健脾補(bǔ)腎方對輻射損傷小鼠全血細(xì)胞及免疫器官的影響研究

何東初，肖靜靜，張夢云，張 勇，丁曉娟，伍 偉，楊文超

(中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

電離輻射可導(dǎo)致機(jī)體多系統(tǒng)損傷，其中造血及免疫系統(tǒng)對電離輻射高度敏感，損傷后易導(dǎo)致病情進(jìn)展及預(yù)后不良[1-2]，故輻射后造血功能的恢復(fù)以及免疫功能的重建是治療的關(guān)鍵。目前，臨床上常用的電磁輻射防治方法包括電磁屏蔽裝置物理防護(hù)、生物治療、化學(xué)藥物治療等，其中防護(hù)效果好的卻存在明顯不良反應(yīng)而限制了其廣泛應(yīng)用[3-4]。近年來，中醫(yī)藥憑借整體觀念和辨證施治的優(yōu)勢，在電磁輻射損傷防治中取得了顯著療效，從中醫(yī)藥角度尋求輻射防治策略成為輻射領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5-6]。健脾補(bǔ)腎方是防治輻射損傷的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床研究表明該方能夠顯著改善白細(xì)胞減少癥、血虛證及腫瘤放療損傷患者的造血和免疫功能[7]；基礎(chǔ)研究表明健脾補(bǔ)腎方的防輻射損傷機(jī)制涉及減輕氧化損傷[8]，調(diào)控Wnt信號通路[9-10]，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡基因、細(xì)胞黏附分子表達(dá)等方面[11-12]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過對比觀察輻射后以及健脾補(bǔ)腎方干預(yù)后外周血細(xì)胞和免疫器官的動(dòng)態(tài)變化，從而更系統(tǒng)更全面地了解輻射對機(jī)體的損傷效應(yīng)及健脾補(bǔ)腎方的治療效應(yīng)，為輻射損傷防治提供新的治療手段。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級昆明種小鼠90只，體重18～22 g，雌雄各半，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物合格證號：42000600035569，飼養(yǎng)條件：SPF級別。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會審核通過[武總動(dòng)(福)第2018003號]。

1.2藥物制備 健脾補(bǔ)腎方由熟地黃30 g、炙甘草15 g、當(dāng)歸6 g、黃芪30 g、澤瀉9 g、陳皮10 g組成，由中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑室制備，經(jīng)水煎、過濾、濃縮后，制成生藥濃度1 g/mL和2 g/mL的藥液，分裝備用。胸腺肽腸溶片：西安迪賽生物藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H19991177，規(guī)格：30 mg/片。

1.3主要試劑及儀器 輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī)(rm2016)，德國Leica公司；生物組織攤烤片機(jī)(JK-6)，武漢俊杰公司；生物顯微鏡(BX53)，奧林巴斯公司；邁瑞獸用全自動(dòng)血液分析儀(BC-2800vet)；電子天平(CPA)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；蘇木素染液(貨號：H967)，Sigma公司；水溶性伊紅染液(貨號：71014544)、無水乙醇(10009218)、二甲苯溶液(貨號：10023418)、包埋石蠟(貨號：69019361)、中性樹膠(貨號：10004160)，國藥集團(tuán)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 90只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選擇18只作為正常組，其余小鼠采用一次性給予直線加速器6.0 Gy X射線全身照射，劑量率為450侖，以小鼠食欲下降、活動(dòng)減少、白細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常小鼠比較明顯下降為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。將造模成功小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、健脾補(bǔ)腎方小劑量組、健脾補(bǔ)腎方大劑量組、胸腺肽組，每組18只。健脾補(bǔ)腎方小劑量組給予1 g/mL健脾補(bǔ)腎方灌胃，健脾補(bǔ)腎方大劑量組給予2 g/mL健脾補(bǔ)腎方灌胃，胸腺肽組給予胸腺肽腸溶片混懸液0.325 mg/mL灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，灌胃量均為0.2 mL/10 g，2次/d。

