SIRT3多酚激活劑的抗細(xì)胞氧化應(yīng)激作用及機制

陳 慧，彭雨欣，徐瑩皓，趙 沖

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

多酚是植物性食物中廣泛存在的一種非營養(yǎng)成分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點主要分為酚酸、類黃酮、芪類、香豆素、單寧等，具有豐富的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、抗代謝性疾病、抗菌和光損傷保護作用等，在促進人體健康、美容護膚等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。日常膳食中多酚的主要來源包括水果、蔬菜、全谷物、香草、香料、咖啡豆和茶葉等[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)部分多酚類化合物可直接作用于Caco-2 或HaCaT細(xì)胞，促進SIRT3 的轉(zhuǎn)錄表達，上調(diào)抗氧化酶SOD2 的活性，從而增強細(xì)胞的抗氧化能力，緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[5-6]。近年來，臨床發(fā)現(xiàn)皮膚與腸道之間具有密切的關(guān)系。腸道吸收異常會引發(fā)皮膚病，如腸病性肢端皮炎、皮膚過敏、銀屑病等，而患有這些皮膚病的同時，腸道也會表現(xiàn)出腹脹、腹瀉、大便粘稠等癥狀[7-8]。多酚類化合物經(jīng)腸道吸收后，是否還能發(fā)揮保護作用需要進一步探究。

Caco-2 細(xì)胞來源于人結(jié)腸腺腫瘤，可在體外培養(yǎng)條件下自發(fā)分化形成連續(xù)單層的腸上皮樣細(xì)胞，與腸道上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和生理功能上具有相似性[9-10]。由于Caco-2 單層細(xì)胞模型簡便、高效的特點，國內(nèi)外通常將其作為體外模擬腸道吸收模型，應(yīng)用于大量口服藥物的篩選以及藥物的轉(zhuǎn)運吸收研究中[11-12]。近年來在食品領(lǐng)域，特別是膳食活性成分的功能研究領(lǐng)域也開始運用Caco-2單層細(xì)胞模型預(yù)測活性成分在體內(nèi)的吸收情況，如利用Caco-2 單層細(xì)胞模型檢測類胡蘿卜素類化合物的運輸效率，發(fā)現(xiàn)蝦青素的運輸效率最高[13]；利用Caco-2 細(xì)胞單層模型評價藍莓花色苷類化合物的吸收情況，可以得到花色苷在Caco-2 細(xì)胞單層的吸收規(guī)律，即羥基基團越多，-OCH3基團越少，其滲透性越差[14]。通過對膳食活性成分在Caco-2 單層細(xì)胞模型吸收、轉(zhuǎn)運情況的探究，篩選高效的目標(biāo)活性物質(zhì)。此外，將膳食活性成分處理Caco-2 單層細(xì)胞后與靶細(xì)胞共培養(yǎng)，則能直觀反映活性成分在腸道吸收后對靶器官或組織的影響。

前期研究表明，白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮4 種多酚均能促進HaCaT 細(xì)胞SIRT3基因的表達，是潛在的SIRT3 多酚激活劑，其中白藜蘆醇、安石榴苷、漆樹黃酮降低了UVB 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，安石榴苷對UVB 引起的細(xì)胞衰老具有修復(fù)作用[6]。這些多酚類化合物對HaCaT 細(xì)胞的保護作用極有可能與SIRT3 介導(dǎo)的抗氧化途徑有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本文進一步探究這4 種多酚類化合物以及月見草素B 在被腸道轉(zhuǎn)運后的保護作用及機制。通過建立Caco-2 與HaCaT細(xì)胞trans-well 共培養(yǎng)體系，體外模擬腸道轉(zhuǎn)運吸收，從以下兩個方面探究白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮以及月見草素B 這5 種多酚類化合物的保護作用：一是多酚對HaCaT 細(xì)胞SIRT3的間接激活作用，二是多酚對UVB 誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激的間接抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮和月見草素B 的來源見表1，化學(xué)結(jié)構(gòu)參照Ito 等[15]的研究結(jié)果。

