4種甜橙皮黃酮類化合物體外抗氧化活性及降糖降脂功能研究

姚 旭，酈 萍，顧 青

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室 杭州 310018）

甜橙【Citrus sinensis （L.） Osbeck】是重要的蕓香科柑橘屬植物。我國是甜橙主產(chǎn)國和消費大國，而果皮作為甜橙鮮食、加工過程中的主要副產(chǎn)物，除小部分用作開發(fā)畜禽飼料、生產(chǎn)有機肥和制取香精油以外，大部分被填埋處理，若處理不當(dāng)則易腐敗變質(zhì)，污染環(huán)境。據(jù)報道，柑橘皮[1]、石榴皮[2]、番薯皮[3]等果蔬加工副產(chǎn)物富含果膠、多糖、多酚、黃酮等多種生物活性物質(zhì)，是天然抗氧劑的來源，特別是其中的黃酮類化合物，在疾病治療[4-5]和膳食健康[5-6]等方面具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，柑橘皮黃酮類化合物與抗氧化能力[7]及緩解炎癥反應(yīng)的能力[8]密切相關(guān)，Barreca等[9]指出柑橘皮中黃烷酮類化合物可提高機體的氧化應(yīng)激能力，降低心血管疾病、動脈粥樣硬化的發(fā)病率，對機體健康發(fā)揮有益作用。目前，有報道稱柑橘黃酮類化合物具有降糖潛力，可通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和與胰島素敏感性相關(guān)的信號通路來緩解2 型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥對機體造成的損害，或有望開發(fā)為防治2 型糖尿病的藥物[10]。膽酸在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著必不可少的作用，膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化為膽酸，隨膽汁進(jìn)入腸腔參與脂肪消化，在回腸重吸收經(jīng)門靜脈返還肝臟再被利用，即膽酸的“腸肝循環(huán)”[11-12]。若膽汁酸在腸道被其它物質(zhì)結(jié)合，則膽汁酸無法完成腸肝循環(huán)，肝臟就會將更多的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。有研究表明，紅樹莓籽黃酮具有良好的體外膽酸鹽結(jié)合能力[13]，然而甜橙皮黃酮類化合物體外結(jié)合膽酸鹽能力的研究鮮有報道，有必要通過體外膽酸鹽結(jié)合試驗初步評價甜橙皮黃酮的降血脂能力。

本文分析4 種甜橙皮中11 種黃酮類化合物的含量，通過體外試驗初步評價甜橙皮黃酮類化合物的抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶結(jié)合能力及膽酸鹽吸附能力，為實現(xiàn)甜橙加工副產(chǎn)物的高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜橙原料：血橙，產(chǎn)地四川資中；倫晚臍橙，產(chǎn)地湖北秭歸；埃及橙，產(chǎn)地埃及；新奇士晚橙，產(chǎn)地美國。

主要試劑：黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品、α-葡萄糖苷酶（來源于釀酒酵母）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、阿卡波糖，上海葉源生物科技有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基 （DPPH）、奎諾二甲基丙烯酸（Trolox）、2，9-二甲基-1，10-鄰菲洛啉（Neocuproine）、二水合氯化銅、乙酸銨、膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘膽酸鈉、胃蛋白酶（生物技術(shù)級）、胰蛋白酶（生物技術(shù)級），上海麥克林生化科技有限公司；ABTS 試劑盒、FRAP 試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Mili-QRBiocelTM超純水儀，美國Millipore 公司；700Y 搖擺式粉碎機，武義海納電器有限公司；GZX-9240MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Spectra Max 190 酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Alpha 1-4 LSC 真空冷凍干燥機，德國Martin Christ 公司；JY 92-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；R-300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI 公司；e2695 高效液相色譜儀，美國Waters 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理 4 種新鮮甜橙皮40 ℃烘干48 h，粉碎機粉碎過40 目篩，冷凍干燥，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 甜橙皮總黃酮樣品的制備 稱取4 種甜橙皮凍干粉各10.00 g，乙醇體積分?jǐn)?shù)52%，液料比42 mL/g，超聲功率325 W 條件下超聲提取17 min，收集提取液減壓濃縮至50 mL，加入乙醇溶液使提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)高于80%，4 ℃層析柜靜置12 h，棄沉淀，取上清，初步除雜。將上清減壓濃縮至無醇味，XAD-16 大孔樹脂純化，50%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到甜橙皮黃酮粉末，用于組分含量分析及抗氧化、降糖降脂功能評價。

