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    穿山龍總皂苷對(duì)去卵巢模型大鼠骨質(zhì)疏松的改善作用*

    2022-02-18 09:04:36孫倩舒丁洪成黃明煒
    中國(guó)藥業(yè) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:穿山龍雌二醇成骨細(xì)胞

    司 敏,孫倩舒,丁洪成,黃明煒

    (湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北 十堰 442000)

    骨骼是有機(jī)基質(zhì)礦化而連續(xù)形成的組織,成骨細(xì)胞的骨形成和破骨細(xì)胞的骨吸收促進(jìn)了骨重塑平衡,破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的形成和功能失衡導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[1]。絕經(jīng)后女性卵巢性激素缺乏是引起骨質(zhì)疏松癥的主要危險(xiǎn)因素[2]。目前,對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,主要采用雌激素替代、雙膦酸鹽和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等藥物治療,但有一定的藥品不良反應(yīng)(如胃腸道耐受)[3]。有研究表明,部分中藥能有效緩解或治療骨損失[4]。穿山龍總皂苷廣泛存在于自然界,具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等多種藥理活性,還可促進(jìn)骨折愈合[5]。本研究中探討了穿山龍總皂苷對(duì)去卵巢模型大鼠骨質(zhì)疏松的改善作用,以及Wnt/ERK 信號(hào)通路[6]在其中起到的作用?,F(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

    1.1.1 儀器

    Lunar DPXIQ 型骨密度儀(美國(guó)GE Healthcare 公司);Endura TELELF 3200 型機(jī)械測(cè)試儀(美國(guó)Bose 公司);DP73 型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司);DH-54152 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Electron公司)。

    1.1.2 試藥

    穿山龍總皂苷(廣東省惠州市中藥廠有限公司,批號(hào)為6365412.63,含量為99.958);17β-雌二醇(中生北控生物科技股份有限公司,批號(hào)為1265963);Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司,批號(hào)為BG-48596.36);PrimescriptTMRT 試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)<北京>有限公司,批號(hào)為SA-474152.38);RIPA 裂解緩沖液(批號(hào)為SD-526996.48),BCA 試劑盒(批號(hào)為CV-569633.36),均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所;10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE,批號(hào)為XZ-56969658.36),電化學(xué)發(fā)光底物蛋白質(zhì)印跡試劑盒(批號(hào)為XC-585963.3),均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)EMD Millipore 公司,批號(hào)為CB-458582.36);抗Wnt,ERK,GAPDH 蛋白的一抗(批號(hào)分別為sc-47724,sc-47952,sc-47156),羊抗小鼠二抗(批號(hào)為BV-2563.36),均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司;乙二胺四乙酸(EDTA,批號(hào)為MN-415895.65),蘇木素-伊紅(HE,批號(hào)為MN-2365.36),均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

    1.1.3 動(dòng)物

    清潔級(jí)SD 大鼠100 只,雌雄兼用,體質(zhì)量為(212.32±25.52)g,購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(魯)2020-01145。喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水,并保持環(huán)境溫度為(25 ± 1)℃,相對(duì)濕度為70%,12 h明暗循環(huán)。本研究符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

    1.2 方法

    1.2.1 模型復(fù)制及分組、給藥

    選取80只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,切開腹部約1.5 cm 長(zhǎng)的皮膚,暴露腹腔、肌肉,暴露卵巢,用絲線結(jié)扎輸卵管,切除雙側(cè)卵巢[7],以股骨骨密度(BMD)低于1.0 g/ cm3為去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型復(fù)制成功。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(等體積0.9%氯化鈉溶液)、17β-雌二醇組(1.6 g/kg)和穿山龍總皂苷低、高劑量組(2 g/kg和4 g/kg)[8],各20只,灌胃給予相應(yīng)藥物(10 mL/ kg),每天1 次,持續(xù)8 周。另取20只大鼠作為正常對(duì)照組,灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

    1.2.2 BMD 檢測(cè)

    末次給藥后,處死大鼠,分離雙側(cè)后肢股骨組織。采用骨密度儀檢測(cè)大鼠右股骨的BMD。

    1.2.3 股骨生物力學(xué)性能檢測(cè)