表1 多酚類化合物Table 1 Polyphenols

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2）、人正常皮膚永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），日本理研生物資源中心（筑波，日本）；4 孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿、0.4 μm 高密度半透明PET 膜，美國Corning 公司；DMEM 培養(yǎng)基，日本Nissui 公司；0.25%胰蛋白酶消化液、胎牛血清，美國Life Technologies 公司；總RNA 提取試劑盒，日本Roche 公司；pEGFP-C3 熒光蛋白報告系統(tǒng)，日本Takara 公司；慢病毒表達質(zhì)粒pSUPER.retro.puro，美國OligoEngine 公司；HilyMax 轉(zhuǎn)染試劑，日本Dojindo 公司；聚凝胺，美國Merck Millipore 公司；Thunderbird SYBR qPCR Mix 熒光定量PCR 試劑盒，日本Tiyobo 公司；BESH2O2-Ac 過氧化氫熒光探針，日本W(wǎng)AKO 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；細(xì)胞電阻儀Millicell-ERS-2，美國Millipore 公司；Thermal Cycler Dice Real Time System TP-800 實時熒光定量PCR 儀，日本Takara 公司；IN Cell Analyzer 1000，英國GE Healthcare 公司；CL-1000 紫外交聯(lián)儀，美國UVP 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Caco-2 細(xì)胞的分化 Caco-2 細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取培養(yǎng)至3～6 代的處于對數(shù)生長期的Caco-2 細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)小室的PET 膜上（AP 側(cè)，Apical side），密度為2×105/mL，體積250 μL，在小室的下側(cè)（BL 側(cè)，Basolateral side）加入750 μL DMEM 完全培養(yǎng)基。每3 d 更換一次培養(yǎng)基，進行Caco-2 細(xì)胞的自發(fā)分化?？瞻讓φ战M中AP 側(cè)和BL 側(cè)中加入對應(yīng)等量的DMEM 完全培養(yǎng)基。

1.3.2 單層Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值（TEER）的測定 Caco-2 細(xì)胞自發(fā)分化后會形成連續(xù)的單層細(xì)胞。采用細(xì)胞電阻儀測定單層Caco-2 細(xì)胞的TEER 值。首先將電極放入預(yù)熱至37 ℃的Hank's平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution，HBSS）中平衡20 min。吸走AP 側(cè)和BL 側(cè)的培養(yǎng)基，在AP 側(cè)和BL 側(cè)分別加入500 μL 和1.5 mL 的HBSS 洗滌，重復(fù)2 次。吸走HBSS 后，在AP 側(cè)和BL側(cè)分別加入500 μL 和1.5 mL 的HBSS，檢測單層細(xì)胞兩側(cè)的跨膜電阻?？瞻讓φ战M也按照以上操作，獲得空白值。TEER 值（Ω·cm2）=（測定電阻值-空白值）/單層表面積。試驗重復(fù)3 次。通過測定Caco-2 細(xì)胞的TEER 值，可以判斷Caco-2 細(xì)胞是否形成緊密連續(xù)的單層細(xì)胞。

1.3.3 Caco-2 細(xì)胞與HaCaT 細(xì)胞trans-well 共培養(yǎng)體系的建立 HaCaT 細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞接種于24 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105，待細(xì)胞完全貼壁后，將接種有自發(fā)分化形成緊密連續(xù)的單層Caco-2 細(xì)胞的小室，置于接種有HaCaT 細(xì)胞的24 孔板上，即形成Caco-2 細(xì)胞與HaCaT 細(xì)胞trans-well 共培養(yǎng)體系，AP 側(cè)為Caco-2 細(xì)胞，BL側(cè)為HaCaT 細(xì)胞。在共培養(yǎng)體系的AP 側(cè)分別加入終濃度為10 μmol/L 的白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮、月見草素B，對照組中加入等量的DMSO。整個共培養(yǎng)體系在37 ℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于下一步試驗。

