酸水解后微晶纖維素的持水力和膨脹力增加，持油力低于持水力，且總體較低。X 衍射圖譜表明初始纖維素與微晶纖維素均屬于纖維素Ⅰ型，且微晶纖維素結晶度和晶粒尺寸較大，分別為75.77%，5.35 nm （H2SO4-MCC）以及64.92%，4.96 nm（HCl-MCC）。DSC 掃描結果顯示微晶纖維素降解溫度低于初始纖維素，這是由于微晶纖維素樣品聚合度小，比表面積增加，暴露在外的活性基團較多，導致其熱穩(wěn)定性降低。FTIR 圖譜證明酸水解使纖維素中部分半纖維素水解。SEM 圖片顯示酸水解之后纖維橫向斷裂，以短棒狀的纖維片段為主，直徑幾乎不變。