基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索血府逐瘀湯治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制

田 琳，畢勝男，陳夢竹，牛崇陽，齊文龍，王 檀

長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021

原發(fā)性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)是其最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的85%，具有惡性程度高、分化程度低、生長較快的特點(diǎn)，如不及時(shí)治療，5 年生存率低于15%［1-2］；目前臨床治療以化療、放療、免疫治療、介入和中醫(yī)藥治療為主。其中手術(shù)治療是早期NSCLC 的首選方法，但大多數(shù)NSCLC 確診時(shí)已是中晚期，失去了外科手術(shù)的機(jī)會(huì)，臨床常用EP 方案化療，但放化療對人體毒副反應(yīng)大，適應(yīng)癥少。近年來隨著中醫(yī)藥治療惡性腫瘤疾病研究的不斷深入，中醫(yī)辨證治療癌癥取得了理想效果，使得臨床治療惡性腫瘤有了新選擇［3］。

中醫(yī)治療NSCLC 強(qiáng)調(diào)辨證治療、標(biāo)本兼治。瘀阻肺絡(luò)證為肺癌的常見分型，非小細(xì)胞肺癌患者多氣血虧虛，治療常以補(bǔ)氣活血、祛瘀止痛、化痰散結(jié)為治則。血府逐瘀湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草組成，具有活血化瘀、行氣止痛等功效，對治療瘀阻肺絡(luò)型肺癌有一定療效，目前臨床有很多關(guān)于血府逐瘀湯治療NSCLC 的報(bào)道，如張紅等［4］選取80 例NSCLC 患者為研究對象，使用血府逐瘀湯進(jìn)行治療，結(jié)果緩解33例，穩(wěn)定41例，進(jìn)展6 例，總有效率41.25%。張喜峰等［5］選取52例NSCLC 患者為研究對象，使用血府逐瘀湯進(jìn)行治療，結(jié)果緩解率為75.00%，可見，血府逐瘀湯能提高NSCLC 患者肺功能，對改善中醫(yī)證候具有臨床價(jià)值。血府逐瘀湯成分復(fù)雜多樣，其對NSCLC的治療作用機(jī)制目前尚無明確研究報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的一門學(xué)科，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科技術(shù)和內(nèi)容，將生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)與藥物作用網(wǎng)絡(luò)整合，探究疾病及藥物的相互作用機(jī)理，與復(fù)雜疾病的治療理念相吻合［6］，通過對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高藥物療效，降低藥物毒副作用，以此提升新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物研發(fā)費(fèi)用。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲取血府逐瘀湯治療NSCLC 的主要藥物成分及活性靶點(diǎn)，建立相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，分析血府逐瘀湯治療NSCLC 的作用機(jī)制，為臨床使用血府逐瘀湯提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索利用“CNKI、萬方”等數(shù)據(jù)庫的高級檢索，以“血府逐瘀湯+肺癌、血府逐瘀湯＋非小細(xì)胞肺癌、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”為關(guān)鍵詞，以中醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、中西醫(yī)結(jié)合為文獻(xiàn)檢索范圍，檢索時(shí)間不限。

1.2 數(shù)據(jù)庫與分析軟件基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO，美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫）、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（簡稱TCMSP，網(wǎng)址：http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、Practical Extraction and Report Language（Perl）軟件、R語言的Bioconductor 庫、Cytoscape v3.6.0 軟件、CytoNCA安裝包等數(shù)據(jù)庫和軟件。

1.3 基因芯片的篩選在GEO數(shù)據(jù)庫中，以“l(fā)ung cancer+normal”為檢索詞和“series，Expression profiling by array，Home sapiens”為檢索條件，搜索NSCLC 患者和正常人組織的基因芯片，共篩選了42 個(gè)樣本（正常和NSCLC 基因樣本各21個(gè)），并下載NSCLC 組織和正常組織的人源基因芯片的matrix 文件（文件編號為GSE118916）和記載探針和基因名字轉(zhuǎn)化關(guān)系的平臺(tái)文件（文件編號為GPL15207-17536），作為本文研究的樣本信息。

