母乳嬰兒源植物乳桿菌BF_15體外抗氧化活性及緩解DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸氧化損傷的研究

張 娜，趙麗娜，李 晨，5，牛志華，康紅艷，田洪濤，5*，羅云波

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000 2 保定學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院 河北保定 071000 3 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定 071000 4 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定 071000 5 河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心 河北保定 071000 6 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

人體抗氧化防御系統(tǒng)是保護人體免受自由基和活性氧氧化損傷，預(yù)防慢性疾病發(fā)生和延緩機體衰老進程提前啟動的重要屏障[1]。氧化應(yīng)激是指生物機體內(nèi)源性和外源性活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS） 的水平超出機體自身抗氧化系統(tǒng)的平衡能力，從而導(dǎo)致過量的ROS 攻擊細胞組分，修飾細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA，并引發(fā)一系列的病變反應(yīng)，腸道是最易受到自由基攻擊而受到氧化損傷的部位，尤其是炎癥性腸病與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[2-4]。

2017年發(fā)表在《The Lancet》的一篇世界范圍內(nèi)炎癥性腸病發(fā)病率和患病率的回顧性研究報告顯示：歐美的發(fā)病率已到達平臺期，而非西方國家正處于新病例增長的第1 階段[5]。據(jù)2014年中國疾病預(yù)防控制中心的數(shù)據(jù)顯示，中國2005—2014年間炎癥性腸病 （Inflammatory bowel disease，IBD）總病例約為35 萬；據(jù)估計，到2025年，中國的IBD 患者將達到150 萬人[6]。同時國內(nèi)與國外的研究發(fā)現(xiàn)：低年齡組發(fā)病率也較高，其中年齡最小為2 個月，且預(yù)后相對較差，而在成人患者中，有15%～25%可追溯到兒童期起病，該類患者發(fā)生癌變率較成年時起病者更高，因此對人體，尤其是在嬰幼兒期由氧化應(yīng)激引發(fā)的炎癥性腸病要更為重視[7]。目前治療手段仍局限于免疫抑制劑等藥物及外科介入治療，而藥物的副作用層出不窮，外科手術(shù)帶來的身心傷害及經(jīng)濟壓力更是很多患者難以承受之重[8]。尋找一種安全、高效、經(jīng)濟的潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）治療方法成為當(dāng)今的迫切任務(wù)。

乳桿菌作為腸道常駐菌群，可以直接在機體氧化損傷的重點部位——腸道發(fā)揮抗氧化作用，維持腸道處于氧化-還原平衡狀態(tài)，并且乳酸菌在腸道定植后還能不斷增殖，源源不斷地在腸道扮演ROS 清道夫的角色，其抗氧化作用與傳統(tǒng)的抗氧化劑相比有無法比擬的優(yōu)勢[2]。據(jù)報道，乳桿菌耐受H2O2能力與預(yù)防結(jié)腸炎活性，降低腸腔ROS，抑制黏膜通透性升高具有顯著相關(guān)性[9]。通過基因工程手段過量表達超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）可在三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠表現(xiàn)抗炎癥活性[10]。乳桿菌的作用顯著改善了UC 小鼠結(jié)腸所有抗氧化酶活力，降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物的含量，進而促進潰瘍性結(jié)腸炎的愈合[11]?？傊闂U菌可通過多種途徑在腸道發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

嬰兒時期是機體腸道菌群建立的關(guān)鍵時期，母乳是母嬰之間進行腸道菌群有效“垂直傳遞”的主要介質(zhì)，最初的腸道組分可顯著緩解腸道氧化應(yīng)激，并對機體健康產(chǎn)生長期影響[12]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是合成生物學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)（宏基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等）技術(shù)的相繼問世，益生乳酸菌促進人體健康的生理功能被逐步揭示，然而，目前有關(guān)嬰兒源益生乳酸菌對機體氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)作用的研究尚缺少系統(tǒng)性的報道，應(yīng)用于人體抗氧化調(diào)節(jié)作用的嬰兒源益生乳酸菌菌株也尚不多見[13]。研究發(fā)現(xiàn)：植物乳桿菌既是健康嬰兒腸道定植的優(yōu)勢乳桿菌[14]，也是成年人和老年人腸道中定植的優(yōu)勢菌群[15]，因此開展母乳嬰兒源益生菌，尤其是植物乳桿菌緩解氧化應(yīng)激的研究，勢在必行。