    采用機(jī)械測(cè)試儀,將垂直載荷施加到股骨的左中軸和左股骨頭的頂部,保持機(jī)械負(fù)荷速率5 mm/ min,直至股骨中軸和股骨頸斷裂。記錄斷裂負(fù)荷數(shù)據(jù),包括彈性模量、剛度、最大應(yīng)力、最大承載力。

    1.2.4 組織病理形態(tài)學(xué)觀察

    將股骨近端組織以4%多聚甲醛固定48 h,用EDTA 脫鈣30 d,石蠟包埋,5 μm 厚切片,二甲苯中脫蠟,經(jīng)系列乙醇水合后,HE 染色,用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠股骨近端組織病理形態(tài)學(xué)。

    1.2.5 股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)

    采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法。取大鼠股骨組織,在液氮中研磨成粉末,Trizol 法取總RNA,使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)RNA 的純度和濃度,以及RNA 的完整性。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA,37 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min,85 ℃逆轉(zhuǎn)錄5 s。Wnt,ERK,GAPDH 引物由中國(guó)寶酒生醫(yī)有限公司合成,序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件如下,95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,退火20 s,72 ℃延伸34 s(40 個(gè)循環(huán))。反應(yīng)系統(tǒng)包括2 μL DNA 模板,0.4 μL PCR 反向引物(10 μmol/L),0.4 μL PCR正向引物(10 μmol/L),10 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和7.2μL無(wú)菌蒸餾水。以GAPDH作內(nèi)參,并采用2-ΔΔCt法計(jì)算Wnt 和ERK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    表1 Wnt,ERK,GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of Wnt,ERK and GAPDH

    1.2.6 股骨組織Wnt 和ERK 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

    采用Western blot 法。取1.2.5 項(xiàng)下大鼠股骨組織粉末,加入含PMSF 的RIPA 裂解緩沖液提取總蛋白,以BCA 法檢測(cè)總蛋白質(zhì)含量。用10%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。在含5%脫脂牛奶的TBST 中封閉1 h,加入抗Wnt,ERK,GAPDH 蛋白的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST 清洗3 次,加入羊抗小鼠二抗,室溫振搖2 h,加入電化學(xué)發(fā)光底物蛋白質(zhì),通過(guò)Image J 軟件將條帶灰度值數(shù)字化,目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 股骨BMD

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠BMD 顯著降低(P<0.05);與模型組比較,17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠BMD 顯著升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠股骨BMD比較(,n=20)Tab.2 Comparison of femoral BMD index of rats in each group(,n=20)

    表2 各組大鼠股骨BMD比較(,n=20)Tab.2 Comparison of femoral BMD index of rats in each group(,n=20)

    注:與正常對(duì)照組比較,*P <0.05;與模型組比較,#P <0.05。下表同。Note:Compared with those in the normal control group,*P <0.05(for Tab.2-5);Compared with those in the model group,#P <0.05(for Tab.2-5).

    2.2 股骨生物力學(xué)性能指標(biāo)

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠彈性模量、剛度、最大應(yīng)力、最大承載力均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠的彈性模量、剛度、最大應(yīng)力、最大承載力均顯著升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

    表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)性能指標(biāo)比較(,n=20)Tab.3 Comparison of biomechanical indexes of femoral bone in each group(,n=20)

    表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)性能指標(biāo)比較(,n=20)Tab.3 Comparison of biomechanical indexes of femoral bone in each group(,n=20)

    2.3 股骨組織病理形態(tài)學(xué)

    正常對(duì)照組大鼠股骨結(jié)構(gòu)正常;模型組大鼠股骨小梁稀疏,出現(xiàn)空骨空洞;17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨遠(yuǎn)端小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)改善,股骨小梁密度增加,空骨腔減少,小梁排列有序,且穿山龍總皂苷低劑量組仍可見(jiàn)一定程度的骨質(zhì)疏松。詳見(jiàn)圖1。

    2.4 股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠股骨Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨Wnt和ERK mRNA 水平均顯著升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

    表4 各組大鼠股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平比較(,n=20)Tab.4 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK mRNA in femur tissues of rats in each group(,n=20)