1.4 差異基因（DEGS）的篩選與處理運(yùn)用Perl（Practical Extraction and Report Language）軟件，把樣本信息中探針的名稱轉(zhuǎn)化成基因名稱，得到一個(gè)新的基因文件；把42個(gè)樣品基因分為正常基因（正常組）和癌癥基因（實(shí)驗(yàn)組）兩組，運(yùn)用Perl 軟件進(jìn)行分析，得到樣品表達(dá)的文件；利用R語言中的limma包，以“l(fā)ogFC（過濾閾值）filter=1，adjPflter（校正后的p 閾值）=0.05”為篩選條件，對樣品基因進(jìn)行差異分析，篩選出NSCLC組織較正常組織顯著上調(diào)、下調(diào)的差異基因，利用Library（pheatmap）包繪制基因聚類熱圖和火山圖。

1.5 中藥化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫的建立利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以血府逐瘀湯的組成藥物（桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草）為檢索詞，搜索血府逐瘀湯的藥物靶點(diǎn)；再以“口服生物利用度（OB）≥30（其中甘草OB≥60）和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選其中藥化學(xué)成分。運(yùn)用Perl軟件整理中藥化學(xué)成分和藥物靶點(diǎn)。

1.6 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析將血府逐瘀湯各藥物的靶點(diǎn)基因和NSCLC的差異基因取交集，以交集基因作為橋梁，得到藥物有效成分和基因的關(guān)系與每個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性；運(yùn)用Cytoscapev3.6.0軟件和JAVA8 軟件，以上述交集基因和藥物相關(guān)化學(xué)成分為輸入數(shù)據(jù)，構(gòu)建血府逐瘀湯化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 ppi蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)分析使用Cytoscapev3.6.0軟件中的Bisogenet包，以基因?yàn)檩斎霐?shù)據(jù)，利用深度數(shù)據(jù)包檢測數(shù)據(jù)庫（deep packet inspection，DPI）、蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫（biological general repository for interaction datasets，BIOGRID）、人類蛋白參考數(shù)據(jù)庫（human protein reference database，HPRD）、BIND 等數(shù)據(jù)庫，觀察基因內(nèi)部的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）；利用CytoNCA 包進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)分析，找出臨界節(jié)點(diǎn)數(shù)目相對較高的蛋白和蛋白之間相互作用比較緊密的蛋白，再用這部分蛋白去構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)。

1.8 基因本體（gene ontology，GO）富集分析運(yùn)用R 語言的“org.Hs.eg.db Bioconductor”包，以基因名稱為輸入數(shù)據(jù)，得到基因?qū)?yīng)的id 文件；再利用R 語言的“colorspace、clusterProfiler、enrichlot”等程序包，以id 文件為輸入數(shù)據(jù)，進(jìn)行GO 富集分析，通過圖像展示中藥有效化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用。

1.9 京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析通過R語言的library（clusterProfiler、ggplot2）等包，以id 文件為輸入數(shù)據(jù)，進(jìn)行KEGG通路富集分析；運(yùn)用Cytoscapev3.6.0 軟件構(gòu)建KEGG 關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，其結(jié)果以節(jié)點(diǎn)的形式形象地展示基因與信號通路之間的富集關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 差異基因表達(dá)通過對GEO 數(shù)據(jù)庫中NSCLC患者與正常人組織的基因芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，共獲取NSCLC肺組織與正常肺組織的差異基因2861個(gè)，上調(diào)基因1313 個(gè)，下調(diào)基因1548 個(gè)。差異表達(dá)基因熱圖見圖1，差異表達(dá)基因火山圖見圖2。

圖1 差異表達(dá)基因熱圖

圖2 差異表達(dá)基因火山圖

2.2 化合物有效活性成分篩選利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，以“口服生物利用度（OB）≥30（其中甘草OB≥60）和類藥性（DL）≥0.18”為條件篩選血府逐瘀湯的中藥化學(xué)成分，獲得柴胡、赤芍、川芎、當(dāng)歸、紅花、桔梗、牛膝、生地黃、桃仁、枳殼有效活性成分分別為17、29、7、2、22、7、20、6、23、5 個(gè)，血府逐瘀湯總有效活性成分為161個(gè)。