作者前期從母乳嬰兒源糞便中分離鑒定獲得1 株植物乳桿菌BF_15，研究證實：該菌株具有較強的抗逆性（耐人工胃腸液），較高的黏附性與腸道定植力及免疫調(diào)節(jié)活力。本文研究植物乳桿菌BF_15 的體外抗氧化活性、安全性與緩解DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸氧化損傷的癥狀，從抗氧化的角度了解植物乳桿菌BF_15 預(yù)防、改善動物潰瘍性結(jié)腸炎的功能性，以期為來自人體母乳嬰兒源益生菌的開發(fā)應(yīng)用及其早期干預(yù)緩解潰瘍性結(jié)腸炎等腸道疾病提供科學(xué)依據(jù)，也為氧化應(yīng)激作為治療潰瘍性結(jié)腸炎等腸道疾病的新靶點提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 試驗菌株：植物乳桿菌BF_15（Lactobacillus plantarum BF_15），自行分離鑒定自母乳源嬰兒糞便；對照菌株：鼠李糖乳桿菌LGG ATCC 53103 （Lactobacillus rhamnosus GG ATCC 53103），被公認的典型益生菌株，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌ATCC 25922 （Escherichia coli ATCC 25922） 與金黃色葡萄球菌ATCC 25923（Staphylococcus aureus ATCC 25923），購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。上述菌株均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院發(fā)酵工程實驗室保存。

1.1.2 試劑 1，1-二苯基苦基苯肼自由基（DPPH），上海麥克林；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒，索萊寶；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒，南京建成；30%H2O2、FeSO4·7H2O、FeCl3、鄰苯三酚、Tris、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）均為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3 實驗動物 C57BL/6J 雄性小鼠，體重（20±2）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，用于評價母乳嬰兒源益生菌：植物乳桿菌BF_15 緩解DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸氧化損傷的實驗動物。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備 DL-CJ-1N 型超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TU-1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；5417R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf。

1.2 方法

1.2.1 植物乳桿菌BF_15 菌株體外抗氧化能力分析

1.2.1.1 BF_15 菌株對H2O2抵抗能力測定 采用Li 等[16]報道的分光光度法，稍作改進：試驗菌株BF_15 培養(yǎng)至穩(wěn)定期，以體積分?jǐn)?shù)1%接入含有終濃 度 為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mmol/L H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基中，以接入不含H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基為陰性對照組。每隔1 h 測定培養(yǎng)液OD600nm的吸光值，表示菌株在不同H2O2濃度下的生長情況，以LGG 為陽性對照菌株。

1.2.1.2 BF_15 菌株不同組分（發(fā)酵上清和菌懸液）的制備 將供試菌株按體積分?jǐn)?shù)為1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，收集發(fā)酵上清液于4 ℃保藏備用；將菌體用PBS 緩沖液（pH 7.4）洗滌2次后重懸，調(diào)整菌體濃度為1×109CFU/mL（OD600nm≈1.5）備用。

1.2.1.3 BF_15 菌株清除·OH 能力檢測 采用Gutteridge[17]報道的水楊酸法，稍作修改：將1.0 mL 5 mmol/L 的FeSO4和1.0 mL 3 mmol/L 的H2O2與樣品混合反應(yīng)10 min 后，加入1.0 mL 5 mmol/L 的水楊酸溶液，然后加入蒸餾水至10 mL。將混合物在室溫下靜置反應(yīng)30 min 后，6 000 r/min 離心10 min，在波長510 nm 處測得吸光值。對照組為等體積蒸餾水代替樣品溶液。清除率按公式（1）計算：

