銀黃口服液制備過程中綠原酸含量穩(wěn)定性考察*

馮 倩，張洪亮，莊華青，沈慶國，孫 艷，關(guān)永霞Δ，張貴民

（1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂276006；2.中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 臨沂 276006）

銀黃口服液是以金銀花和黃芩提取物為原料制成 的中藥口服制劑，可用于治療風(fēng)熱感冒所致咽干、咽痛、上呼吸道感染等證［1?3］，主要成分為黃酮類、揮發(fā)油、三萜皂苷類、無機(jī)元素、有機(jī)元素［4?5］。綠原酸為金銀花提取物中最重要的有效成分，具有抗菌消炎作用，是銀黃口服液質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分［6］。綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸組成的酯類化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽和雙鍵、多元酚羥基等不穩(wěn)定化學(xué)鍵［7］，具有清熱解毒作用，能有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長增殖［8?9］。在銀黃口服液的制備過程中，綠原酸往往會發(fā)生水解和異構(gòu)化，導(dǎo)致含量顯著下降。本研究中以2015年版《中國藥典（一部）》中銀黃口服液制備工藝為基礎(chǔ)，優(yōu)選了銀黃口服液的制備工藝，并考察了制備過程中綠原酸含量的穩(wěn)定性，以提高其綠原酸的含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SENCOR501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順生物科技有限公司）；Himac CR?GⅢ型系列高速離心機(jī)（天美科學(xué)儀器有限公司）；ME1002型電子天平（瑞士梅特勒?托利多有限公司，精度為十萬分之一）；DRHH?S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實(shí)驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

金銀花（魯南厚普制藥有限公司，批號為20180602），經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李寶國副教授鑒定為忍冬科植物殺青干燥的花蕾；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111720?201708，純度為98.7%）；新綠原酸對照品（批號為MUST?17100201，純度為98.4%），隱綠原酸對照品（批號為MUST?18110603，純度為98.6%），均購于成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Zorbax SB?C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈?0.4%磷酸溶液（10∶90，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：327 nm；進(jìn)樣量：5μL。

2.1.2 溶液制備［10］

取綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸對照品各1.50 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲溶解并定容，得質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL的混合對照品溶液。

取黃芩提取物［按2015年版《中國藥典（一部）》工藝制備］，加水適量使溶解，用8% NaOH溶液調(diào)pH至8.0，濾過，濾液與金銀花提取物［按2015年版《中國藥典（一部）》工藝制備］合并，用8% NaOH溶液調(diào)pH至7.2，煮沸60 min，濾過，加單糖漿適量，加入適量飲用水，混勻，用8%NaOH溶液調(diào)pH至7.2，加水至1 000 mL，濾過，灌封得100支。經(jīng)100℃蒸汽滅菌30 min，即得樣品（自擬批號為190725?2）。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密移取2.1.2項下混合對照品溶液1.0，2.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，混勻；吸取2.1.2項下樣品溶液5 mL，加水定容至100 mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過。精密吸取上述溶液各5μL，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，樣品溶液色譜圖中，有與混合對照品溶液對應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。色譜圖見圖1。

1.新綠原酸2.綠原酸3.隱綠原酸A.混合對照品溶液B.樣品溶液圖1專屬性試驗高效液相色譜圖1.Neochlorogenic acid 2.Chlorogenic acid 3.Cryptochlorogenin acidA.Mixed reference solution B.Sample solutionFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

精密度試驗：取同一批（批號為190725?2）樣品，按2.1.1項下色譜條件于第1，2，3天分別測定6次，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸日內(nèi)精密度保留時間的RSD分別為1.78%，1.92%，1.59%（n=6），峰面積的RSD分別為2.21%，1.82%，2.09%（n=6）；日間精密度保留時間的RSD分別為1.43%，1.84%，2.34%（n=6），峰面積的RSD分別為1.98%，2.56%，2.13%（n=6）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為190725?2）樣品，分別于4，8，12，16，20 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸保留時間的RSD分別為1.39%，2.43%，2.89%（n=5），峰面積的RSD分別為1.90%，2.18%，2.71%（n=5），表明樣品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為190725?2）樣品，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸保留時間的RSD分別為2.89%，2.56%，2.19%（n=6），峰面積的RSD分別為2.32%，2.43%，2.71%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2 銀黃口服液制備過程中綠原酸穩(wěn)定性研究

2.2.1 金銀花提取物制備中綠原酸含量變化

取金銀花藥材40.0 kg，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定其綠原酸含量為3.0 %，均分為4批（分別編號為01，02，03，04），每批藥材分別用10倍量和8倍量15%乙醇回流提取2次，合并提取液；減壓濃縮至相對密度為1.16的濃縮液；用95%乙醇調(diào)節(jié)醇度至65%，靜置24 h后用濾紙濾過，得醇沉液；加水至7.5 kg，得供配液。分別吸取上述提取液、濃縮液、醇沉液和供配液，按2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣測定綠原酸的含量。詳見圖2。