    表4 各組大鼠股骨組織Wnt 和ERK mRNA 表達(dá)水平比較(,n=20)Tab.4 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK mRNA in femur tissues of rats in each group(,n=20)

    2.5 股骨組織Wnt 和ERK 蛋白表達(dá)水平

    與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠Wnt 和ERK 蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨Wnt和ERK蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。詳見(jiàn)表5。

    表5 各組大鼠股骨組織Wnt和ERK蛋白表達(dá)水平比較(,n=20)Tab.5 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK protein in femur tissues of rats in each group(,n=20)

    表5 各組大鼠股骨組織Wnt和ERK蛋白表達(dá)水平比較(,n=20)Tab.5 Comparison of the expression levels of Wnt and ERK protein in femur tissues of rats in each group(,n=20)

    3 討論

    骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性2種。前者常由衰老和性腺功能下降(如雌激素水平降低)而引起,后者常由其他健康問(wèn)題和藥物(如長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇激素治療)引起[9]。絕經(jīng)后婦女中約40%受骨質(zhì)疏松癥影響,且隨著人口老齡化程度的加劇,這一數(shù)字將持續(xù)增長(zhǎng)。目前臨床常使用的治療藥物包括雙膦酸鹽、抗RANKL、甲狀旁腺激素和雷奈酸鍶,均可降低初次和反復(fù)骨折的風(fēng)險(xiǎn),但價(jià)格昂貴[10]。

    本研究結(jié)果顯示,穿山龍總皂苷可改善去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度,逆轉(zhuǎn)股骨的微觀結(jié)構(gòu),并增強(qiáng)生物力學(xué)性能。同時(shí)17β-雌二醇組及穿山龍總皂苷低、高劑量組大鼠股骨組織的Wnt 與ERK mRNA 和蛋白表達(dá)水平均高于模型組。提示穿山龍總皂能促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨組織的Wnt 與ERK mRNA和蛋白表達(dá)水平,進(jìn)而激活Wnt/ERK 信號(hào)通路。Wnt/ERK 信號(hào)通路參與包括骨骼組織在內(nèi)的許多組織的生長(zhǎng)、發(fā)育和維持的重要途徑[11]。經(jīng)典的Wnt/ERK 信號(hào)傳導(dǎo)極復(fù)雜,并受到廣泛的反饋控制。在無(wú)Wnt 配體的情況下,胞質(zhì)β-連環(huán)蛋白結(jié)合APC-Axin-GSK-3β降解復(fù)合物,而該復(fù)合物中的GSK-3β 磷酸化β-連環(huán)蛋白以誘導(dǎo)其蛋白體降解。當(dāng)Wnt蛋白與受體卷曲蛋白和共受體蛋白LRP5/6 結(jié)合時(shí)信號(hào)蛋白Dsh 被激活,導(dǎo)致絲氨酸/ 蘇氨酸激酶(GSK-3β)失活,從而抑制ERK 的泛素化和降解,導(dǎo)致ERK 聚集于細(xì)胞核中并與LEF-1/ TCF 結(jié)合,以上調(diào)成骨細(xì)胞中Wnt 靶基因Runx2 和Osx 的表達(dá),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和增殖[12-14]。成骨細(xì)胞中的Wnt/ ERK 信號(hào)可誘導(dǎo)骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá),從而抑制破骨細(xì)胞的分化[15-16]。LI等[17]的研究顯示,成骨細(xì)胞的分化減弱,骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的脂肪細(xì)胞分化增強(qiáng),表明Wnt/ERK信號(hào)是促成骨細(xì)胞分化的決定因素[17]。ERK 是Wnt/ ERK 信號(hào)通路中的重要蛋白,小鼠ERK 突變失活,其骨量會(huì)明顯減少[18-20]。

    綜上所述,穿山龍總皂苷能增加去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度,逆轉(zhuǎn)股骨的微觀結(jié)構(gòu),并增強(qiáng)生物力學(xué)性能。其機(jī)制可能與促進(jìn)股骨組織Wnt與ERK mRNA和蛋白的表達(dá),進(jìn)而激活Wnt/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

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