1.2.1.4 BF_15 菌株清除DPPH 自由基能力測定

采用Shimada 等[18]報道方法，稍作修改：取1.0 mL 樣品加入到1.0 mL 0.2 mmol/L 乙醇DPPH 自由基溶液中，將反應(yīng)溶液搖勻后，置于室溫下遮光反應(yīng)30 min，6 000 r/min 離心10 min 后，取上清液在波長517 nm 處測量溶液的吸光度。對照組為等體積的蒸餾水代替樣品溶液?？瞻捉M包括等量的乙醇代替DPPH 自由基溶液。清除率按公式（2）計算：

1.2.1.5 BF_15 菌株清除·O2-自由基能力檢測 采用He 等[19]報道的鄰苯三酚自氧化法，稍作修改：將3 mL Tris-HCl 緩沖液與0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚混合，25 ℃反應(yīng)20 min，加入1 mL 樣品，25 ℃反應(yīng)4 min，加2 滴濃鹽酸終止反應(yīng)。對照組用蒸餾水代替樣品。對照組參比為0.4 mL 10 mmol/L 稀鹽酸代替樣品，樣品組參比為0.4 mL 10 mmol/L 稀鹽酸代替樣品，測OD420nm吸光值。清除率按公式（3）計算：

1.2.1.6 BF_15 菌株抗脂質(zhì)過氧化能力測定 采用Kullisaar 等[20]的方法，稍作改進：磁力攪拌10 min 等體積的PBS（pH 7.4）與蛋黃混合液，再加入同樣pH 值的PBS，使其成為PBS∶混合液=1∶25（體積比） 的蛋黃懸液。取1 mL 蛋黃懸液，1 mL PBS，1 mL FeSO4（25 mmol/L）和0.5 mL 菌懸液溶液混勻，37 ℃振蕩30 min 后加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸（TCA），靜置10 min 后，3 500 r/min 離心10 min，取3 mL 上清液與2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的硫代巴比妥酸（TBA）混勻，沸水浴中反應(yīng)10 min，冷卻后測其在532 nm 波長處的吸光值。

1.2.2 植物乳桿菌BF_15 菌株體外安全性評價

1.2.2.1 BF_15 菌株有害代謝產(chǎn)物分析 取-20℃保存的菌株于MRS 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)16 h后，挑取單菌落于MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h（37℃），以獲得活化待用的菌液。

①BF_15 菌株硝基還原酶檢測 將活化好的供試菌株按體積分?jǐn)?shù)為3%接菌量分別接入至硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)5 d 后，先滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%KI 溶液10 滴，再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%淀粉溶液10 滴，觀察試驗結(jié)果，同時做空白試驗[21]。滴加溶液和淀粉溶液后，培養(yǎng)基溶液變?yōu)樗{色是陽性（+）結(jié)果，不變色是陰性（-）結(jié)果。

②BF_15 菌株氨基脫羧酶活性測定 將活化的供試菌株接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的每一種前體氨基酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的5-磷酸吡哆醛，誘導(dǎo)菌體的脫羧酶活性。如此活化6 次后，將菌株按體積分?jǐn)?shù)10%分別接種于含酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸的Bover-Cid&Holzapfel 改進的培養(yǎng)基[22]中，并在表面加入1 mL 滅菌石蠟油密封，于37 ℃溫箱培養(yǎng)3～4 d，觀察顯色反應(yīng)。若有淡藍色或紫色的顏色特征，則表示菌株形成相應(yīng)氨基酸的生物胺。

③BF_15 菌株吲哚試驗 采用張丹青[23]的方法，將活化好的供試菌株及質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC 25922 按體積分?jǐn)?shù)為3%接種量接入至靛基質(zhì)反應(yīng)檢測培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。然后向培養(yǎng)液中加入少量乙醚，振蕩混勻以提取和濃縮靛基質(zhì)，待乙醚層浮于培養(yǎng)液表面后，緩慢加入Kovacs 氏試劑8～10 滴。觀察并拍照記錄，出現(xiàn)紅色圓環(huán)則為靛基質(zhì)反應(yīng)陽性。

