金花茶組培玻璃化苗的預(yù)防及控制技術(shù)研究

韋金梅，朱其伍，俞建妹，鐘 柳，唐相紅

(廣西壯族自治區(qū)南寧樹木園，廣西 南寧 530031)

金花茶（Camellia chrysantha（Hu）Tuyama)是山茶科山茶屬植物，國家一級(jí)保護(hù)植物[1]。金花茶1933年首次在廣西防城被發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)將金花茶譽(yù)為“茶族皇后”，國外則稱之為“幻想中的黃色山茶”，其具有較高的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和科研價(jià)值[2]。金花茶目前主要以種子或扦插繁殖，所需母株較多且苗木生長速度相對(duì)較慢，苗期參差不齊，難以短時(shí)間繁殖較多的優(yōu)質(zhì)種苗，組織培養(yǎng)能夠在短時(shí)間內(nèi)培育出大量的優(yōu)質(zhì)種苗，可較好地解決此問題。南寧樹木園自2014年7月起開展了金花茶組培技術(shù)應(yīng)用研究工作，目前已實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但在生產(chǎn)實(shí)踐中易形成玻璃化苗（圖1）。玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)中普遍發(fā)生的一種生理失調(diào)或生理病變，其不易分化和生根，移栽成活率很低，且很難恢復(fù)正常，嚴(yán)重影響組培快繁體系的穩(wěn)定性[3]。組培苗玻璃化與接種外植體、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件關(guān)系均十分密切[4—5]。培養(yǎng)基直接為組培苗提供支撐介質(zhì)，與組培苗玻璃化關(guān)系尤其密切[6]。為了預(yù)防及控制玻璃化苗，本試驗(yàn)通過在培養(yǎng)基中添加CH、瓊脂粉及蔗糖，并調(diào)整不同光照強(qiáng)度，研究不同添加物濃度和光照強(qiáng)度對(duì)芽苗玻璃化的影響，旨在為金花茶組培育苗提供參考。

圖1 玻璃化苗

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為廣西南寧樹木園金花茶基因庫中生長健壯、花朵繁多、花瓣蠟質(zhì)純黃、32年生的金花茶優(yōu)良單株種胚。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌材料的獲得采集六七成熟的金花茶種子，洗凈去果皮后放入超凈工作臺(tái)待用。種子在1%的升汞溶液浸泡種子6～8 min后，用無菌水沖洗8～10遍，再用無菌濾紙吸干表面的水分，去掉種皮，將種胚接種于培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)7～10 d,待胚根及胚芽伸長生長后進(jìn)行光照培養(yǎng)。胚芽伸長生長達(dá)3 cm以上且半木質(zhì)化后進(jìn)行芽苗擴(kuò)繁。

1.2.2 芽苗擴(kuò)繁將剪下的芽苗單株接種于改良MS繼代培養(yǎng)基（MS+Na2SO450.0 mg/L+6-BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L）中進(jìn)行培養(yǎng)。芽苗基部分化出叢生芽，達(dá)到擴(kuò)繁要求。在叢生芽伸長生長培養(yǎng)過程中，部分芽苗易發(fā)生玻璃化，不利于形成有效芽。通過在培養(yǎng)基中添加有機(jī)物及改善光照條件，可較好地防治玻璃化，利于有效芽苗的擴(kuò)繁。

1.2.3 不同添加物對(duì)芽苗玻璃化的影響通過對(duì)培養(yǎng)基添加不同質(zhì)量濃度的CH、瓊脂粉及蔗糖，研究對(duì)芽苗玻璃化的影響，本試驗(yàn)采用L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。CH質(zhì)量濃度分別為200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度分別為4 g/L、5 g/L、6 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度分別為20 g/L、30 g/L、40 g/L。試驗(yàn)共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接芽3叢，3次重復(fù)，培養(yǎng)40 d統(tǒng)計(jì)新芽玻璃化情況。

1.2.4 不同光照對(duì)芽苗玻璃化的影響將叢芽接種于不同的改良MS培養(yǎng)基后，置于不同光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度分別為800～1 000 lx、1 000～2 000 lx、2 000～3 000 lx、3 000～4 000 lx，試驗(yàn)共4個(gè)處理，每個(gè)處理接種50瓶，每瓶接芽3叢，光照時(shí)間12～14 h/d，培養(yǎng)40 d統(tǒng)計(jì)新芽芽高及玻璃化情況。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基pH=6.0，在1.1 MPa、120℃高溫高壓條件下滅菌消毒20 min。培養(yǎng)室溫度（23±2）℃，接種初期暗培5～7 d，然后以設(shè)計(jì)的光照強(qiáng)度和時(shí)間進(jìn)行培育。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013及SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加物對(duì)芽苗玻璃化的影響

從表1、2可知，不同添加物對(duì)芽苗的生長均存在一定的影響，組間存在顯著性差異。處理1—處理3中，芽苗高度為3.0～3.5 cm，處理4—處理9中，芽苗高度為5.8～6.5 cm。處理1—處理6中，芽苗的玻璃化率低于20%，在處理7—處理9中，芽苗玻璃化率高達(dá)79%以上，對(duì)生產(chǎn)影響較大。需對(duì)各添加物不同濃度進(jìn)行顯著性分析。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L 9（34）芽苗苗高及玻璃化率統(tǒng)計(jì)表