1.3.4 構(gòu)建HaCaT 細(xì)胞SIRT3-EGFP 報告基因系統(tǒng) HaCaT 細(xì)胞SIRT3-EGFP 報告基因系統(tǒng)的構(gòu)建參考Zhao 等[5]的方法。以人類基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增人類SIRT3 啟動子（-653--1），將其裝入無啟動子的pEGFP-C3 表達載體中，得到特定的pSIRT3p-EGFP 質(zhì)粒。將構(gòu)建的pSIRT3p-EGFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaCaT 細(xì)胞，用于評價受試物對SIRT3 啟動子活性的影響。利用IN Cell Analyzer 1000 監(jiān)測EGFP 熒光的變化，可定量測定SIRT3 啟動子的活性。SIRT3 激活劑篩選系統(tǒng)如文獻[6]中的圖1所示。試驗重復(fù)3 次。

1.3.5 HaCaT 細(xì)胞SIRT3 基因表達水平的測定 按照總RNA 提取試劑盒說明提取細(xì)胞RNA，參照Fujiki 等[16]的方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板，根據(jù)Thunderbird SYBR qPCR Mix試劑盒說明進行半定量實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Quantitative real-time PCR，qRT-PCR），測定細(xì)胞SIRT3 基因mRNA 表達水平。β-actin 為內(nèi)參基因。SIRT3 和β-actin 基因的PCR 引物序列見表2。試驗重復(fù)3 次。

1.3.6 評價SIRT3 多酚激活劑對UVB 誘導(dǎo)Ha-CaT 細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的清除作用 Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)14 d 后，自發(fā)分化形成緊密連續(xù)的單層細(xì)胞，可以用于下一步試驗。第15 天將需要評價的受試物加入含有Caco-2 細(xì)胞的AP 側(cè)，培養(yǎng)48 h 后收集BL 側(cè)的培養(yǎng)液，并于-80 ℃保存以備用。

將處于對數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞接種于10 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔的細(xì)胞數(shù)量為5×105。培養(yǎng)24 h 后，吸出培養(yǎng)基，加入少量磷酸緩沖鹽溶液（PBS）覆蓋細(xì)胞，利用紫外交聯(lián)儀對細(xì)胞進行紫外線處理，照射劑量為8 mJ/cm2。24 h 后，使用0.25%胰蛋白酶消化液消化HaCaT 細(xì)胞，將其重新接種于96 孔板，培養(yǎng)6 h 后，吸走培養(yǎng)基，加入之前回收的已解凍預(yù)熱的Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)體系中BL 側(cè)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h 后測定HaCaT 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。試驗重復(fù)3 次。

1.3.7 HaCaT 細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的測定 采用過氧化氫特異性熒光探針BES-H2O2-Ac 法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧分子 （Reactive oxygen species，ROS）的含量。吸出培養(yǎng)基，用4-羥乙基哌嗪乙磺酸【4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES，pH=7.4】緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，然后加入終濃度為5 μmol/L 的BES-H2O2-Ac 和Hoechst 33342 染料，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。消化并收集細(xì)胞，HEPES 潤洗2 次后用顯微細(xì)胞圖像分析測定系統(tǒng)IN Cell Analyzer 1000 進行檢測。

1.3.8 shSIRT3-HaCaT 細(xì)胞模型的構(gòu)建 shSIRT3-HaCaT 細(xì)胞模型按照先前建立的方法[17]構(gòu)建。設(shè)計靶向SIRT3 基因特異性短發(fā)夾RNA（shRNA）表達的引物序列 （表2） 并連接到慢病毒表達質(zhì)粒pSUPER.retro.puro 中，成功構(gòu)建慢病毒重組表達質(zhì)粒pSUPER-puro-shSIRT3。使用HilyMax 轉(zhuǎn)染試劑將pGag-pol，pVSV-G 質(zhì)粒以及構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pSUPER-puro-shSIRT3 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 之后，棄去舊培養(yǎng)基，用含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集病毒上清液，并添加10 mg/mL 聚凝胺，用于感染HaCaT 細(xì)胞。24 h 后，在HaCaT 細(xì)胞中添加3 μg/mL 嘌呤霉素，處理3 d，篩選得到pSUPER-puro-shSIRT3 穩(wěn)轉(zhuǎn)HaCaT 細(xì)胞系。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素ANOVA 方差分析，Turkey 法進行事后檢驗，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單層Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值的測定結(jié)果

