頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油

張 瑩， 婁方明， 楊建文， 余 蘭*

(1. 遵義醫(yī)科大學藥學院， 遵義 563000； 2. 湖北民族大學武陵山天然藥物研究所， 恩施 445000)

圓葉薄荷 (Mentharotundifolia(L.) Huds.)為唇形科薄荷屬植物，又名魚香草、血香菜、山茴香、土薄荷等[1]。圓葉薄荷全草可入藥，味辛甘，性微溫，辛涼解表[2]，常用于治療感冒發(fā)熱、頭痛、咽痛、咳嗽、胃腸脹氣等[3]。圓葉薄荷的藥理學研究表明，其可緩解神經(jīng)緊張，抗痙攣，抑制胃腸平滑肌收縮[4]；促進呼吸道腺體分泌，抗菌和抗炎[5]；鎮(zhèn)痛、清除自由基、抗氧化[6-8]。在貴州，圓葉薄荷也常被用于烹調(diào)佐料，其香味獨特，增強食欲，俗稱魚香草。無論藥用還是食用，決定其藥效和風味價值的主要因素均為其揮發(fā)油的成分組成及含量[9]。

不同氣候、不同產(chǎn)地薄荷屬植物其揮發(fā)油成分存在明顯差異[10-11]。貴州(黔)產(chǎn)圓葉薄荷(魚香草)是當?shù)胤浅Ｖ乃幉氖巢模哂泻芨叩慕?jīng)濟價值，但是其揮發(fā)油成分研究未見報道，未能體現(xiàn)出黔產(chǎn)圓葉薄荷的差異性和特殊性，這非常不利于黔產(chǎn)圓葉薄荷的進一步開發(fā)利用。因此，有必要開展對黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油的成分研究。目前從薄荷屬植物中提取揮發(fā)油的方法包括水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、同時蒸餾萃取法等傳統(tǒng)方法，雖然操作簡單、設(shè)備便宜，但藥材、溶劑用量多，耗時，環(huán)境不友好；也有超臨界CO2萃取技術(shù)[12]、頂空固相微萃取法[13]等現(xiàn)代方法，其優(yōu)點在于萃取時間短、環(huán)保、揮發(fā)油品質(zhì)好、雜質(zhì)少等。尤以頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)在揮發(fā)油分析方面獨樹一幟，因為HS-SPME無需提取劑，藥材用量極少，可直接與其他設(shè)備聯(lián)用，集提取、分離、鑒定為一體，分析迅速且數(shù)據(jù)精確。因此本文采用HS-SPME萃取技術(shù)結(jié)合GC-MS分析鑒定技術(shù)對黔產(chǎn)圓葉薄荷中揮發(fā)油進行了組分分析，以全面獲得黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油組成信息，并建立起一套快速、準確的圓葉薄荷揮發(fā)油分析方法。

1 實驗部分

1.1 材料

黔產(chǎn)圓葉薄荷購自貴州遵義市農(nóng)貿(mào)市場，產(chǎn)地貴州省遵義市，該藥材由遵義醫(yī)科大學楊建文副主任藥師鑒定為Mentharotundifolia(L.) Huds.，中文名為圓葉薄荷。

1.2 主要儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(6890-5973N)、手動固相微萃取儀(SPME-GC，內(nèi)含3種型號萃取纖維頭：100 μm PDMS、7 μm PDMS、PA)，使用前需將萃取頭按說明書要求進行老化)、氣相色譜頂空加熱器(HP-1510)。

1.3 揮發(fā)油的HS-SPME萃取

1.3.1 萃取流程 將圓葉薄荷風干后粉碎成粉末，稱取適量置于容積為5 mL的樣品瓶中，保持樣品瓶上部有一定高度的中空，蓋上含有膠墊的瓶蓋并擰緊。將樣品瓶置于頂空加熱器中，在合適溫度下平衡30 min，以釋放揮發(fā)油。然后將接上手柄的纖維頭插入到樣品瓶中并停留在上部空間，利用手柄推出裸露的萃取頭進行頂空萃取。一段時間后取出萃取頭并快速插入到氣相色譜儀的進樣口中進行解吸附。

1.3.2 萃取條件的優(yōu)化 在萃取過程中，對不同極性的萃取頭、樣品用量、萃取溫度、萃取時間、解吸時間等重要影響參數(shù)進行優(yōu)化，以達到最佳萃取效果。

1.4 揮發(fā)油的GC-MS分析

1.4.1 色譜條件設(shè)定 色譜柱Agilent HP-5MS；樣品汽化室溫度260 ℃；進樣方式采用不分流；分離溫度采用程序升溫，以3 ℃/min的升溫速率從50 ℃升溫至230 ℃，最終溫度保持5 min；流動載氣為高純氦氣，流速1 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件設(shè)定 采用EI電離方式，電子能量為70 eV；離子源與四極桿溫度分別設(shè)定為230、150 ℃；溶劑延遲時間4.2 min；m/z掃描范圍30～500。