表2 芽苗玻璃化方差分析

2.2 CH質(zhì)量濃度對(duì)芽苗玻璃化的影響

從表3及叢芽擴(kuò)繁情況可知，各芽苗擴(kuò)繁系數(shù)一致，但長勢參差不齊，由此可知，CH對(duì)擴(kuò)繁系數(shù)不存在較為明顯的影響，但對(duì)芽苗的生長影響較大。當(dāng)CH質(zhì)量濃度≤300 mg/L時(shí)，芽苗玻璃化率≤14.63%；當(dāng)CH質(zhì)量濃度達(dá)到400 mg/L時(shí)，芽苗玻璃化率高達(dá)84.44%，由此可知，芽苗生長中需要CH促進(jìn)細(xì)胞分裂的速度，但其對(duì)細(xì)胞內(nèi)部成分又存在一定的改變作用，即可促進(jìn)芽苗生長，同時(shí)因量大會(huì)起到一定的毒害作用，這與洪森榮等[7]研究水解乳蛋白和水解酪蛋白對(duì)黃獨(dú)試管苗生長發(fā)育的影響的結(jié)論一致。因此，本試驗(yàn)培養(yǎng)基中CH質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)較佳。

表3 CH對(duì)芽苗玻璃化顯著性分析

2.3 瓊脂粉對(duì)叢芽玻璃化的影響試驗(yàn)

從表4可知，本試驗(yàn)中的瓊脂粉質(zhì)量濃度對(duì)芽苗的玻璃化影響存在顯著差異（P<0.05），最佳用量6 g/L。從玻璃化率的數(shù)值可知瓊脂粉的質(zhì)量濃度對(duì)玻璃化有明顯的影響，這與瓊脂粉的物質(zhì)特性有關(guān)。瓊脂粉主要材料為藻類，主要用以凝固營養(yǎng)液，用量以材料能便于插入及立穩(wěn)于營養(yǎng)液中為度，同時(shí)可提供一定的養(yǎng)分及控制瓶內(nèi)濕度。濕度是造成玻璃化苗的主要原因之一，瓊脂粉質(zhì)量濃度高時(shí),可降低培養(yǎng)基含水量及瓶內(nèi)濕度,從而降低組培中的玻璃化苗發(fā)生的概率，這與尹品訓(xùn)等[8]在2004年研究大麻組織培養(yǎng)中玻璃化苗的結(jié)論一致。

表4 瓊脂粉對(duì)芽苗玻璃化顯著性分析

2.4 蔗糖對(duì)叢芽玻璃化的影響試驗(yàn)

從表5中可知，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的變化，芽苗的玻璃化率存在較大的變化，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L時(shí)，玻璃化率低至13.33%，與質(zhì)量濃度為20 g/L和30 g/L的處理間存在顯著差異（P<0.05）?？赡茉蚴茄棵缟L需要較多的碳源，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L以上時(shí)可滿足其碳需求，促進(jìn)芽苗健壯，有效降低玻璃化率。因此，本試驗(yàn)培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度達(dá)到40 g/L時(shí)，可較好地降低瓶苗玻璃化。

表5 蔗糖對(duì)芽苗玻璃化顯著性分析

2.5 光照對(duì)叢芽玻璃化的影響試驗(yàn)

金花茶喜陰喜濕不耐旱、怕曬不耐高溫，但在生長過程中卻又需適宜的光照。從表6可知，當(dāng)芽苗長時(shí)間處于光照強(qiáng)度<1 000 lx的環(huán)境中，其玻璃化率高達(dá)45.33%，不利于芽苗的生長及用于擴(kuò)繁或生根；當(dāng)芽苗長時(shí)間處于光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx的環(huán)境中，其玻璃化率為8.00%，但不利于生長；當(dāng)芽苗長時(shí)間處于光照強(qiáng)度>2 000 lx的環(huán)境中，其玻璃化率為0，但不能長時(shí)間處于強(qiáng)光照的環(huán)境中，如長時(shí)間處于>3 000 lx的環(huán)境中會(huì)使長勢變差，枯死現(xiàn)象嚴(yán)重，難存活，最好的光照環(huán)境為2 000～3 000 lx，芽苗生長健壯?？赡茉?yàn)樵谝欢ǖ墓庹諒?qiáng)度時(shí)間內(nèi)，隨著光照強(qiáng)度的增加，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞葉綠體的形成，促進(jìn)光合作用的進(jìn)行，合成更多的有機(jī)物，有利于細(xì)胞壁、細(xì)胞器形態(tài)的建成，從而減少玻璃化的發(fā)生[9]。

表6 光照強(qiáng)度對(duì)芽苗玻璃化的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

金花茶芽苗在添加CH 300 mg/L、瓊脂粉6 g/L、蔗糖40 g/L的改良MS培養(yǎng)基中，在光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx的環(huán)境下培養(yǎng)，苗平均高度可達(dá)6.0 cm以上,平均玻璃化率可降至為0，生長健壯，可進(jìn)行單芽生根（圖2、圖3）。

圖2 不定芽壯苗

圖3 不定芽生根

3.2 討論

在生產(chǎn)過程中，為了降低生產(chǎn)成本及加快苗木在室內(nèi)培育的周轉(zhuǎn)速度，以預(yù)防發(fā)生玻璃化苗為主，一旦發(fā)生玻璃化苗現(xiàn)象，基本上采取培養(yǎng)基處理及加強(qiáng)光照強(qiáng)度時(shí)間并及時(shí)去除已產(chǎn)生的玻璃化苗，在材料充足的情況下不會(huì)采取對(duì)玻璃化苗處理后使其逆轉(zhuǎn)直至恢復(fù)成正常苗，主要原因?yàn)槟孓D(zhuǎn)時(shí)間過長且恢復(fù)后的芽苗難以生根，不適合生產(chǎn)上短周期以減少成本的應(yīng)用。如何將玻璃化苗進(jìn)行短期內(nèi)逆轉(zhuǎn)后可成為用于生根的有效芽苗有待進(jìn)一步研究。