1.2.2.2 BF_15 菌株溶血活性檢測 將活化好的供試菌株以及質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC 25923 用滅菌的接菌環(huán)劃線接種于哥倫比亞血瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)觀察菌落周圍有無溶血圈出現(xiàn)并拍照記錄[23]。

1.2.3 植物乳桿菌BF_15 菌株緩解DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸氧化損傷能力分析

1.2.3.1 動物的分組飼養(yǎng)與造模 7 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，飼喂基礎(chǔ)飼料，適應(yīng)環(huán)境一周，然后參照2003 版保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[24]，對實驗動物的數(shù)量要求為10～15 只，按照表1進行動物實驗分組（每組10 只）并灌胃，持續(xù)3周，對除正常組以外的組別進行潰瘍性結(jié)腸炎造模：采用質(zhì)量濃度為0.8 g/mL DSS 溶液，劑量為0.1 mL/10 g 進行灌胃，持續(xù)7 d，整個期間小鼠自由飲食飲水，12 h 光照，12 h 黑暗。

表1 小鼠實驗組別Table 1 Mice experimental group

1.2.3.2 BF_15 菌株干預(yù)下氧化損傷動物模型結(jié)腸組織病理切片及HE 染色觀察 取不同處理組小鼠，將小鼠頸椎脫白處死后，剪取結(jié)腸近端約1 cm 組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物，然后將結(jié)腸組織浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛過夜，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 切片，HE 染色后于200 x光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜炎癥情況，包括黏膜的完整性、黏膜內(nèi)炎癥細胞的浸潤、隱窩結(jié)構(gòu)的改變程度和炎癥范圍。其余結(jié)腸組織及結(jié)腸內(nèi)容物于-80 ℃保存，備用。

1.2.3.3 BF_15 菌株干預(yù)下氧化損傷動物模型結(jié)腸組織T-SOD 及MDA 的檢測 取不同處理組小鼠結(jié)腸勻漿液，測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力及丙二醛（MDA）含量，按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書操作。

1.2.4 統(tǒng)計分析方法 試驗數(shù)據(jù)（n=3）采用SPSS 17.0 軟件，首先進行方差分析即F 檢驗 （或t 檢驗）處理間差異顯著性（F=MSA/MSe），然后在方差分析處理間差異顯著性基礎(chǔ)上，用最小極差法即鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌BF_15 菌株體外抗氧化能力分析

2.1.1 BF_15 菌株對H2O2的抵抗能力檢測 根據(jù)1.2.1.1 節(jié)的試驗方法，檢測BF_15 菌株對H2O2的耐受能力，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨H2O2濃度增加，試驗菌株BF_15 和對照菌株LGG 細胞生長的延遲期均明顯延長，說明H2O2對2 株益生菌的細胞生長均產(chǎn)生抑制作用。對于BF_15 菌株，當(dāng)H2O2濃度達到4.0 mmol/L 時，細胞生長完全受到抑制而停止生長；而對于LGG 菌株，在H2O2濃度為2.0 mmol/L時，細胞生長已完全受到抑制而停止生長。由此表明：BF_15 和LGG 兩菌株均具有較強抵御H2O2氧化損傷的能力，相對于LGG 菌株，BF_15 菌株抵抗H2O2氧化損傷能力更強；然而當(dāng)H2O2濃度達到一定高度時，在一定程度上對BF_15 和LGG 兩菌株造成細胞的氧化損傷進而導(dǎo)致菌株生長受到抑制。

圖1 試驗菌株BF_15（a）與對照菌株LGG（b）對H2O2 的耐受能力Fig.1 Tolerance of test strain BF_15 （a） and control strain LGG （b） to H2O2