1.4.3 積分條件設(shè)定 各組分相對質(zhì)量分數(shù)采用峰面積歸一化法計算，為保證結(jié)果的可靠性排除噪音干擾，設(shè)定可積分的峰面積最小值為13.5，最窄峰寬為0.067；質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索數(shù)據(jù)庫采用Wiley7Nist05、NIST05這2種質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，由計算機自動檢索比對，并給出匹配數(shù)據(jù)和化合物名稱，同時結(jié)合人工解析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 萃取頭選擇 不同極性的萃取頭對不同成分組成的揮發(fā)油萃取效果差異較大，這取決于材質(zhì)本身分子結(jié)構(gòu)以及空隙與揮發(fā)油分子之間的相互作用強弱。對3種不同極性的萃取頭(100 μm PDMS、7 μm PDMS、PA)進行吸附能力的考察，以檢出峰的數(shù)量和總峰面積為雙重衡量指標。當樣品用量(質(zhì)量)為0.2 g，平衡吸附溫度60 ℃，吸附時間為10 min時，100 μm PDMS、7 μm PDMS、PA這3種萃取頭分別檢出83、46、45個峰；總峰面積分別為3.116×108、5.315×107、2.528×108。結(jié)果表明100 μm PDMS萃取頭更能有效地與圓葉薄荷揮發(fā)油相互作用，達到理想的吸附效果，因此選用100 μm PDMS萃取頭。

2.1.2 萃取條件 樣品用量、萃取溫度、萃取時間對色譜總峰面積的影響結(jié)果如圖1所示，通過考察這3種影響因素獲得最佳萃取條件。

(1)樣品用量。萃取頭體積小，容量低，因此樣品用量并非越多越好，但是太少則會萃取不足，導致信號低，成分檢出不完整。以色譜峰總面積為指標，分別對0.1～0.5 g共計5份樣品進行了考察。結(jié)果表明：當萃取頭為100 μm PDMS，平衡及吸附溫度為60 ℃，吸附時間為10 min時，不同樣品用量(由低至高)產(chǎn)生的總峰面積分別為3.020×108、3.022×108、3.188×108、3.381×108、3.382×108，其變化趨勢如圖1A所示。樣品質(zhì)量的增加對總峰面積的增加影響較不明顯，0.4 g與0.5 g的峰面積相差無幾，因此最終確定樣品用量為0.4 g(此后數(shù)據(jù)均由0.4 g樣品獲得)。此時樣品約占瓶內(nèi)容積的一半，不容易接觸萃取頭導致污染。

圖1 總峰面積隨樣品質(zhì)量、萃取溫度、萃取時間的變化Figure 1 The change of total peak area with the sample dosage, extraction temperature, and extraction time

(2)萃取溫度。揮發(fā)油只有超過一定溫度才能形成氣體從藥材中溢出，溫度越高溢出量越大，但存在最高閾值。同時，萃取頭也具有最佳的萃取溫度，在該溫度下吸附量最大。以色譜總峰面積為指標，設(shè)定吸附時間10 min，選定50、60、70、80、90、100、110 ℃進行測定，總峰面積隨萃取溫度的變化見圖1B。結(jié)果表明：當溫度為90 ℃時，峰面積達到峰值(1.756×109)。因此，后續(xù)實驗將平衡及吸附溫度由60 ℃修正為90 ℃。

(3)萃取時間。萃取頭萃取揮發(fā)油會有一個時間過程，在一定時間內(nèi)，萃取頭會達到動態(tài)吸附平衡(吸附量=解吸量)，此時吸附量最大，體系處于飽和狀態(tài)，繼續(xù)延長吸附時間已無實際意義，甚至有可能因長時間加熱導致吸附量減少。以色譜峰總面積為指標，設(shè)定5、10、15、20、25 min 為考察萃取時間，其總峰面積隨萃取時間的變化趨勢如圖1C所示。結(jié)果表明：當樣品用量為0.4 g，平衡吸附溫度為90 ℃時，揮發(fā)油在10 min后即達到吸附飽和，此時總峰面積為1.759×109，此后總峰面積開始下降。因此后續(xù)實驗選擇10 min作為吸附時間。

2.1.3 解吸時間 解吸時間不宜過長，一般在幾分鐘以內(nèi)，長時間解吸意味著進樣時間長，色譜峰會變寬，分離度變差；但過短也會導致解吸不完全，信號低，還將影響下一次的吸附量，導致重現(xiàn)性差。本實驗考察1、2、3 min的解吸分析結(jié)果后確定解吸時間為2 min，解吸溫度為色譜儀樣品汽化室溫度。在采用HS-SPME萃取黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油時，將關(guān)鍵影響因素設(shè)定為：萃取頭 100 μm PDMS；樣品質(zhì)量為0.4 g；平衡和萃取溫度90 ℃，萃取時間10 min；解吸時間2 min。在該條件下HS-SPME萃取率最佳。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