1.5檢測指標(biāo)及方法 每組分別于灌胃第7，14，30天各隨機(jī)取6只小鼠稱體重，收集外周血，分離脾臟、胸腺并稱重。

1.5.1外周血細(xì)胞測定 各組小鼠外周血用EDTA抗凝，取20 μL進(jìn)行20倍稀釋，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、血小板計(jì)數(shù)。

1.5.2胸腺和脾臟指數(shù)測定 采用以下公式計(jì)算各組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=[胸腺重量(mg)/小鼠體重(g)]×10；脾臟指數(shù)=[脾臟重量(mg)/小鼠體重(g)]×10。

1.5.3脾臟組織病理學(xué)觀察 取各組小鼠經(jīng)4%多聚甲醛固定的脾臟組織，置于常規(guī)梯度酒精中脫水，二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，切片，HE染色，風(fēng)干后中性樹膠封片，鏡檢采集照片。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較模型組灌胃第7天白細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組大幅度降低(P<0.05)；灌胃第14天和第30天白細(xì)胞計(jì)數(shù)略有回升，但仍明顯低于正常組(P均<0.05)。各藥物組灌胃第7天、第14天、第30天白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于同期模型組(P均<0.05),且健脾補(bǔ)腎方小劑量組、胸腺肽組灌胃第14天、第30天白細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于同期健脾補(bǔ)腎方大劑量組(P均<0.05)。灌胃第30天，健脾補(bǔ)腎方小劑量組、胸腺肽組白細(xì)胞計(jì)數(shù)已恢復(fù)正常，與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和輻射損傷各組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.2各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 模型組灌胃第7天淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組大幅度降低(P<0.05)；灌胃第14天和第30天淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)略有回升，但仍明顯低于正常組(P均<0.05)。灌胃第7天，健脾補(bǔ)腎方小劑量組和胸腺肽組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于模型組及健脾補(bǔ)腎方大劑量組(P均<0.05)，健脾補(bǔ)腎方大劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；灌胃第14天、第30天，各藥物組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，且健脾補(bǔ)腎方小劑量組灌胃第14天淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于健脾補(bǔ)腎方大劑量組(P均<0.05)；灌胃第30天，健脾補(bǔ)腎方小劑量組、胸腺肽組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和輻射損傷各組小鼠淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.3各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較模型組灌胃第7天紅細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組大幅度降低(P<0.05)，灌胃第14天仍持續(xù)下降(P<0.05)；灌胃第30天略有回升，但仍明顯低于正常組(P<0.05)。灌胃第7天，健脾補(bǔ)腎方小劑量組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于模型組(P<0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，健脾補(bǔ)腎方大劑量組、胸腺肽組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃第14天，健脾補(bǔ)腎方大劑量組、胸腺肽組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于模型組(P均<0.05)，但仍明顯低于正常組和健脾補(bǔ)腎方小劑量組(P均<0.05)，健脾補(bǔ)腎方小劑量組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)維持正常水平；灌胃第30天，各藥物組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均恢復(fù)正常，與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 正常組和輻射損傷各組小鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

2.4各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血紅蛋白含量比較 模型組灌胃第7天血紅蛋白含量較正常組大幅度降低(P<0.05)，灌胃第14天仍持續(xù)下降(P<0.05)；灌胃第30天略有回升，但仍明顯低于正常組(P<0.05)。各藥物組灌胃第7天、第14天、第30天血紅蛋白含量均明顯高于同期模型組(P均<0.05),其中健脾補(bǔ)腎方小劑量組灌胃第7天血紅蛋白含量均明顯高于健脾補(bǔ)腎方大劑量組和胸腺肽組(P均<0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；健脾補(bǔ)腎方小劑量組和胸腺肽組灌胃第14天血紅蛋白含量與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃第30天，各藥物組血紅蛋白含量與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表4。