2.1.2 BF_15 菌株其它體外抗氧化 （清除·OH、DPPH、·O2-自由基、抗脂質(zhì)過氧化）能力測定 根據(jù)1.2.1.2～1.2.1.6 節(jié)的試驗方法，進行BF_15 菌株體外抗氧化——清除自由基（·OH、DPPH和·O2-）、抗脂質(zhì)過氧化能力測定，結(jié)果見表2。

表2 試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 不同組分綜合抗氧化能力分析Table 2 Analysis of comprehensive antioxidant ability of different components of test strain BF_15 and control strain LGG

對同一抗氧化指標(biāo)、同一組分下，不同菌株之間的抗氧化能力比較，結(jié)果表明，發(fā)酵上清液中，試驗菌株BF_15 對DPPH 的清除能力顯著低于對照菌株LGG（P＜0.01）；對·OH 清除能力顯著高于LGG（P＜0.05）；對·O2-清除能力高于LGG，而差異不顯著 （P＞0.05）；抗脂質(zhì)過氧化能力顯著低于LGG （P＜0.01）。菌懸液中，試驗菌株BF_15 對DPPH 的清除能力高于對照菌株LGG，而差異不顯著（P＞0.05）；對·OH 清除能力顯著高于LGG（P＜0.01）；對·O2-清除能力高于LGG，而差異不顯著（P＞0.05）；抗脂質(zhì)過氧化能力顯著低于LGG（P＜0.01）。綜合以上數(shù)據(jù)間的比較結(jié)果可知，無論以·OH 清除率作為優(yōu)先考察指標(biāo)還是綜合評價，試驗菌株BF_15 的抗氧化能力均優(yōu)于對照菌株LGG。

對同一抗氧化指標(biāo)、同一菌株下，不同組分之間的抗氧化能力比較，結(jié)果表明，試驗菌株BF_15中發(fā)酵上清液對DPPH 和·O2-清除能力顯著高于菌懸液（P＜0.01）；對·OH 清除能力高于菌懸液，而差異不顯著（P＞0.05）；對抗脂質(zhì)過氧化能力顯著低于菌懸液（P＜0.01）。對照菌株LGG 中發(fā)酵上清液對DPPH 和·O2-清除能力顯著高于菌懸液 （P＜0.01）；對·OH 清除能力顯著低于菌懸液（P＜0.01）；對抗脂質(zhì)過氧化能力顯著低于菌懸液（P＜0.05）。綜合以上數(shù)據(jù)間的比較結(jié)果可知，無論以·OH 清除率作為優(yōu)先考察指標(biāo)還是綜合評價，試驗菌株BF_15 和對照菌株LGG 發(fā)酵上清液的抗氧化能力均優(yōu)于菌懸液。

2.2 植物乳桿菌BF_15 菌株體外安全性評價

2.2.1 BF_15 菌株有害代謝產(chǎn)物（生物胺、亞硝酸鹽、吲哚） 分析 根據(jù)1.2.2.1 節(jié)①～③的試驗方法，進行BF_15 菌株有害代謝產(chǎn)物（生物胺、亞硝酸鹽、吲哚）檢測分析，結(jié)果見表3和圖2。

表3和圖2顯示試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 的氨基脫羧酶活性和硝基還原酶活性檢測結(jié)果均為陰性（-）；吲哚試驗的靛基質(zhì)反應(yīng)檢測中，質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922 培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色圓環(huán)，反應(yīng)呈陽性（+），而試驗菌株BF_15與對照菌株LGG 培養(yǎng)液均未出現(xiàn)紅色圓環(huán)，反應(yīng)均呈陰性（-）。表明：試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 在代謝過程中均不產(chǎn)生生物胺、亞硝酸鹽、吲哚等有害代謝產(chǎn)物。

表3 試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 氨基脫羧酶和硝基還原酶活性檢測Table 3 Detection of amino decarboxylase and nitroreductase activity of test strain BF_15 and control strain LGG