Caco-2 細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下自發(fā)進行上皮樣分化，并且形成緊密連接的單層。TEER 值用于評價單層Caco-2 細(xì)胞是否形成了致密的緊密連接。本試驗分別測定了Caco-2 細(xì)胞在體外培養(yǎng)3 d 及14 d 時的TEER 值，結(jié)果如圖1所示。Caco-2 細(xì)胞在體外培養(yǎng)14 d 時，TEER 值顯著高于培養(yǎng)3 d 時細(xì)胞的TEER 值，且其遠遠大于500 Ω·cm2，表明單層Caco-2 細(xì)胞具有足夠的緊密連接和完整性[18-19]。因此，選擇在Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)14 d 時，建立Caco-2 和HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系。

圖1 培養(yǎng)時間對Caco-2 細(xì)胞跨膜電阻值的影響Fig.1 Effects of culture time on trans-epithelial resistance of Caco-2 cells

2.2 多酚類化合物對HaCaT 細(xì)胞SIRT3 表達的影響

構(gòu)建HaCaT 細(xì)胞SIRT3-EGFP 報告基因系統(tǒng)，在Caco-2 和HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系（圖2）中分別評價了白藜蘆醇（Resveratrol，RSV）、山奈酚（Kaempferol）、安石榴苷（Punicalagin）、漆樹黃酮（Fisetin）、月見草素B（Oenothein B）這5 種多酚類化合物在干預(yù)Caco-2 細(xì)胞后，對HaCaT 細(xì)胞SIRT3 表達的影響，結(jié)果如圖3、圖4所示。利用IN Cell Analyzer 1000 對細(xì)胞內(nèi)EGFP 熒光定量分析結(jié)果顯示，在多酚類化合物的干預(yù)下，HaCaT細(xì)胞內(nèi)EGFP 熒光強度相比于對照組 （DMSO）均顯著增強。利用qRT-PCR 技術(shù)進一步檢測HaCaT細(xì)胞內(nèi)源性SIRT3 基因mRNA 表達水平的結(jié)果顯示，白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 顯著上調(diào)了該基因的表達水平，而安石榴苷與漆樹黃酮沒有顯著影響。上述研究結(jié)果表明，白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 可以間接增強HaCaT 細(xì)胞SIRT3 基因的表達。

圖2 Caco-2 與HaCaT 細(xì)胞trans-well 共培養(yǎng)體系Fig.2 Trans-well co-culture system of Caco-2 and HaCaT cells

圖3 多酚類化合物對EGFP 熒光強度的影響Fig.3 Effects of polyphenols on EGFP fluorescence intensity

圖4 多酚類化合物對SIRT3 mRNA 表達水平的影響Fig.4 Effects of polyphenols on SIRT3 mRNA expression

2.3 SIRT3 多酚激活劑對UVB 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的清除作用

在共培養(yǎng)體系中，本文進一步評價了能夠激活SIRT3 表達的3 種多酚類化合物對UVB 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除作用。如圖5所示，在UVB 照射條件下，HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量顯著增加（P＜0.01），提示HaCaT 細(xì)胞在UVB 照射下發(fā)生了氧化應(yīng)激；白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 在Non-UVB 條件下對細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生沒有顯著影響；而在UVB 照射條件下，月見草素B 極顯著地降低了HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平；白藜蘆醇和山奈酚并未顯著清除UVB 誘導(dǎo)的過量ROS 的產(chǎn)生。綜上所述，在Caco-2 和HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系下，月見草素B 具有降低UVB 誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。

圖5 具有激活SIRT3 轉(zhuǎn)錄作用的多酚類化合物對Non-UVB 及UVB 照射下細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響Fig.5 Effects of polyphenols with SIRT3 activation activity on intracellular ROS levels induced by Non-UVB exposure and UVB exposure