表4 正常組和輻射損傷各組小鼠血紅蛋白含量比較

2.5各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血血小板計(jì)數(shù)比較模型組灌胃第7天血小板計(jì)數(shù)較正常組大幅度降低(P<0.05)，灌胃第14天仍持續(xù)下降(P<0.05)；灌胃第30天略有回升，但仍明顯低于正常組(P<0.05)。各藥物組灌胃第7天、第14天、第30天血小板計(jì)數(shù)均明顯高于同期模型組(P均<0.05),其中健脾補(bǔ)腎方小劑量組均明顯高于同期健脾補(bǔ)腎方大劑量組和胸腺肽組(P均<0.05)，且灌胃第14天和第30天血小板計(jì)數(shù)與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表5。

表5 正常組和輻射損傷各組小鼠血小板計(jì)數(shù)比較

2.6各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)胸腺指數(shù)比較 模型組灌胃第7天胸腺指數(shù)較正常組明顯降低(P<0.05)，灌胃第14天、第30天仍持續(xù)降低(P均<0.05)。各藥物組灌胃第7天、第14天、第30天胸腺指數(shù)均明顯高于同期模型組(P均<0.05),但均明顯低于正常組(P均<0.05)；健脾補(bǔ)腎方小劑量組灌胃第30天胸腺指數(shù)明顯高于健脾補(bǔ)腎方大劑量組(P<0.05)。見表6。

表6 正常組和輻射損傷各組小鼠胸腺指數(shù)比較

2.7各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)脾臟指數(shù)比較 模型組灌胃第7天脾臟指數(shù)較正常組明顯降低(P<0.05)；灌胃第14天稍有回升，灌胃第30天再次下降，且均明顯低于正常組(P均<0.05)。各藥物組灌胃第7天、第14天、第30天脾臟指數(shù)均明顯高于同期模型組(P均<0.05)，其中第14天各組脾臟指數(shù)與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，第30天健脾補(bǔ)腎方大劑量組脾臟指數(shù)明顯低于正常組(P<0.05)，健脾補(bǔ)腎方小劑量組、胸腺肽組與正常組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表7。

表7 正常組和輻射損傷各組小鼠脾臟指數(shù)比較

2.8各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)脾臟形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正常組小鼠脾臟組織中白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰完整。模型組小鼠灌胃后第7天脾小體結(jié)構(gòu)消失，大量淋巴細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織增生；灌胃后第14天和第30天，病理改變較前略減輕。各藥物組小鼠脾臟病理改變均較模型組有所改善，其中脾臟結(jié)構(gòu)損傷情況健脾補(bǔ)腎方小劑量組明顯輕于模型組，胸腺肽組、健脾補(bǔ)腎方大劑量組較模型組稍有改善；炎性細(xì)胞浸潤情況健脾補(bǔ)腎方小劑量組、胸腺肽組較模型組明顯減輕，健脾補(bǔ)腎方大劑量組改善不明顯。見圖1。

圖1 正常組和輻射損傷各組小鼠不同時(shí)間脾臟組織HE染色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

輻射損傷屬于中醫(yī)中的“攻法”，易損傷人體正氣，造成臟腑氣血虧虛，日久不復(fù)，致脾腎氣血虧虛，故輻射損傷屬中醫(yī)的“虛勞”“血虛證”范疇[13]。健脾補(bǔ)腎方以大劑量熟地黃、甘草為君藥，熟地黃入肝、腎經(jīng)，可滋陰養(yǎng)血，填精益髓，補(bǔ)先天腎元；甘草補(bǔ)益脾氣，益氣復(fù)脈，補(bǔ)后天脾胃元?dú)?。以黃芪補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，二者共為臣藥，加強(qiáng)益氣生血之功效。佐以陳皮理氣健脾，以補(bǔ)后天之本，同時(shí)行氣導(dǎo)滯，以防補(bǔ)益藥之滋膩及滯氣之弊。以澤瀉為使藥，宣泄腎濁，引藥歸經(jīng)。全方補(bǔ)治脾腎先后天之本，升提陽氣，使精氣血生化有源?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草能夠有效刺激T淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)肥胖小鼠的免疫活性和抗氧化酶的活性[14]。地黃多糖能夠提高機(jī)體內(nèi)源性抗氧化功能，促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖，升高外周血細(xì)胞及免疫器官指數(shù)，提高小鼠脾臟CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值，從而促進(jìn)輻射所致的骨髓抑制小鼠造血功能的恢復(fù)，并增強(qiáng)其免疫功能[15-16]。黃芪多糖可促進(jìn)造血細(xì)胞因子的分泌，改善化療和放療引起的骨髓抑制狀態(tài)[17]，促進(jìn)Th1型免疫細(xì)胞因子表達(dá)以及提高B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫，從而改善免疫功能[18]。綜上，健脾補(bǔ)腎方具有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫功能的雙重作用。