圖2 不同溶液綠原酸質(zhì)量Fig.2 Quality of chlorogenic acid in different solutions

在金銀花提取物制備過程中，綠原酸平均提取率為73.91%，濃縮液平均轉(zhuǎn)移率為67.83%，綠原酸在提取和濃縮過程中較穩(wěn)定。醇沉液中綠原酸的總量為藥材的48.03%，與濃縮液相比，綠原酸損失率為29.20%，主要原因為沉淀中吸附大量綠原酸。供配液（編號為01）的綠原酸總含量高于醇沉液，可能原因為綠原酸向異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化具有可逆性。

2.2.2 不同pH條件下煮藥對綠原酸含量的影響

取黃芩提取物1.2 kg，按2015年版《中國藥典（一部）》工藝，加水溶解，用8%NaOH溶液調(diào)pH至8.0，濾過，濾液備用；取樣品（編號為01）適量，依法制備金銀花提取物供配液5 kg，與上述濾液混合，均分為5份，分別用8% NaOH溶液調(diào)pH至5.6，6.0，6.5，7.0，7.2，煮沸1 h，分別測定其在調(diào)節(jié)pH前和煮藥后的綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸含量變化。詳見圖3?？梢姡G原酸和總綠原酸的含量隨pH升高而降低，新綠原酸和隱綠原酸的含量隨pH升高而升高，表明pH升高，有利于綠原酸轉(zhuǎn)化為新綠原酸和隱綠原酸，且綠原酸的水解程度加大。調(diào)節(jié)pH至5.6時，黃芩提取物部分析出，黃芩苷穩(wěn)定性好，pH對黃芩苷的含量影響較小，故煮藥前調(diào)節(jié)藥液pH至6.0。

圖3 不同pH條件下煮藥對綠原酸含量的影響Fig.3 Effect of decocting medicinal herbs at different pH on the chlorogenic acid content

2.2.3 不同煎煮時間對綠原酸含量的影響

取黃芩提取物1.8 kg，加水溶解，用8%NaOH溶液調(diào)pH至8.0，濾過，濾液備用；取樣品（編號為02），依法制備金銀花提取物供配液7.5 kg，與上述濾液混合，用8%NaOH溶液調(diào)pH至6.0，均分為5批，每批3份，分別煎煮30，45，60，75，90 min，測定綠原酸含量，并計算平均轉(zhuǎn)移率。詳見圖4?？梢?，煮藥時間為30 min和60 min時的綠原酸平均轉(zhuǎn)移率相差3.98%，煮藥時間為60 min和90 min時的綠原酸轉(zhuǎn)移率相差1.87%，表明綠原酸轉(zhuǎn)移率隨著煎煮時間的延長而降低，即水解和異構(gòu)化的速率降低，故煎煮時間確定為30 min。

圖4 不同煎煮時間的綠原酸轉(zhuǎn)移率變化Fig.4 Changes of chlorogenic acid content at different decoction time

2.2.4 不同滅菌方式對綠原酸含量的影響

取黃芩提取物1.8 kg，加水溶解，用8%NaOH溶液調(diào)pH至8.0，濾過，濾液備用；取樣品（編號為03），依法制備金銀花提取物供配液，與上述濾液混合，用8%NaOH溶液調(diào)pH至6.0，煎煮30 min，濾過，加單糖漿適量，加飲用水適量，攪勻，用8%NaOH溶液調(diào)pH至7.2，補(bǔ)水至6 000 mL，濾過，灌封得600支樣品，均分為8份，采用0.1%苯甲酸鈉+0.1%苯甲酸、80℃水浴60 min、100℃水浴30 min、100℃蒸汽30 min進(jìn)行滅菌。滅菌后自然冷卻，分別測定其綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸的含量。詳見圖5。可見，0.1%苯甲酸鈉+0.1%苯甲酸滅菌后，綠原酸和新綠原酸平均轉(zhuǎn)移率分別為96.23%和102.12%；100℃蒸汽滅菌30 min，綠原酸和新綠原酸平均轉(zhuǎn)移率分別為85.21%和112.01%。結(jié)果表明，滅菌條件越劇烈，綠原酸轉(zhuǎn)移率越低，新綠原酸轉(zhuǎn)移率越高；不同滅菌方式下，總綠原酸和隱綠原酸轉(zhuǎn)移率變化均較小，提示滅菌過程中綠原酸水解程度較輕，滅菌過程中綠原酸損失的主要原因為其異構(gòu)化為新綠原酸。

a.0.1%苯甲酸鈉+0.1%苯甲酸b.80℃水浴60 min c.100℃水浴30 min d.100℃蒸汽30 min圖5不同滅菌方式對綠原酸轉(zhuǎn)移率的影響a.0.1% Sodium benzoate+0.1% Benzoic acid B.80℃Water bath for 60 min C.100℃Water bath for 30 min D.100℃Steam for 30 minFig.5 Effect of different sterilization methods on the transfer rate of chlorogenic acid