1.3.3 HPLC 法測定甜橙皮中11 種黃酮類化合物 11 種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取枸橘苷2.8 mg，圣草次苷、柚皮素各4.0 mg，去甲基川陳皮素4.4 mg，川陳皮素4.8 mg，香蜂草苷、甜橙黃酮、柚皮苷、桔皮素各5.0 mg，橙皮素6.0 mg，充分溶解于5 mL 甲醇-水（1∶1，V/V）溶液，梯度稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm 針頭式過濾器過濾至液相小瓶中待用。參考張元梅[14]的方法并適當(dāng)修改，建立HPLC 分析甜橙皮黃酮組分含量的方法：流動相A：0.1%乙酸-水溶液，流動相B：100%乙腈，梯度洗脫程序見表1，Sun FireTMC18 柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長283 nm（黃烷酮）和330 nm（多甲氧基黃酮），重復(fù)進(jìn)樣3 次，分別以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制11種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

甜橙皮11 種黃酮類化合物的組分含量測定：稱取4 種甜橙皮黃酮粉末各0.1 g，充分溶解于2 mL 甲醇-水（1∶1，V/V）溶液，0.22 μm 針頭式過濾器過濾至液相小瓶中待用。按照1.3.3 節(jié)中建立的方法測定甜橙皮中11 種黃酮類化合物組分含量。

1.3.4 甜橙皮黃酮抗氧化活性測定 DPPH 法：參照Liu 等[15]的方法稍加修改，取80 μL 樣品液（5 mg/mL）與1 mL DPPH（0.2 mmol/L）渦旋振蕩混勻，室溫（25 ℃）避光反應(yīng)30 min，取200 μL加入96 孔板于517 nm 波長處測定OD 值。

ABTS 法：參考試劑盒提供的試驗方法，在96孔板中加入混合的ABTS 工作液180 μL，再加入10 μL 樣品液（5 mg/mL），室溫反應(yīng)6 min，于405 nm 波長處測定OD 值。

FRAP 法：參考試劑盒提供的試驗方法，在96孔板上依次加入FRAP 工作液180 μL、樣品液（5 mg/mL）5 μL，37 ℃恒溫水浴5 min 于593 nm 波長處測定OD 值。

CUPRAC 法：參照Frond 等[16]的測定方法，稍加改動，依次取500 μL CuCl2·2H2O （0.01 mol/L）、500 μL Neocuproine 溶液 （0.075 mol/L）、500 μL 乙酸銨緩沖液 （1 mol/L） 和60 μL 樣品液（5 mg/mL）加入試管，渦旋振蕩混勻，室溫暗處反應(yīng)1 h，取200 μL 加入96 孔板于450 nm 波長處測OD 值。

以上4 種方法抗氧化能力均以Trolox 當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）表示，重復(fù)試驗3 次。

1.3.5 甜橙皮黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制能力參考Padilla-Camberos 等[17]和譚青云等[18]的方法，取50 μL 樣品液（10 mg/mL）與250 μL α-葡萄糖苷酶（2 U，溶于0.1 mol/L PB，pH 6.8）混勻，37℃水浴10 min，加入250 μL pNPG（5 mmol/L），37 ℃水浴10 min，加入450 μL Na2CO3溶液（0.2 mmol/L） 終止反應(yīng)。取200 μL 加入96 孔板于405 nm 波長處測定OD 值，以阿卡波糖（6.25 μmol/L）為陽性對照，按公式（1）計算α-葡萄糖苷酶抑制率，重復(fù)試驗3 次。

式中，OD樣品——樣品＋α-葡萄糖苷酶＋pNPG＋Na2CO3反應(yīng)后的OD 值；OD背景——樣品＋α-葡萄糖苷酶＋PB 緩沖液＋Na2CO3反應(yīng)后的OD值；OD阿卡波糖——阿卡波糖＋α-葡萄糖苷酶＋pNPG＋Na2CO3反應(yīng)后的OD 值。

1.3.6 甜橙皮黃酮膽酸鹽結(jié)合能力 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘膽酸鈉母液（1 mmol/L）用0.1 mol/L PB 緩沖液（pH 6.3）稀釋成不同梯度，分別取上述不同梯度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL 于10 mL 具塞試管中，加入7.5 mL 60%H2SO4，70 ℃水浴25 min，隨后置于冰上冷卻，取200 μL 加入96 孔板，于387 nm 波長處測定OD 值。以各膽酸鹽的物質(zhì)的量濃度為橫坐標(biāo)，測得OD 值為縱坐標(biāo)，繪制3 種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。