圖2 試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 及質(zhì)控菌株大腸桿菌的靛基質(zhì)反應(yīng)檢測Fig.2 Indigo substrate reaction detection of test strain BF_15 with control strain LGG and quality control strain E.coli

2.2.2 BF_15 菌株溶血活性檢測 根據(jù)1.2.2.2節(jié)試驗方法，檢測BF_15 菌株溶血活性，結(jié)果見圖3。

圖3 試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 及質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25923 的溶血活性檢測Fig.3 Detection of hemolytic activity of test strain BF_15 with control strain LGG and quality control strain E.coli ATCC 25923

由圖3可知，質(zhì)控菌株金黃葡萄球菌ATCC 25923 菌落周圍出現(xiàn)溶血圈，表現(xiàn)為溶血陽性（+），而試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 的菌落周圍沒有溶血圈，均為溶血陰性（-）。結(jié)果表明：試驗菌株BF_15 與對照菌株LGG 均無溶血活性。

2.3 植物乳桿菌BF_15 菌株對DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸氧化損傷的影響

2.3.1 BF_15 菌株干預(yù)下小鼠結(jié)腸氧化損傷模型組織病理切片及HE 染色觀察分析 根據(jù)1.2.3.1和1.2.3.2 節(jié)的實驗方法，對BF_15 菌株干預(yù)下小鼠結(jié)腸氧化損傷模型組與其它對照組小鼠的結(jié)腸組織進行病理切片及HE 染色觀察，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，正常對照組小鼠的結(jié)腸黏膜上皮組織完整且結(jié)構(gòu)清晰，上皮細胞排列緊密整齊，隱窩腺體明顯完整，杯狀細胞豐富，無炎性細胞浸潤，無潰瘍發(fā)生；DSS 模型組小鼠的結(jié)腸黏膜組織遭到破壞，上皮細胞排列紊亂，隱窩結(jié)構(gòu)局部消失或變形，杯狀細胞丟失，大量炎性細胞浸潤，呈典型炎癥病變，潰瘍形成，造模成功。與模型組相比，試驗菌株BF_15 和對照菌株LGG 干預(yù)組，結(jié)腸粘膜上皮組織比較完整，上皮細胞排列較為整齊，隱窩腺體比較完整，杯狀細胞較為豐富，少量炎性細胞浸潤，未出現(xiàn)大面積潰瘍。結(jié)果表明：2 株益生菌（即試驗菌株BF_15 和對照菌株LGG）的早期干預(yù)對DSS 誘發(fā)的小鼠結(jié)腸氧化損傷均具有一定的預(yù)防緩解和保護作用。

圖4 不同處理組小鼠結(jié)腸組織HE 染色（H&E×200）Fig.4 Colon tissue HE staining of mice in different treatment groups （H & E×200）

2.3.2 BF_15 菌株干預(yù)下小鼠結(jié)腸氧化損傷模型組織T-SOD 和MDA 檢測 根據(jù)1.2.3.3 節(jié)實驗方法，對BF_15 菌株干預(yù)下小鼠結(jié)腸氧化損傷模型組與其它對照組小鼠的結(jié)腸組織進行T-SOD活力及MDA 含量測定，結(jié)果見表4。

由表4可知，相對于正常對照組，DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型組結(jié)腸組織中T-SOD 活性顯著降低（P<0.01），MDA 含量顯著升高（P<0.01）。2 株益生菌干預(yù)組（即試驗菌株BF_15 干預(yù)組和對照菌株LGG 干預(yù)組）的DSS 誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中T-SOD 活性均顯著高于模型組 （P<0.01）、MDA 含量均顯著低于模型組（P<0.01）；試驗菌株BF_15 干預(yù)組與對照菌株LGG 干預(yù)組相比，無論是T-SOD 活性指標(biāo)，還是MDA 含量指標(biāo)，差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，益生菌的早期灌胃干預(yù)即試驗菌株BF_15 早期灌胃干預(yù)或?qū)φ站闘GG 早期灌胃干預(yù)，均可明顯緩解DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸的氧化損傷。