2.3 血府逐瘀湯的“化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖運(yùn)用Cytoscapev3.6.0 軟件和JAVA8 軟件構(gòu)建血府逐瘀湯治療NSCLC“化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。先將1984 個(gè)血府逐瘀湯化合物靶點(diǎn)與2861 個(gè)NSCLC 靶點(diǎn)基因取交集，得到69 個(gè)交集基因，對應(yīng)血府逐瘀湯中82 個(gè)候選化合物，包括柴胡有效化合物12個(gè)、川芎有效化合物4個(gè)、甘草有效化合物22個(gè)、桔梗有效化合物2個(gè)、牛膝有效化合物7 個(gè)，枳殼有效化合物4 個(gè)、紅花有效化合物9個(gè)、桃仁有效化合物11個(gè)、赤芍有效化合物4個(gè)、多種藥混合有效化合物7個(gè)。血府逐瘀湯候選化合物成分見表1。再把69個(gè)交集基因和82個(gè)血府逐瘀湯的候選化合物做為“化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)，得到了397 條邊，見圖3。圖中度值最高的化合物為槲皮素（quercetin），其次為毛地黃黃酮（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）、甘草寧G（Gancaonin G）等。這些度值較高的化合物可能是血府逐瘀湯治療NSCLC 的關(guān)鍵化合物。體現(xiàn)了血府逐瘀湯治療NSCLC 的多靶點(diǎn)、多成分特點(diǎn)。

圖3 血府逐瘀湯“化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖

表1 血府逐瘀湯候選化合物成分

2.4 血府逐瘀湯治療NSCLC 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和網(wǎng)絡(luò)拓補(bǔ)分析Cytoscape v3.6.0 軟件的Bisogenet 包以69 個(gè)基因?yàn)檩斎霐?shù)據(jù)，在DPI、BIOGRID、HPRD、BIND 等數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建各共有靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。針對血府逐瘀湯治療NSCLC，運(yùn)用CytoNCA 包，以DC≥61，BC≥1500 為篩選條件，對臨界節(jié)點(diǎn)數(shù)目較高的蛋白進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，繪制出由88 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)組成的核心網(wǎng)絡(luò)，核心網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)名稱見表2，篩選策略圖見圖4。

圖4 篩選策略示意圖

2.5 基因本體論（GO）富集分析GO 富集分析得到935 個(gè)GO 條目，列舉生物學(xué)功能排名較靠前的20 個(gè)條目，見圖5—6。圖中顯示血府逐瘀湯的中藥活性成分主要富集在對活性氧的反應(yīng)過程、營養(yǎng)代謝過程、類固醇激素代謝過程、對機(jī)械刺激的反應(yīng)過程、氧化水平過程、鎘離子響應(yīng)過程等生物過程中；中藥活性成分主要影響膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)域等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖5 GO富集功能分析（BP富集結(jié)果）

2.6 KEGG富集通路分析通過R語言的library（cluster Profiler、ggplot2）等包，對基因名字進(jìn)行KEGG通路富集分析得到69條信號通路，列舉排名靠前的20 個(gè)條目，見圖7。主要包括膀胱癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、前列腺癌信號通路、乙型肝炎信號通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、人類T細(xì)胞白血病病毒1型感染信號通路、細(xì)胞衰老信號通路、白介素17 信號通路、松弛素信號通路等，提示血府逐瘀湯通過作用于以上多條信號通路治療NSCLC。

圖6 GO富集功能分析（CC富集結(jié)果）

圖7 KEGG富集通路氣泡圖

3 討論

原發(fā)性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，而NSCLC 是其最常見的類型，NSCLC 有很多致病因素。駱文斌等［7］認(rèn)為肺癌的主要致病因素有邪毒留滯、飲食內(nèi)傷、情志勞倦及體質(zhì)等。邪毒侵肺，或情志內(nèi)傷，導(dǎo)致肺失疏泄而生痰，或因飲食不節(jié)，平素過食生冷辛辣，致使脾胃運(yùn)化功能失常，內(nèi)生痰濁瘀血，蘊(yùn)結(jié)于肺，形成積塊。在眾多發(fā)病機(jī)制中，痰瘀最為嚴(yán)重，二者相互影響，既是病理產(chǎn)物，又是致病因素，血府逐瘀湯方中黃芪益氣固表；桃仁潤燥行滯；紅花止痛化瘀、引血下行；赤芍、川芎活血通經(jīng)；生地黃清熱活血、養(yǎng)血益陰；柴胡升達(dá)清陽、疏肝解郁；桔梗、枳殼寬胸行氣，與柴胡同用，可使氣血循環(huán)、理氣行滯；甘草具有調(diào)和諸藥之效。諸藥合用可益氣補(bǔ)肺、疏肝解郁、引血下行，達(dá)到化瘀、活血、行氣的效果，對治療NSCLC有良好療效［8-9］，本研究運(yùn)用中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和基因芯片分析血府逐瘀湯的有效成分及作用靶點(diǎn)，為臨床使用血府逐瘀湯提供數(shù)據(jù)支持。