膽酸鹽結(jié)合能力測定：參照文獻(xiàn)[19]～[20]中的方法略加修改，依次將1 mL 樣品液（10 mg/mL）、1 mL 胃蛋白酶 （10 mg/mL） 加入10 mL 具塞試管，37 ℃恒溫?fù)u床120 r/min 振蕩1 h 模擬胃部消化。NaOH（0.1 mol/L）調(diào)pH 值至6.3，加入4 mL 胰蛋白酶（10 mg/mL），振蕩1 h 模擬腸道消化。向每個具塞試管中分別加入4 mL 的3 種膽酸鹽（1 mmol/L），37 ℃振蕩1 h，4000 r/min 離心20 min，取上清，按1.3.6 節(jié)繪制膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測定膽酸鹽含量，重復(fù)試驗3 次，按公式（2）計算膽酸鹽結(jié)合能力。

式中，C1——原始膽酸鹽物質(zhì)的量濃度；C2——殘留的膽酸鹽物質(zhì)的量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，ANOVA單因素方差分析及Tukey's 多重檢驗，使用Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Excel 和GraphPad Prism 8.0.1 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 11 種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 分析結(jié)果

11 種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 色譜圖如圖1所示，圖1a 峰1～7 為283 nm 波長下7 種黃烷酮類化合物，圖1b 峰8～11 為330 nm 波長下4種多甲氧基黃酮類化合物。11 種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在45 min 內(nèi)可以較好的分離，峰形良好，滿足有效檢測黃酮類化合物的條件，可以用來定性。

圖1 11 種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of 11 flavonoid compounds

表2列出了11 種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及保留時間，各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2在0.9992～1.000 范圍內(nèi)，符合外標(biāo)法定量，保留時間定性的要求。

表2 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and correlation coefficient of standard curve of flavonoids

2.2 甜橙皮黃酮組分含量差異結(jié)果分析

4 種甜橙皮樣品黃酮類化合物組分含量結(jié)果見表3。4 種甜橙皮中含量最多的是橙皮苷，枸橘柑在供試樣品中均未檢測到，與錢井[21]在不同橙類果皮中未檢測到枸橘苷的結(jié)果相一致，或可推測橙類果皮中枸橘苷的含量較少。11 種黃酮類化合物含量總和從高到低依次為新奇士晚橙＞埃及橙＞血橙＞倫晚臍橙，總體來看，7 種黃烷酮類化合物的含量總和高于4 種多甲氧基黃酮類化合物的總和。

表3 甜橙皮中黃酮類化合物組分含量（mg/g DW）Table 3 Content of flavonoids in sweet orange peels （mg/g DW）

2.3 甜橙皮黃酮抗氧化能力比較

4 種甜橙皮黃酮類化合物抗氧化活性試驗結(jié)果見表4。新奇士晚橙果皮黃酮對DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力和CUPRAC 銅離子還原能力最強；血橙果皮黃酮的FRAP 鐵離子還原能力最好，新奇士晚橙次之，二者之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。根據(jù)Seeram 等[22]方法計算綜合APC 指數(shù)（Antioxidant potency composite index）并對其排序，結(jié)果見表4。綜合APC 指數(shù)變幅為86.20%～99.47%，4 種甜橙皮樣品的綜合抗氧化能力從強至弱依次為：新奇士晚橙＞埃及橙＞血橙＞倫晚臍橙，新奇士晚橙果皮黃酮基于4 種抗氧化評價方法表現(xiàn)出的抗氧化活性優(yōu)于其它3 種甜橙樣品。

表4 甜橙皮黃酮的抗氧化能力Table 4 The antioxidant capacity of flavonoids in sweet orange peels

2.4 甜橙皮黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制能力比較

黃酮類化合物作為α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過競爭抑制α-葡萄糖苷酶延緩碳水化合物的吸收[23]，也可提高胰島素敏感性[24]，從而有效降低餐后血糖。4 種甜橙皮黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，以阿卡波糖為陽性對照，供試樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制活性存在顯著差異 （P＜0.05），從高到低依次為新奇士晚橙（70.18%）＞埃及橙（63.12%）＞血橙（56.46%）＞倫晚臍橙（46.16%），甜橙皮黃酮具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，新奇士晚橙果皮黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果在4 種樣品中表現(xiàn)最為突出，或可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的重要來源。