2.4 SIRT3 介導(dǎo)月見草素B 調(diào)控HaCaT 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

為了進一步驗證月見草素B 清除HaCaT 細(xì)胞中UVB 誘導(dǎo)的ROS 是否依賴于SIRT3，本試驗按照1.3.8 節(jié)的方法建立了HaCaT 細(xì)胞SIRT3 基因沉默模型，并按照1.3.6 節(jié)的方法評價了月見草素B 對Mock-HaCaT 細(xì)胞以及shSIRT3-HaCaT細(xì)胞中UVB 誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 的清除作用。結(jié)果如圖6所示。在Mock-HaCaT 細(xì)胞中，月見草素B對UVB 誘導(dǎo)的ROS 具有顯著的清除作用，ROS水平比DMSO 處理組降低了14%；當(dāng)SIRT3 基因沉默后，月見草素B 不再有效地抑制ROS 的產(chǎn)生。由此可見，月見草素B 對細(xì)胞內(nèi)ROS 的清除作用具有SIRT3 依賴性。

圖6 月見草素B 對UVB 照射條件下的Mock 和SIRT3 基因沉默（shSIRT3）HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.6 Effects of oenothein B on intracellular ROS levels in UVB-irradiated Mock-and SIRT3-silenced （shSIRT3） HaCaT cells

3 討論

本文構(gòu)建了HaCaT 細(xì)胞SIRT3-EGFP 報告基因系統(tǒng)，在Caco-2 細(xì)胞及HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，評價了白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮、月見草素B 這5 種多酚類化合物在腸道吸收后對HaCaT 細(xì)胞SIRT3 表達的影響，以及對UVB誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，在Caco-2 與HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系下，月見草素B 降低了HaCaT 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，SIRT3介導(dǎo)了其對ROS 的調(diào)控。

在前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮均能夠在激活HaCaT 細(xì)胞中SIRT3的表達。為了進一步探究幾種多酚化合物在經(jīng)過腸道吸收后，對HaCaT 細(xì)胞的影響，構(gòu)建了Caco-2 與HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，白藜蘆醇、山奈酚、安石榴苷、漆樹黃酮以及月見草素B均能顯著增強HaCaT 細(xì)胞外源性SIRT3 的表達。內(nèi)源性SIRT3 mRNA 表達結(jié)果表明，安石榴苷在共培養(yǎng)體系下并不能激活HaCaT 細(xì)胞的SIRT3基因的轉(zhuǎn)錄表達。前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)安石榴苷作用于單獨培養(yǎng)的HaCaT 細(xì)胞時，它可以顯著激活HaCaT 細(xì)胞SIRT3 基因的表達[6]；當(dāng)它作用于單獨培養(yǎng)的Caco-2 細(xì)胞時，并沒有影響其SIRT3 基因的轉(zhuǎn)錄活性[5]。P-糖蛋白是一種跨膜轉(zhuǎn)運糖蛋白，主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜上，是主要的外排轉(zhuǎn)運蛋白，也是耐藥形成的重要因素[20-21]。多項研究報道安石榴苷是P-糖蛋白的底物，P-糖蛋白參與了安石榴苷的轉(zhuǎn)運過程[22-24]。由此推測，上述原因可能導(dǎo)致了Caco-2 細(xì)胞對安石榴苷的吸收率低下，進一步影響HaCaT 細(xì)胞中SIRT3 的表達。白藜蘆醇、山奈酚、漆樹黃酮作用于單獨培養(yǎng)的Caco-2 細(xì)胞與HaCaT 細(xì)胞均能顯著增強兩種細(xì)胞SIRT3 的表達[5-6]，然而在共培養(yǎng)體系下，白藜蘆醇和山奈酚表現(xiàn)出顯著的SIRT3 激活作用，漆樹黃酮并未激活SIRT3 的表達。漆樹黃酮與山奈酚均屬于黃酮醇類化合物，也是同分異構(gòu)體，二者的差別在于山奈酚的A 環(huán)C5 位上多了一個羥基，而漆樹黃酮的B環(huán)C5' 位上多了一個羥基。結(jié)構(gòu)差異可能導(dǎo)致其滲透性以及通過細(xì)胞單層所需要的共軛結(jié)合力的差異，從而導(dǎo)致漆樹黃酮的作用效果不顯著，而山奈酚卻具有良好的效果[25-26]。