2.3 穩(wěn)定性試驗

取2.2.4項下滅菌后的樣品，于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%環(huán)境下進(jìn)行6個月加速試驗，驗證滅菌后樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1?？梢姡?jīng)0.1%苯甲酸鈉+0.1%苯甲酸滅菌的樣品在6個月加速試驗后，其需氧菌總數(shù)超標(biāo)；其他3種滅菌方式的需氧菌總數(shù)，霉菌、酵母菌總數(shù)，大腸埃希菌含量均符合檢驗標(biāo)準(zhǔn)。由圖5可知，與其他2種滅菌方式相比，采用80℃水浴60 min方案滅菌，綠原酸轉(zhuǎn)移率較高，水解和異構(gòu)化程度均較輕，且滅菌后微生物限度檢驗合格，可更好保證滅菌后的藥效。

表1 加速試驗后不同滅菌方式微生物限度檢查結(jié)果Tab.1 Microbial limit test results of different sterilization methods after the accelerated test

2.4 法定工藝與優(yōu)化工藝綠原酸總轉(zhuǎn)移率測定

取黃芩提取物1.8 kg，加水溶解，用8%NaOH溶液調(diào)pH至8.0，濾過，濾液備用；取樣品（編號為04），依法制備金銀花提取物供配液，與上述濾液混合，均分為法定工藝組和優(yōu)化工藝組。優(yōu)化工藝組采用優(yōu)化工藝制備，均分為3份，每份分別用8% NaOH溶液調(diào)pH至6.0，煮沸30 min，濾過，加單糖漿適量，加飲用水適量，攪勻，用8% NaOH溶液調(diào)pH至7.2，補(bǔ)水至1 000 mL，濾過，灌封得100支樣品，80℃水浴60 min滅菌；法定工藝組采用2015年版《中國藥典（一部）》工藝制備，均分為3份，每份分別用8% NaOH溶液調(diào)pH至7.2，煮沸60 min，濾過，加單糖漿適量，加飲用水適量，攪勻，用8% NaOH溶液調(diào)pH至7.2，補(bǔ)水至1 000 mL，濾過，灌封得100支樣品，100℃蒸汽滅菌30 min。分別測定每份藥液調(diào)pH前和滅菌后的綠原酸含量。采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。詳見圖6?？梢姡c法定工藝組比較，優(yōu)化工藝組總轉(zhuǎn)移率提高了24.95%，差異顯著（P<0.05），表明優(yōu)化工藝能有效抑制綠原酸的水解和異構(gòu)化，提高銀黃口服液中綠原酸的含量。

圖6 法定工藝與優(yōu)化工藝條件下的綠原酸轉(zhuǎn)移率（n=3）Fig.6 The transfer rate of chlorogenic acid under the statutory process and optimal process conditions（n=3）

3 討論

在3批金銀花提取物制備過程中，供配液（樣品編號為01）的綠原酸總含量略高于醇沉液，可能原因為部分新綠原酸和隱綠原酸逆轉(zhuǎn)化為綠原酸。在煎煮和滅菌階段，由于pH和溫度升高，綠原酸除部分水解外，主要被氧化為還原性較弱的新綠原酸和隱綠原酸。與煎煮和滅菌前相比，綠原酸和總綠原酸轉(zhuǎn)移率均減少，新綠原酸和隱綠原酸轉(zhuǎn)移率均升高。故在銀黃口服液制備過程中，適當(dāng)調(diào)低藥液pH，減少煎煮時間，可有效減少綠原酸的氧化；而適量加入抗壞血酸、酒石酸、L?半胱氨酸等還原性藥品添加劑，以抑制綠原酸氧化和水解，提高綠原酸含量的可行性有待進(jìn)一步研究。

綠原酸具有廣譜抑菌效果，能有效抑制細(xì)菌及部分真菌的生長繁殖，其抑菌活性明顯優(yōu)于新綠原酸和隱綠原酸［11?12］。在樣品制備過程中，綠原酸損失的主要原因為異構(gòu)化，次要原因為在堿性環(huán)境下易水解。由圖3至圖5可知，在弱酸條件下，綠原酸的異構(gòu)化反應(yīng)程度較??；減少煎煮時間、采用溫和且有效的滅菌方式，可抑制綠原酸的異構(gòu)化反應(yīng)。本研究中通過優(yōu)化制備工藝，在抑制綠原酸異構(gòu)化的同時也有效抑制了其水解，與法定工藝相比，綠原酸總轉(zhuǎn)移率提高24.95%，有利于提高銀黃口服液抗菌、消炎的功效。