從NSCLC 組織與正常組織的基因差異分析結(jié)果看，共獲得兩者的差異基因2861 個(gè)，上調(diào)基因1313個(gè)，下調(diào)基因1548 個(gè)，以此作為血府逐瘀湯治療NSCLC 的靶基因。經(jīng)過分析血府逐瘀湯的有效化學(xué)成分和藥物作用靶點(diǎn)，構(gòu)建中藥復(fù)方治療NSCLC 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)槲皮素（quercetin）、毛地黃黃酮（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）等化學(xué)成分的度值在圖中排名靠前，槲皮素、毛地黃黃酮是血府逐瘀湯的混合藥物有效成分，甘草、牛膝、紅花等多種藥物都含有這兩種成分，漢黃芩素是牛膝的有效成分。目前藥物有效成分的相關(guān)研究表明，槲皮素是一種天然類黃酮，它具有抗氧化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抗微小血管生成等作用，而氧化、細(xì)胞凋亡、免疫等是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和惡變的基礎(chǔ)，所以槲皮素貫穿腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展的終始。槲皮素還能調(diào)控PI3K/Akt、MAPK、MMP-9 等的細(xì)胞信號通路，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻止腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等作用［10-12］。毛地黃黃酮是一種天然植物多酚化合物，目前臨床研究表明黃酮具有抑制氧化、抵抗炎癥、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的生物學(xué)作用，其分子結(jié)構(gòu)3，6 一二羥基黃酮具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性分子，能夠抑制腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、侵襲、血管生成以及耐藥性等細(xì)胞生物過程［13］。漢黃芩素為中藥牛膝的主要活性成分之一，是一種黃酮類化合物，黃愷飛等［14］研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素可以誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549 凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)Bcl-2、survivin表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白有關(guān)?？梢姡痧鰷饕蚤纹に?、毛地黃黃酮、漢黃芩素等化合物成分作用于NSCLC 基因，達(dá)到治療（NSCLC 的目的。

從蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果看，AKT1、PCNA、BRCA1、TP53等是血府逐瘀湯治療NSCLC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT1能夠參與細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝的細(xì)胞過程。在人基因里，TP53是非常重要的抑癌基因，在正常細(xì)胞中低表達(dá)，在惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)［15］；目前有很多關(guān)于RRM1 的報(bào)道，如王文然等［16-17］以54 例NSCLC 患者為研究對象，采用吉西他濱聯(lián)合卡鉑化療方案，化療前后檢測腫瘤組織及外周血中BRCA1 與RRM1 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)RRM1 表達(dá)可作為預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者吉西他濱聯(lián)合卡鉑治療預(yù)后的因子，可以推斷出血府逐瘀湯主要作用于AKT1、PCNA、BRCA1、TP53 等靶點(diǎn)，達(dá)到治療NSCLS的效果。

從GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果看，血府逐瘀湯的中藥活性成分主要富集在對活性氧的反應(yīng)過程、營養(yǎng)代謝過程、類固醇激素代謝過程、對機(jī)械刺激的反應(yīng)過程、氧化水平過程、鎘離子響應(yīng)過程等生物過程中；其治療NSCLC 的通路主要包括膀胱癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、前列腺癌信號通路、乙型肝炎信號通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化信號通路、人類T細(xì)胞白血病病毒1型感染信號通路、細(xì)胞衰老信號通路、白細(xì)胞介素17 信號通路、松弛素信號通路等。臨床研究表明，血府逐瘀湯可以通過降低全血黏度、血小板黏附性，提高紅細(xì)胞變形性及降低白細(xì)胞介素16等［18-20］炎癥介質(zhì)等多種途徑，改善患者血流狀況，起到治療NSCLC 的作用、提高患者生存質(zhì)量。但目前還缺少對血府逐瘀湯治療NSCLC 的具體蛋白、具體信號通路的研究，本研究可以推斷出血府逐瘀湯治療NSCLC 直接或者間接涉及到的蛋白和信號通路，從而提高中醫(yī)中藥治療NSCLC的成功率。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和基因芯片分析方法初步探究了血府逐瘀湯多成分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜機(jī)制過程，可為臨床使用血府逐瘀湯治療NSCLC提供數(shù)據(jù)支持。