圖2 甜橙皮黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.2 Inhibition effects of flavonoids in sweet orange peels on α-glucosidase

2.5 甜橙皮黃酮膽酸鹽結(jié)合能力結(jié)果比較

根據(jù)1.3.6 節(jié)的方法以膽酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD 值為縱坐標(biāo)，繪制膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，波長397 nm 處的OD 值與3 種膽鹽酸濃度有良好的線性關(guān)系，膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘膽酸鈉回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2分別為：y=6.2965x+0.0132，R2=0.9977；y=5.8662x+0.002，R2=0.9992；y=6.2075x+0.0117，R2=0.9975。

圖3 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of bile acid salts

4 種甜橙皮黃酮結(jié)合膽酸鹽能力的測定結(jié)果見表5。供試樣品對膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘膽酸鈉吸附量變幅分別為 （0.359±0.004）～（0.386±0.006） μmol/mg，（0.383±0.004）～（0.460±0.005）μmol/mg 和 （0.372±0.008）～（0.455±0.017） μmol/mg，總體來看，4 種甜橙皮樣品對后?；悄懰徕c、甘膽酸鈉的吸附能力的均值相對高于膽酸鈉吸附量，新奇士晚橙樣品對3 種膽酸鹽均表現(xiàn)出較好的體外結(jié)合效果，試驗結(jié)果表明4 種甜橙皮黃酮類化合物或可在膽酸鹽結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用。

表5 甜橙皮黃酮膽酸鹽結(jié)合量Table 5 Banding of bile salts of flavonoids in sweet orange peels

2.6 甜橙皮黃酮與體外抗氧化、降糖降脂能力相關(guān)性分析

11 種黃酮類化合物含量總和與抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制率和膽酸鹽結(jié)合能力Pearson相關(guān)性分析見表6。DPPH 自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、CUPRAC 銅離子還原能力、α-葡萄糖苷酶抑制率、膽酸鈉結(jié)合量和甘膽酸鈉結(jié)合量與11 種黃酮總含量之間存在極顯著線性正相關(guān)（P＜0.01）；FRAP 鐵離子還原能力與11 種黃酮總含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05）；牛磺膽酸鈉結(jié)合量與11 種黃酮總含量相關(guān)性不顯著（P＞0.05），試驗結(jié)果與陳浩南等[25]對高良姜水黃酮含量與自由基及α-葡萄糖苷酶抑制能力呈正相關(guān)的結(jié)果相一致。相關(guān)性分析結(jié)果表明甜橙皮中的11 種黃酮總含量與體外抗氧化、降糖降脂功能存在緊密聯(lián)系。

表6 甜橙皮黃酮與生物活性Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果Table 6 Pearson correlation analysis between flavonoids and biological activity

3 結(jié)論

果皮作為甜橙生產(chǎn)加工過程中的主要副產(chǎn)物，是回收利用黃酮類化合物的優(yōu)良原料。本研究利用HPLC 法測定4 種甜橙皮中包括7 種黃烷酮和4 種多甲氧基黃酮在內(nèi)的11 種黃酮類化合物，供試樣品中橙皮苷的含量最為豐富，4 種甜橙皮中11 種黃酮類化合物總含量從高到低依次為新奇士晚橙＞埃及橙＞血橙＞倫晚臍橙。體外抗氧化結(jié)果顯示甜橙皮黃酮的綜合APC 指數(shù)在86.20%～99.47%之間，新奇士晚橙綜合APC 指數(shù)排名居首位，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。以阿卡波糖為陽性對照，甜橙皮黃酮類化合物表現(xiàn)出抑制α-葡萄糖苷酶的能力，抑制率變幅為46.16%～70.18%。甜橙皮黃酮類化合物具有一定的體外結(jié)合膽酸鹽結(jié)合能力，對?；悄懰徕c和甘膽酸鈉結(jié)合量的均值要高于膽酸鈉結(jié)合量。相關(guān)性分析結(jié)果表明，除牛磺膽酸鈉與11 種黃酮類化合物總含量未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性（P＞0.05），其余幾項生物活性評價結(jié)果均與11 種黃酮類化合物總含量呈顯著性正相關(guān)（P＜0.05）。本試驗為甜橙皮黃酮類化合物開發(fā)出具有抗氧化及降糖降脂作用的功能性產(chǎn)品提供了研究基礎(chǔ)，同時為甜橙皮副產(chǎn)物變廢為寶以期實現(xiàn)高值化利用提供參考。