3 討論

前期從純母乳喂養(yǎng)嬰兒的新鮮糞便中篩選出一株能夠在腸道定植并且具有通過調(diào)節(jié)腸道菌群增強機體免疫調(diào)節(jié)能力的益生菌：植物乳桿菌BF_15，進一步開展該菌株的體外抗氧化活性、安全性與緩解腸道氧化損傷的研究。結(jié)果表明，BF_15 具有較強的體外抗氧化能力：能夠耐受高濃度的H2O2（3.5 mmol/L），并且菌株及其代謝產(chǎn)物均可以有效清除環(huán)境中DPPH、·O2-、·OH 等氧自由基；進一步以DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸氧化損傷為動物模型，發(fā)現(xiàn)：通過早期灌胃小鼠，菌株BF_15可顯著減輕小鼠腸黏膜損傷及炎癥細胞浸潤的程度，提高了T-SOD 活性，降低了MDA 含量，進而有效緩解了DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸氧化損傷的癥狀。體內(nèi)外實驗結(jié)果綜合表明：菌株BF_15 具有較強的體外抗氧化和體內(nèi)緩解腸道氧化應(yīng)激益生功能，且水平與對照菌株LGG 相當(dāng)。

由于缺乏過氧化氫酶（CAT）活性，乳桿菌通常對H2O2具有較差的抗性，研究表明：具有潛在抗氧化能力的乳酸菌，對H2O2均具有一定的耐受能力：Kullsiaar 等[25]發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）E-3 和E-8 在濃度為1 mmol/L 的H2O2中存活的時間分別為180 min 和150 min，而無抗氧化活性的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）E-338-1-1 的存活時間僅為90 min；Tang 等[26]篩選出一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MA2 能夠耐受濃度2.0 mmol/L 的H2O2，高于目前的相關(guān)報道。本研究中的植物乳桿菌BF_15 菌株可耐受H2O2的濃度高達3.5 mmol/L，明顯高于MA2 與本試驗對照菌株LGG （對照菌株LGG 可耐受H2O2的濃度僅為1.5 mmol/L）。結(jié)果表明：植物乳桿菌BF_15 菌株具有較強的體外抗氧化應(yīng)激潛力。

活性氧自由基（ROS）中·OH 是腸腔內(nèi)容物攻擊性最強的自由基，在細胞代謝過程具有很強的化學(xué)活性，可以與任何生物分子以極快的反應(yīng)速率反應(yīng)，是對生物體危害最大的ROS[27]。本研究表明：無論以·OH 清除率作為優(yōu)先考察指標(biāo)還是綜合評價，植物乳桿菌BF_15 菌株的抗氧化能力均高于本試驗對照菌株LGG。Su 等[28]從嬰兒糞便中分離的高抗氧化菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）4B15 和格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）4M13 的菌懸液對DPPH 的清除能力為37.0%，低于本研究的試驗菌株（母乳嬰兒源植物乳桿菌BF_15 對DPPH 的清除能力為38.56%）；馬爽等[29]同樣以LGG 為對照菌株，從新生兒腸道中篩選出一株高抗氧化菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MGSHC4302，對·OH 和DPPH清除率均低于對照菌株LGG；本研究中的試驗菌株BF_15 各項抗氧化指標(biāo)（清除·OH、DPPH、·O2-自由基和抗脂質(zhì)過氧化能力）均高于LGG。由此表明，母乳嬰兒源植物乳桿菌BF_15 具有作為高抗氧化菌株的潛力。體外抗氧化活性只是對乳酸菌緩解氧化應(yīng)激能力的初步評價和參考指標(biāo)，乳酸菌是否具有緩解氧化應(yīng)激能力，尚需通過體內(nèi)氧化應(yīng)激干預(yù)試驗驗證。