綜合上述結(jié)果可知，本文共篩選得到3 種多酚（白藜蘆醇、山奈酚以及月見草素B），可增強共培養(yǎng)體系下HaCaT 細(xì)胞的SIRT3 基因表達。SIRT3 是去乙?；福⊿irtuin）家族中的一員，主要位于線粒體中，可以發(fā)揮去乙酰化活性，調(diào)節(jié)線粒體的功能、再生和動態(tài)，從而維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，以防止細(xì)胞代謝過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激[27-28]。在共培養(yǎng)體系中，通過UVB 誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，評價了白藜蘆醇、山奈酚、月見草素B 對活性氧的清除作用。試驗數(shù)據(jù)表明，月見草素B 顯著減少了細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。為了進一步驗證SIRT3 在月見草素B 改善UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激中的必要性，本文構(gòu)建了SIRT3 基因沉默的HaCaT 細(xì)胞，結(jié)果表明SIRT3 基因表達的沉默顯著抑制了月見草素B 對ROS 的清除能力。研究表明，桉葉水提物可顯著減少抑制f-MLP（Formylmet-leuphenylalanine）和PMA（4β-phorbol-12βmyristate-α13-acetate） 誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，而且很大程度上歸因于桉葉水提物中含有的月見草素B[29]。Chen 等[30]發(fā)現(xiàn)月見草素B可減少線蟲衰老過程中ROS 的累積，并延長其壽命，其主要的作用靶點包括insulin/IGF-1、飲食限制以及線粒體電子傳遞鏈等途徑上的關(guān)鍵基因。月見草素是一種潛在的高效抗氧化劑，并有助于延緩衰老。本研究發(fā)現(xiàn)月見草素B 對UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞活性氧也有很好的清除效果，并且為月見草素B 的抗氧化機制提供了新的思路。

綜上所述，本文首次發(fā)現(xiàn)了月見草素B 在Caco-2 與HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，增強HaCaT細(xì)胞SIRT3 基因的表達，并抑制UVB 引起的Ha-CaT 細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，其抗氧化作用具有SIRT3 依賴性。月見草素B 在單獨培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞中并沒有影響其SIRT3 基因的表達[5]。因此，月見草素B 是通過Caco-2 細(xì)胞的吸收、轉(zhuǎn)運后，以原型的方式作用于HaCaT 細(xì)胞，還是通過Caco-2 細(xì)胞的代謝作用產(chǎn)生的活性物質(zhì)作用于HaCaT 細(xì)胞，尚有待研究。今后可進一步探究月見草素B 在Caco-2 細(xì)胞單層模型中的攝取特性、轉(zhuǎn)運機制以及代謝產(chǎn)物的組成。再者，體外模擬腸道吸收的條件與實際情況還存在偏差，因此月見草素B 的體內(nèi)藥動學(xué)研究對于優(yōu)化其生物利用度、發(fā)揮其最佳的功效具有重要意義。此外，月見草素B 可能通過影響Caco-2 細(xì)胞自身分泌物的改變，而間接影響HaCaT 細(xì)胞。研究表明，肌肽是一種SIRT3 的激活劑，可促進Caco-2 細(xì)胞分泌可激活神經(jīng)元SH-SY5Y 細(xì)胞的外泌體，并促進外泌體中一種新型miRNA-miR-6769-5p 的表達，從而增強了其靶基因ATXN1 的表達，激活SH-SY5Y 細(xì)胞[31]。多項研究發(fā)現(xiàn)靶向調(diào)節(jié)SIRT3 的miRNA 有很 多，如miRNA-31、miRNA-1、miRNA-19b 和miRNA-320 等[32-33]。因此，從miRNA 層面深入探究在Caco-2 與HaCaT 細(xì)胞共培養(yǎng)體系下，月見草素B 依賴SIRT3 發(fā)揮抗氧化作用的分子機制是個潛在的研究方向。本文的研究為月見草B 作為食品功能因子的開發(fā)提供了理論依據(jù)。