外周血細(xì)胞是衡量造血功能的重要指標(biāo)，其中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降會減弱機(jī)體的防御能力，容易使機(jī)體繼發(fā)各種嚴(yán)重感染；血紅蛋白含量及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)下降會導(dǎo)致嚴(yán)重貧血；血小板計(jì)數(shù)下降可引起不同程度的出血。上述指標(biāo)的變化均是造成輻射后死亡的重要原因[19]。本實(shí)驗(yàn)采用6.0 Gy X射線一次性全身照射后，小鼠外周血各類血細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著減少，其中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)在照射后第7天急劇下降，且下降趨勢最為顯著，后期自然恢復(fù)緩慢，可能與淋巴細(xì)胞具有更高輻射敏感性，或是輻射同時(shí)造成白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞再生的免疫器官損傷有關(guān)；紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量明顯下降，但損傷程度不如白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞嚴(yán)重，且后期恢復(fù)較快，可能與成熟紅細(xì)胞輻射敏感性較低、壽命較長有關(guān)；血小板計(jì)數(shù)在照射后下降很緩慢，主要原因是成熟的巨核細(xì)胞輻射敏感性低，在照射后初期也仍可繼續(xù)生產(chǎn)血小板，但至照射后第14天血小板顯著降低，可能與骨髓巨核細(xì)胞損傷程度逐步加重，數(shù)量逐漸減少，血小板無來源補(bǔ)充有關(guān)。與模型組比較，健脾補(bǔ)腎方小、大劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)均明顯升高，且健脾補(bǔ)腎方小劑量組于第7天紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量恢復(fù)正常，于第14天血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常，于第30天白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)恢復(fù)正常。說明健脾補(bǔ)腎方可以加快輻射后外周血細(xì)胞的恢復(fù)，從而降低感染風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防貧血和出血的發(fā)生。

胸腺、脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、發(fā)育和成熟的場所，對于維持機(jī)體免疫功能起著重要作用，其臟器系數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[20]。研究表明，當(dāng)機(jī)體遭受大于4.0 Gy照射時(shí)，可造成嚴(yán)重的骨髓型放射病[21]。本研究輻射的劑量是6.0 Gy，雖未造成小鼠死亡，但小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)以及脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷至照射后第30天仍自行緩解不明顯，說明輻射已造成小鼠免疫器官的嚴(yán)重?fù)p傷，可能與輻射劑量較高，導(dǎo)致骨髓損傷造成干細(xì)胞來源不足，免疫器官再生修復(fù)能力下降有關(guān)。照射后第7天、第14天、第30天，健脾補(bǔ)腎方小、大劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯高于模型組，脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，且健脾補(bǔ)腎方小劑量組于照射后第14天脾臟指數(shù)恢復(fù)至正常。說明健脾補(bǔ)腎方可以減輕輻射對免疫器官的損傷，促進(jìn)免疫器官的修復(fù)，從而提高機(jī)體防御力和免疫力。

綜上所述，健脾補(bǔ)腎方對輻射導(dǎo)致的全血細(xì)胞減少及免疫器官損傷具有顯著的防護(hù)作用。健脾補(bǔ)腎方小劑量組各個(gè)指標(biāo)的改善程度優(yōu)于健脾補(bǔ)腎方大劑量組，可能由于健脾補(bǔ)腎方中含有熟地黃、甘草、當(dāng)歸等滋膩之品，適宜濃度可益氣生血，劑量過大易阻礙脾胃的運(yùn)化，影響藥物的有效吸收，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。