食源性乳酸菌可能代謝產(chǎn)生一些有害酶，如脫羧酶、硝基還原酶、偶氮還原酶等，其代謝產(chǎn)物對人類的健康帶來很大的安全隱患[30]；具有潛在溶血活性的菌株侵入機體后可能引起局部或全身性的感染[22]。因此，產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物能力及溶血活性的分析是安全性評價必不可少的部分。本團隊之前進行了BF_15 菌株的藥敏性試驗與質(zhì)粒檢測，結(jié)果表明：BF_15 具備固有耐藥性，還對苯唑西林、頭孢噻吩具有耐藥性，然而不存在抗性質(zhì)粒，即不存在耐藥因子傳遞的危險。本試驗BF_15菌株的靛基質(zhì)試驗、硝酸鹽還原酶試驗、氨基脫羧酶試驗均為陰性，且無溶血現(xiàn)象發(fā)生。綜合以上結(jié)果可判定BF_15 菌株屬于安全菌株。尚有待下一步進行體內(nèi)遺傳毒性實驗、傳統(tǒng)致畸試驗、相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)檢驗和人體試驗驗證。

體內(nèi)實驗評估益生菌緩解結(jié)腸氧化損傷的功能，首先通過結(jié)腸組織切片觀察結(jié)腸組織的炎癥變化情況（腸道黏膜完整性、通透性等），能夠直觀判斷腸黏膜的損傷程度；其次，丙二醛（MDA）作為氧化應(yīng)激過程中的脂質(zhì)過氧化物，可引起組織細胞損傷，其含量常用來評估氧化應(yīng)激的程度；超氧化物歧化酶（SOD）是機體清除氧自由基的重要酶類，能夠清除氧自由基，從而抑制腸組織中的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其活力間接反映了機體清除氧自由基的能力[31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：試驗菌株BF_15 可以明顯縮小結(jié)腸潰瘍范圍，減少中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤、減輕杯狀細胞缺失和隱窩結(jié)構(gòu)破壞；顯著提高結(jié)腸組織中T-SOD 的酶活力，抑制MDA 的過量生產(chǎn)，并且作用效果與對照菌株LGG 相當(dāng)。首先，基于LGG 改善炎癥性腸作用的相關(guān)研究結(jié)果，本研究選用LGG 作為對照菌株[32-33]，確保菌株BF_15 緩解UC 能力評價的可信度；其次，根據(jù)陳宏輝[34]對不同益生菌作用炎癥性腸病的結(jié)果 （雙歧桿菌加重了UC 的結(jié)腸粘膜氧化損傷，乳桿菌減輕了UC 的結(jié)腸粘膜氧化損傷），相對于Wang 等[35]篩選出的通過提高機體抗氧化酶活性達到緩解小鼠結(jié)腸炎癥嬰兒源的雙歧桿菌，從應(yīng)用于炎癥性腸病病人的安全性角度考慮，本研究的植物乳桿菌BF_15 除了具有緩解UC的功能外，安全性更高；最后，鑒于人源益生菌與人體腸道菌群之間存在著特異性相互選擇的關(guān)系[36]，本研究篩選的植物乳桿菌BF_15 對緩解我國炎癥性腸病病人更具有真正的應(yīng)用價值。

綜上所述，本研究探明：來自母乳嬰兒源植物乳桿菌BF_15 菌株具有較強的抗H2O2活力以及其它體外抗氧化活性；不產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，不具有溶血性，具備一定的安全性；通過早期灌胃小鼠，BF_15 菌株能夠有效緩解DSS 誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸氧化損傷的癥狀。然而，BF_15 菌株抗氧化特別是體內(nèi)抗氧化的作用機制，還有待進一步深入研究。在理論研究方面，本研究為來自人體母乳嬰兒源益生菌的開發(fā)應(yīng)用及其早期干預(yù)緩解炎癥性腸病提供了科學(xué)依據(jù)，為氧化應(yīng)激作為治療UC 等腸道疾病的新靶點提供了借鑒指導(dǎo)；在產(chǎn)業(yè)實踐方面，有助于新型功能性乳酸菌的開發(fā)，進而促進乳酸菌產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展。