圓葉薄荷的風味主要取決于其揮發(fā)油的組成特征，包括成分的種類及其相對質(zhì)量分數(shù)，在經(jīng)HS-SPME萃取影響因素優(yōu)化后，對黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油進行了HS-SPME-GC-MS的萃取與分離檢測，得到如圖2所示的揮發(fā)油總離子流圖，該圖反映了圓葉薄荷揮發(fā)油中所有可能的各類物質(zhì)及其相對質(zhì)量分數(shù)，但是有些極微量成分由于儀器的局限性可能得不到鑒定。

圖2 黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油總離子流圖Figure 2 Total ion current chromatogram of essential oil from Mentha rotundifolia(L.) Huds. growing in Guizhou

在本實驗中，當設(shè)定可積分的峰面積最小值為13.5，最窄峰寬為0.067時，黔產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油總離子流圖可積分的色譜峰為113個，其總峰面積為1.793×109，該數(shù)據(jù)表明黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油具有豐富的化學成分，這是黔產(chǎn)圓葉薄荷具有特殊風味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在對化合物鑒定的過程中，首先對每一個峰所測得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Wiley7Nist05、NIST05)進行檢索比對，進行初步的判斷，再并結(jié)合人工解析給出最終的結(jié)果。在對113個色譜峰的分析中，共有38個成分得到鑒定(表1)，其相對質(zhì)量分數(shù)之和(以峰面積計)達到98.55%，該數(shù)據(jù)表明絕大多數(shù)高含量的成分得到確認，而含量極低的物質(zhì)(雖然種類較多，但總峰和僅占1.45%)無法鑒定。

表1 黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油的HS-SPME-GC-MS 分析結(jié)果Table 1 The analysis of Mentha rotundifolia (L.) Huds. growing in Guizhou by HS-SPME-GC-MS

續(xù)表1

2.3 重現(xiàn)性實驗

按優(yōu)化后的最佳方案對圓葉薄荷進行萃取、進樣分析，重復6次，以揮發(fā)油的總峰面積為指標考察該方法的重現(xiàn)性。6次測定的總峰面積分別為：1.793×109、1.748×109、1.810×109、1.722×109、 1.774×109、1.735×109，經(jīng)計算所得相對標準差RSD為1.95%，符合測定要求，且表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性。

2.4 不同產(chǎn)地及品種薄荷揮發(fā)油的成分比較

除黔產(chǎn)圓葉薄荷外，有報道的薄荷揮發(fā)油成分研究地區(qū)包括河南[14]、云南[15]、上海[16]、重慶[17]等地，品種也不盡相同。為了研究產(chǎn)地及品種對薄荷揮發(fā)油組成的影響，對不同產(chǎn)地和不同品種薄荷所含主要的2種揮發(fā)油相對質(zhì)量分數(shù)進行對比。由圖3可知，無論是成分還是相對質(zhì)量分數(shù)，不同產(chǎn)地及品種的薄荷所含2種主要成分差異均比較大。即使是相同品種的圓葉薄荷，重慶產(chǎn)與貴州產(chǎn)圓葉薄荷的揮發(fā)油成分差異也較大。重慶產(chǎn)圓葉薄荷與貴州產(chǎn)的相比，揮發(fā)油的主要成分均為香芹酮，表明同屬種的相似性，但第二大成分不同，顯示了地域的差異性。

圖3 不同產(chǎn)地薄荷中2種主要成分的質(zhì)量分數(shù)Figure 3 The relative mass fractions of two main components of Mentha rotundifolia (L.) Huds. from different regions

3 結(jié)論

黔產(chǎn)圓葉薄荷揮發(fā)油經(jīng)頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)至少含有113種成分，其中有38種成分得到確證，相對質(zhì)量分數(shù)之和占所有成分的98.55%，表明絕大多數(shù)高含量成分得到確認。在揮發(fā)油成分組成中，以酯、醇及萜類化合物為主，其中右旋香芹酮的相對質(zhì)量分數(shù)為51.78%，是圓葉薄荷揮發(fā)油的重要成分，也是一種重要的香精香料；右旋檸檬烯的相對質(zhì)量分數(shù)為20.93%，是第二大成分，檸檬烯不但具有令人愉快的檸檬樣香氣，目前在臨床上還被用于溶解膽結(jié)石和預防腫瘤[18]，同時具有很強的抑菌作用[19-20]。其他相對質(zhì)量分數(shù)較高的成分有月桂烯(2.91%)、β-蒎烯(2.02%)、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己醇(2.78%)、β-波旁老鸛草烯(2.61%)、石竹烯(2.32%)、大根香葉烯D(2.28%)等。實驗結(jié)果表明：采用HS-SPME-GC-MS分析圓葉薄荷揮發(fā)油的方法時間短、樣品用量小、無需萃取溶劑，圓葉薄荷揮發(fā)油的主要成分得到全面展示，因此該方法可作為圓葉薄荷的揮發(fā)油成分分析的推薦方法。